CN105693515B - 一种单胺氧化酶抑制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单胺氧化酶抑制剂的制备方法。该制备方法包括下述步骤：(1)用乙醇沉淀乳杆菌(Lactobacillus)的发酵液，取上清液；(2)在上清液中加入水和乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯相提取液蒸发除去溶剂得到酯相提取物；(3)将步骤(2)的酯相提取物进行柱层析正相洗脱，即可。本发明的制备方法得到的单胺氧化酶抑制剂来源于天然产物，从乳杆菌发酵产物中分离纯化并制备得到，其毒性低、安全性高，有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及食品、药物和保健品领域，尤其涉及一种单胺氧化酶抑制剂的制备方法。
背景技术
人口老化是21世纪人类面临的一个主要难题。与衰老有关的疾病，比如阿尔茨海默症(老年痴呆症)、帕金森氏综合症等，已逐渐成为人类健康的大敌和社会繁荣的沉重负担，有效的药物治疗对于缓解疾病至关重要。这类疾病其根源多与人体内的单胺氧化酶活性异常升高有关，因此寻找或合成具有靶向抑制单胺氧化酶活性的物质成为研发此类疾病药物的重要方向之一。
单胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO，EC 1.4.3.4)，全名为单胺氧化还原酶，是一种黄素蛋白酶，主要位于神经元细胞、胶质细胞的线粒体外膜上，多分布于脊椎动物的肝和脑中。它在大脑和周围神经组织中催化一些生物体产生的胺，氧化脱氨产生过氧化氢。根据底物选择性和对抑制剂的灵敏度，单胺氧化酶被分为A和B两种亚型，分别由不同的基因编码，具有70％的氨基酸序列同源性，有着不同的底物特异性和三维结构。MAO-A的底物多为极性芳香胺，如对5-羟色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)、去甲肾上腺素(norepinephrine)、多巴胺(dopamine)和抑制剂氯吉兰(clorgyline)具有高亲和性；而MAO-B则对非极性芳香胺，如苯乙胺(phenethylamine，PEA)、苄胺(benzylamine)和抑制剂丙炔苯丙胺(selegiline)具有高亲和性。脑内多巴胺的分解代谢主要依靠MAO-B，而MAO-A仅占作用的20％。MAO-B可将多巴胺分解为3,4-二羟基苯乙酸和高香草酸，同时产生小分子H2O2，对神经细胞产生毒性作用；也可使刺激多巴胺分泌、抑制多巴胺再摄取的β-苯乙胺脱氨基失去活性；还能将1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢嘧啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)分解为具有神经毒性的1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion，MPP+)。因此，抑制MAO-B的活性可减少多巴胺的降解和再摄取，提高脑内多巴胺浓度，并通过降低H2O2、MPP+等神经毒素水平延缓黑质细胞的死亡过程。由于MAO-B抑制剂不仅能改善帕金森病症状，而且还能起神经保护作用，因此是目前抗帕金森病药物研发的热点。MAO-A主要分布在外周胃肠道、肝脏、肾脏、肺；在脑内主要分布在肾上腺素能神经元内。MAO-A的一个重要作用就是平衡大脑中5-羟色胺的分泌。MAO-A的高低直接影响个体的情绪水平，进而对其行为产生影响。目前，MAO-A基因与暴力攻击行为的关联性也是研究的一个热点。而MAO-A抑制剂可在一定程度上对个体的暴力情绪水平产生一定的影响。
临床上应用MAO抑制剂来治疗某些神经系统疾病，已报道的MAO抑制剂种类有限，如异喹啉类和四氢异喹啉、4-哌啶、恶二唑，以及来源于植物或真菌的天然化合物，如氧二苯甲酮、香豆素、二苯并呋喃、黄酮、吖啶酮。近来还有研究证明了从黄连粳稻中获得的原小檗碱类异喹啉生物碱如黄连素、巴马汀和黄连等均有MAO抑制作用。其中黄连显示出对鼠脑部的MAO活性具有强烈的抑制效果。合成的不可逆抑制剂用于临床常具有较强的副作用，如肼类[Ph-(R)-HN-NH-]可能导致肝脏毒性，苯丙胺可能会引发心血管疾病。因此，开发更多种类的安全、高效和低毒副作用的MAO抑制剂在治疗和缓解神经退行性疾病和抑郁症等疾病中具有重要的意义。
其中已报道的天然来源的MAO抑制剂主要有吲哚类(如Pimprinine)、单胺类(如反式肉桂酰胺，苯乙胺)、黄酮类(如(S)-Naringenin)、β-咔啉类(如norharman，harman)等，主要来源于植物(如洋甘菊、当归、水薄荷、烟草烟雾、咖啡、葡萄干)、真菌(如蘑菇)、微生物(如放线菌中的链霉菌属)等，另外有从动物组织鹿茸中提取到雌二醇、尿嘧啶、次黄嘌呤、对羟基苯甲醛、磷脂质(Phospholipids)等具有抑制MAO作用。
由于目前人工化学合成的单胺氧化酶抑制剂具有较高的毒副作用，其应用受到明显的限制，因此亟需开发出可从天然产物来源的、低毒性的单胺氧化酶抑制剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对目前单胺氧化酶抑制剂种类较少，化学合成制剂毒副作用明显的问题，提供一种单胺氧化酶抑制剂的制备方法。该单胺氧化酶抑制剂可以来源于天然产物，从乳杆菌发酵产物中分离纯化并制备得到，其毒性低、安全性高，有广阔的应用前景。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本发明提供了一种单胺氧化酶抑制剂的制备方法，其包括下述步骤：
(1)用乙醇沉淀乳杆菌(Lactobacillus)的发酵液，取上清液；
(2)在上清液中加入水和乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯相提取液蒸发除去溶剂得到酯相提取物；
(3)将步骤(2)的酯相提取物进行柱层析正相洗脱，即可。
其中，所述的乳杆菌较佳地为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)中的一种或多种。所述的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)一般购于杜邦丹尼斯克(中国)有限公司、科汉森(中国)有限公司或者国际国内菌种保藏中心的标准菌株，如美国典型微生物菌种保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)、中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)等。
其中，所述的乳杆菌的发酵液较佳地通过下述步骤制得：将乳杆菌在液体培养基中发酵即得乳杆菌的发酵液；优选通过下述步骤制得：将-80℃冻存的乳杆菌接种于乳酸细菌培养基(MRS)平板，在37℃厌氧培养24-72h；从该平板上挑取单菌落接种于液体培养基中于30-42℃厌氧培养8-16h(较佳地为12h)获得一级种子液；接着再将该一级种子液以3-5％的接种量接种于液体培养基进行扩大培养即得。类似地还可以逐级扩大培养甚至更多。
所述的液体培养基较佳地为MRS液体培养基或脱脂乳培养基；所述的MRS液体培养基可为用市售MRS按说明书配置，所述的脱脂乳培养基优选为将市售脱脂乳粉与水按10g：90g配成的液体。
其中，步骤(1)中，所述的乳杆菌的发酵液在用乙醇沉淀之前，优选先进行浓缩。所述的浓缩较佳地通过下述步骤进行：将所述的乳杆菌的发酵液于40-65℃、真空度小于0.1MPa(即相对压力<0)条件下浓缩至原发酵液浓度的5-20倍；更佳地通过下述步骤进行：将所述的乳杆菌的发酵液在温度为60℃、相对压力为-0.08MPa的条件下浓缩至原发酵液浓度的10倍。
其中，步骤(1)中所述的乙醇的用量较佳地为使得溶液中乙醇的最终体积浓度为68％～72％为止。
其中，步骤(1)中，所述的沉淀较佳地通过下述步骤进行：加入乙醇，搅拌均匀后于2-6℃静置24-72h(较佳地为48h)使充分沉淀，之后以5000-12000rpm的转速(较佳地为9000rpm)于2-6℃下离心10-30min(较佳地为20min)，去除沉淀，取上清液以去除该发酵液中的菌体和大分子物质。
其中，步骤(2)中，在萃取之前较佳地先进行浓缩。所述的浓缩较佳地通过下述步骤进行：将所述的上清液经40-65℃条件下(较佳地为50℃)旋转蒸发浓缩至体积减少一半。
其中，步骤(2)中，所述的萃取较佳地通过下述步骤进行：加入0.5-2倍体积水稀释均匀后，再加入与水等体积的乙酸乙酯振荡后静置0.5-2h，再将水相用等体积的乙酸乙酯再萃取1-4次，把萃取得到的有机相合并即得到乙酸乙酯相。
其中，步骤(3)中，所述的柱层析正相洗脱优选用洗脱剂按照下述洗脱步骤进行：①(70～95)％A+(5～30)％B→②100％A→③(97～99)％A+(1～3)％C→④(90～97)％A+(3～10)％C→⑤(80～90)％A+(10～20)％C；更优选用洗脱剂按照下述洗脱步骤进行：①80％A+20％B→②100％A→③98％A+2％C→④95％A+5％C→⑤85％A+15％C；所述的A为乙酸乙酯，所述的B为正己烷，所述的C为甲醇；所述的百分比为体积百分比。
其中步骤①的洗脱剂的体积较佳地为(0.5～0.6)个柱体积，所述的柱体积是指柱层析正相洗脱的层析柱除去填料之外的体积。
其中步骤②的洗脱剂的体积较佳地为(0.5～0.6)个柱体积，所述的柱体积是指柱层析正相洗脱的层析柱除去填料之外的体积。
其中步骤③的洗脱剂的体积较佳地为(1～1.1)个柱体积，所述的柱体积是指柱层析正相洗脱的层析柱除去填料之外的体积。
其中步骤④的洗脱剂的体积较佳地为(1～1.1)个柱体积，所述的柱体积是指柱层析正相洗脱的层析柱除去填料之外的体积。
其中步骤⑤的洗脱剂的体积较佳地为(1～1.1)个柱体积，所述的柱体积是指柱层析正相洗脱的层析柱除去填料之外的体积。
所述的柱层析的条件优选如下：层析柱为内径1-3.5cm、长度20-120cm的扩口玻璃层析柱，用200-400目硅胶装柱，乙酸乙酯：正己烷按体积比为(70～95):(30～5)的混合溶剂装柱及平衡，流速1-5mL/min，干法上样，每次上样量0.5-5g，检测波长250-350nm，每1-10min收集1管，除去管中洗脱用的有机溶剂后测定各管对单胺氧化酶的抑制率。
所述的柱层析的条件更优选如下：层析柱选用2.5cm×100cm的扩口玻璃层析柱，先用200-300目硅胶装柱、再用300-400目硅胶装柱，乙酸乙酯：正己烷按体积比80:20的混合溶剂装柱及平衡，流速3mL/min，干法上样，每次上样量3.0g，检测波长280-340nm，每4min收集1管，于35-45℃且真空度<0.1MPa(即相对压力<0)条件下蒸发除去各管中的有机溶剂，用纯水复溶各管样品后测定各管对单胺氧化酶的抑制率。
本发明中，在步骤(3)中的柱层析正相洗脱后，较佳地还进行精制纯化：经制备型高效液相色谱(HPLC)分离纯化即可；其中，高效液相色谱的条件如下：流动相D为水，流动相E为甲醇，以流动相D与流动相E按照下述体积比进行梯度洗脱：0min:(90～98)％D+(2～10)％E→20min:(60～65)％D+(35～40)％E→25min:(35～45)％D+(55～65)％E→30min:(35～45)％D+(55～65)％E→30.5min:(90～98)％D+(2～10)％E→40min:(90～98)％A+(2～10)％B；流速为1～3mL/min。
其中，所述的高效液相色谱的条件优选如下：流动相D为水，流动相E为甲醇，以流动相D与流动相E按照下述体积比进行梯度洗脱：0min:95％D+5％E→20min:62.5％D+37.5％E→25min:40％D+60％E→30min:40％D+60％E→30.5min:95％D+5％E→40min:95％D+5％E；流速为1.8mL/min。
其中，所述的高效液相色谱的色谱柱可采用本领域常规使用的各种色谱柱，较佳地为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，所述的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的参数较佳地为：7.8mm×300mm，粒径5-10μm，孔径
柱温为15-35℃，紫外检测波长为210-340nm；更佳地为7.8mm×300mm，粒径10μm，孔径
柱温为20℃，紫外检测波长为300nm。
本发明中，经过精制纯化后，可得到单胺氧化酶抑制剂活性组分的HPLC级纯品，经高分辨质谱和核磁共振谱进行结构鉴定，该活性组分物质为乳酰乳酸，化学命名为Propanoic acid,2-hydroxy-1-carboxyethyl ester，(2-羟基丙酸-1-羰乙酯，或乳酰乳酸)，其结构如下式所示：
本发明还提供了乳酰乳酸在制备单胺氧化酶抑制剂中的用途。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明从乳杆菌中分离纯化并制备的单胺氧化酶抑制剂与化学合成制剂相比具有较好的安全性；
(2)天然来源的单胺氧化酶抑制剂多数来自植物，少数来自真菌和放线菌，分离自乳杆菌代谢产物的非常少，本发明的单胺氧化酶抑制剂的制备来源是乳杆菌，通过微生物发酵过程获得，拓展了该类抑制剂的天然产物来源；
(3)该抑制剂对MAO-A的抑制作用强于对MAO-B，有望用于神经衰退类疾病尤其抑郁症药物和膳食补充剂的研制开发；
(4)本发明建立的从乳杆菌中分离纯化单胺氧化酶抑制剂的方法于实验室和工厂均简单易行，易于推广应用。
附图说明
图1为硅胶柱层析各管组分的紫外信号图(280nm)和对单胺氧化酶的抑制率曲线，虚框内为代表性活性组分同时具有特征紫外吸收。
图2为代表性活性组分44-50#管样品的分析级HPLC图谱，虚框内显示活性组分的最大紫外吸收为300nm。
图3为代表性活性组分44-50#管样品的半制备级HPLC图谱，虚框所示该活性组分得到了HPLC级的纯化。
图4为活性组分HPLC级纯品的高分辨质谱图(负离子模式，喷雾电压2.7kV，毛细管温度250℃，针泵流速3μL/min)。
图5(A)为该活性组分HPLC级纯品的核磁共振图谱的碳谱图。
图5(B)为该活性组分HPLC级纯品的核磁共振图谱的氢谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明的实施例采用的试验条件如下：
检测仪器：Agilent 1260高效液相色谱系统，G1329B 100孔自动进样装置，Agilent G1315D二极管阵列检测器；
色谱柱：美国安捷伦公司的XDB C18(100×4.6mm，3.5μm，孔径
)液相色谱柱，美国沃特世公司的C18(300×7.8mm，10μm，孔径
)液相色谱柱；
柱温：20℃；
流动相：流动相A为纯水，流动相B为纯甲醇；
检测波长：300nm；
进样量：分析5-50μL，半制备50-100μL。
实施例1从干酪乳杆菌BDII的MRS发酵液中分离纯化制备单胺氧化酶抑制剂
(1)制备干酪乳杆菌BD-II的发酵液：
将-80℃冻存的干酪乳杆菌BD-II(CGMCC No.0849)接种于MRS平板，在37℃厌氧培养48h；从该平板上挑取单菌落接种于10mL的MRS液体培养基中于37℃厌氧培养12h获得BD-II的一级种子液；接着再将该一级种子液以4％的接种量接种于200mL MRS液体培养基进行扩大培养，类似的逐级扩大培养至6L，在BIOTRON LiFlus SP_200L全自动发酵罐中于(35.5±0.5)℃条件按照5％接种量将6L种子液接种于120L MRS培养基中发酵24h，得到126L发酵原液(pH达4.00，菌落数量达109)。
其中MRS配方如下(各组成成分均市售可得)：
| 成分 | 含量 |
| 蛋白胨 | 10g/L |
| 牛肉膏粉 | 10g/L |
| 酵母提取物 | 5g/L |
| K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> | 2g/L |
| 柠檬酸氢二铵 | 2g/L |
| 乙酸钠 | 5g/L |
| 葡萄糖 | 20g/L |
| 吐温-80 | 1mL |
| MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.58g/L |
| MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O | 0.25g/L |
(2)将(1)所得发酵液浓缩：
将(1)中所得发酵液通过Niro ATOMIZER单效降膜浓缩设备在温度为60℃、相对压力为-0.08MPa的条件下浓缩3h，使其浓缩为原发酵液的10倍浓度。
(3)将(2)所得的浓缩液用乙醇沉淀取上清液：
在(2)的浓缩液中加入相当于该浓缩液体积三倍量的95％工业酒精使乙醇终浓度为70％，搅拌均匀后于4℃静置48h使充分沉淀，之后以9000rpm的转速于4℃下离心20min，去除沉淀取上清液以去除该发酵液中的菌体和大分子物质。
(4)将(3)所得上清液浓缩一倍：
将(3)所得上清液经60℃条件旋转蒸发浓缩至体积减少一半后于2-6℃暂存。
(5)将(4)所得高倍浓缩液用乙酸乙酯/水体系进行萃取：
将(4)所得高倍浓缩液中按质量体积比1：1加入纯水稀释均匀后，再加入与纯水等体积的乙酸乙酯充分振荡后静置1h，保留乙酸乙酯相待用，水相同样用等体积的乙酸乙酯再萃取2次，把3次萃取得到的酯相合并，并经50℃条件下旋转蒸发将乙酸乙酯除去且浓缩至体积不再减少，酯提物平均得率为(7.21±0.22)％；
(6)将(5)所得酯相提取物经硅胶柱层析正相洗脱，获得对单胺氧化酶具有较高抑制作用的活性组分的粗品：
将BT-100恒流泵(青浦沪西仪器厂)、层析柱、HD-3紫外检测仪(青浦沪西仪器厂)、MODEL DBS-100电脑全自动部分收集器(青浦沪西仪器厂)搭建起一套粗分装置，层析柱选用2.5cm×100cm的扩口玻璃层析柱，先后用等量的200-300目和300-400目硅胶装柱，乙酸乙酯/正己烷(体积比80:20)装柱及平衡，流速3mL/min，干法上样，每次上样量3.0g，阶段等度洗脱(如下表)，检测波长280nm，每4min收集1管，共收集106管，各管于45℃旋转蒸发去除洗脱用的有机溶剂后用纯水复溶，测定各管对单胺氧化酶的抑制率，其中第44-50管为具有较高单胺氧化酶抑制作用的活性组分，这些管的组分也在280nm具有特征紫外吸收(图1)，实际经HPLC验证，该组分最大紫外吸收在300nm(图2)。
| 洗脱剂 | 洗脱剂体积比 | 洗脱体积/mL |
| 乙酸乙酯：正己烷 | 80：20 | 150 |
| 乙酸乙酯 | 100 | 150 |
| 乙酸乙酯：甲醇 | 98：2 | 300 |
| 乙酸乙酯：甲醇 | 95：5 | 300 |
| 乙酸乙酯：甲醇 | 85：15 | 300 |
(7)将(6)所得粗品(第44-50管)经制备型高效液相色谱(HPLC)分离纯化得到活性组分的HPLC级纯品：
采用C18半制备柱(7.8mm×300mm，粒径10μm，孔径
)，流速为1.8mL/min，柱温为20℃，紫外检测波长为300nm，收集特征吸收峰对应的组分(如图3虚框所示)，洗脱梯度如下表(百分比是指体积比)：
| 时间/min | H<sub>2</sub>O | CH<sub>3</sub>OH |
| 0 | 95％ | 5％ |
| 20 | 62.5％ | 37.5％ |
| 25 | 40％ | 60％ |
| 30 | 40％ | 60％ |
| 30.5 | 95％ | 5％ |
| 40 | 95％ | 5％ |
(8)活性组分结构鉴定：
将(7)所得纯品经高分辨质谱(图4)测得该分子的精确分子量为162.0518，结合考虑分子量的匹配度、发酵产物原子组成的可行性以及该物质具有较强的酸性，推测分子式为C6H10O5；再结合核磁共振谱(图5该活性组分HPLC级纯品的核磁共振图谱的碳谱图和氢谱图，[13C(125MHz)，溶剂CD3OD；1H(500MHz)，溶剂CD3OD])鉴定其结构为乳酰乳酸，化学命名为Propanoic acid,2-hydroxy-,1-carboxyethyl ester(2-羟基丙酸-1-羰乙酯，或乳酰乳酸)。
经检测，该物质纯度为98.6％，对MAO活性的半数抑制率IC50值为6.58mg/mL。
实施例2从干酪乳杆菌ATCC334的脱脂乳发酵液中分离纯化制备单胺氧化酶抑制剂
(1)制备干酪乳杆菌ATCC334的发酵液：
将-80℃冻存的干酪乳杆菌ATCC334接种于MRS平板，在37℃厌氧培养48h；从该平板上挑取单菌落接种于5mL的脱脂乳中于37℃厌氧培养12h获得ATCC334的一级种子液；接着再将该一级种子液以4％的接种量接种于200mL脱脂乳进行扩大培养，类似的逐级扩大培养至6L，在BIOTRONLiFlus SP_200L全自动发酵罐中于(30.0±0.5)℃条件按照5％接种量将6L种子液接种于120L脱脂乳中发酵48h，得到126L发酵原液(pH达4.53，菌落数量达109)。
(2)将(1)所得发酵液浓缩：
同实施例1中步骤(2)。
(3)将(2)所得的浓缩液用乙醇沉淀取上清液：
同实施例1中步骤(3)。
(4)将(3)所得上清液浓缩一倍：
同实施例1中步骤(4)。
(5)将(4)所得高倍浓缩液用乙酸乙酯/水体系进行萃取：
同实施例1中步骤(5)，酯提物平均得率为(6.98±0.21)％；
(6)将(5)所得酯相提取物经硅胶柱层析正相洗脱，获得对单胺氧化酶具有较高抑制作用的活性组分的粗品：
将BT-100恒流泵(青浦沪西仪器厂)、层析柱、HD-3紫外检测仪(青浦沪西仪器厂)、MODEL DBS-100电脑全自动部分收集器(青浦沪西仪器厂)搭建起一套粗分装置，层析柱选用2.5cm×100cm的扩口玻璃层析柱，先后用等量的200-300目和300-400目硅胶装柱，乙酸乙酯/正己烷(体积比80:20)装柱及平衡，流速3mL/min，干法上样，每次上样量3.0g，阶段等度洗脱[洗脱条件同实施例1中步骤(6)]，检测波长280nm，每4min收集1管，共收集106管，各管于45℃旋转蒸发去除洗脱用的有机溶剂后用纯水复溶，测定各管对单胺氧化酶的抑制率，其中第43-51管为具有较高单胺氧化酶抑制作用的活性组分，这些管的组分也在280nm具有特征紫外吸收，实际经HPLC验证，该组分最大紫外吸收在300nm。
(7)将(6)所得粗品(第43-51管)经制备型高效液相色谱(HPLC)分离纯化得到活性组分的HPLC级纯品：
具体步骤同实施例1的步骤(7)。
(8)活性组分结构鉴定：
将(7)所得纯品经高分辨质谱结合核磁共振谱鉴定其结构也为乳酰乳酸。
实施例3从保加利亚乳杆菌LB340的脱脂乳发酵液中分离纯化制备单胺氧化酶抑制剂
(1)制备保加利亚乳杆菌LB340的发酵液：
将-80℃冻存的保加利亚乳杆菌LB340[杜邦丹尼斯克(中国)有限公司]接种于MRS平板，在37℃厌氧培养48h；从该平板上挑取单菌落接种于10mL的脱脂乳中于37℃厌氧培养12h获得LB340的一级种子液；接着再将该一级种子液以4％的接种量接种于200mL脱脂乳进行扩大培养，类似的逐级扩大培养至6L，在BIOTRON LiFlus SP_200L全自动发酵罐中于(40.0±0.5)℃条件按照5％接种量将6L种子液接种于120L脱脂乳中发酵24h，得到126L发酵原液(pH达3.85，菌落数量达109)。
(2)将(1)所得发酵液浓缩：
同实施例1中步骤(2)。
(3)将(2)所得的浓缩液用乙醇沉淀取上清液：
同实施例1中步骤(3)。
(4)将(3)所得上清液浓缩一倍：
同实施例1中步骤(4)。
(5)将(4)所得高倍浓缩液用乙酸乙酯/水体系进行萃取：
同实施例1中步骤(5)，酯提物平均得率为(7.25±0.23)％；
(6)将(5)所得酯相提取物经硅胶柱层析正相洗脱，获得对单胺氧化酶具有较高抑制作用的活性组分的粗品：
将BT-100恒流泵(青浦沪西仪器厂)、层析柱、HD-3紫外检测仪(青浦沪西仪器厂)、MODEL DBS-100电脑全自动部分收集器(青浦沪西仪器厂)搭建起一套粗分装置，层析柱选用2.5cm×100cm的扩口玻璃层析柱，先后用等量的200-300目和300-400目硅胶装柱，乙酸乙酯/正己烷(体积比80:20)装柱及平衡，流速3mL/min，干法上样，每次上样量3.0g，阶段等度洗脱[洗脱条件同实施例1中步骤(6)]，检测波长280nm，每4min收集1管，共收集106管，各管于45℃旋转蒸发去除洗脱用的有机溶剂后用纯水复溶，测定各管对单胺氧化酶的抑制率，其中第43-51管为具有较高单胺氧化酶抑制作用的活性组分，这些管的组分也在280nm具有特征紫外吸收，实际经HPLC验证，该组分最大紫外吸收在300nm。
(7)将(6)所得粗品(第43-50管)经制备型高效液相色谱(HPLC)分离纯化得到活性组分的HPLC级纯品：
具体步骤同实施例1的步骤(7)。
(8)活性组分结构鉴定：
将(7)所得纯品经高分辨质谱结合核磁共振谱鉴定其结构也为乳酰乳酸。
实施例4从瑞士乳杆菌ATCC 15009的脱脂乳发酵液中分离纯化制备单胺氧化酶抑制剂
(1)制备瑞士乳杆菌ATCC 15009的发酵液：
将-80℃冻存的瑞士乳杆菌ATCC 15009接种于MRS平板，在37℃厌氧培养48h；从该平板上挑取单菌落接种于10mL的脱脂乳中于37℃厌氧培养12h获得一级种子液；接着再将该一级种子液以4％的接种量接种于200mL脱脂乳进行扩大培养，类似的逐级扩大培养至6L，在BIOTRON LiFlusSP_200L全自动发酵罐中于(42.0±0.5)℃条件按照5％接种量将6L种子液接种于120L脱脂乳中发酵24h，得到126L发酵原液(pH达3.78，菌落数量达109)。
(2)将(1)所得发酵液浓缩：
同实施例1中步骤(2)。
(3)将(2)所得的浓缩液用乙醇沉淀取上清液：
同实施例1中步骤(3)。
(4)将(3)所得上清液浓缩一倍：
同实施例1中步骤(4)。
(5)将(4)所得高倍浓缩液用乙酸乙酯/水体系进行萃取：
同实施例1中步骤(5)，酯提物平均得率为(7.33±0.23)％；
(6)将(5)所得酯相提取物经硅胶柱层析正相洗脱，获得对单胺氧化酶具有较高抑制作用的活性组分的粗品：
将BT-100恒流泵(青浦沪西仪器厂)、层析柱、HD-3紫外检测仪(青浦沪西仪器厂)、MODEL DBS-100电脑全自动部分收集器(青浦沪西仪器厂)搭建起一套粗分装置，层析柱选用2.5cm×100cm的扩口玻璃层析柱，先后用等量的200-300目和300-400目硅胶装柱，乙酸乙酯/正己烷(体积比80:20)装柱及平衡，流速3mL/min，干法上样，每次上样量3.0g，阶段等度洗脱[洗脱条件同实施例1中步骤(6)]，检测波长280nm，每4min收集1管，共收集106管，各管于45℃旋转蒸发去除洗脱用的有机溶剂后用纯水复溶，测定各管对单胺氧化酶的抑制率，其中第43-51管为具有较高单胺氧化酶抑制作用的活性组分，这些管的组分也在280nm具有特征紫外吸收，实际经HPLC验证，该组分最大紫外吸收在300nm。
(7)将(6)所得粗品(第44-51管)经制备型高效液相色谱(HPLC)分离纯化得到活性组分的HPLC级纯品：
具体步骤同实施例1的步骤(7)。
(8)活性组分结构鉴定：
将(7)所得纯品经高分辨质谱结合核磁共振谱鉴定其结构也为乳酰乳酸。
实施例5从嗜酸乳杆菌NCFM的脱脂乳发酵液中分离纯化制备单胺氧化酶抑制剂
(1)制备嗜酸乳杆菌NCFM的发酵液：
将-80℃冻存的嗜酸乳杆菌NCFM[杜邦丹尼斯克(中国)有限公司]接种于MRS平板，在37℃厌氧培养48h；从该平板上挑取单菌落接种于10mL的脱脂乳中于37℃厌氧培养12h获得一级种子液；接着再将该一级种子液以4％的接种量接种于200mL脱脂乳进行扩大培养，类似的逐级扩大培养至6L，在BIOTRON LiFlus SP_200L全自动发酵罐中于(35.5±0.5)℃条件按照5％接种量将6L种子液接种于120L脱脂乳中发酵24h，得到126L发酵原液(pH达4.45，菌落数量达109)。
(2)将(1)所得发酵液浓缩：
同实施例1中步骤(2)。
(3)将(2)所得的浓缩液用乙醇沉淀取上清液：
同实施例1中步骤(3)。
(4)将(3)所得上清液浓缩一倍：
同实施例1中步骤(4)。
(5)将(4)所得高倍浓缩液用乙酸乙酯/水体系进行萃取：
同实施例1中步骤(5)，酯提物平均得率为(6.85±0.20)％；
(6)将(5)所得酯相提取物经硅胶柱层析正相洗脱，获得对单胺氧化酶具有较高抑制作用的活性组分的粗品：
将BT-100恒流泵(青浦沪西仪器厂)、层析柱、HD-3紫外检测仪(青浦沪西仪器厂)、MODEL DBS-100电脑全自动部分收集器(青浦沪西仪器厂)搭建起一套粗分装置，层析柱选用2.5cm×100cm的扩口玻璃层析柱，先后用等量的200-300目和300-400目硅胶装柱，乙酸乙酯/正己烷(体积比80:20)装柱及平衡，流速3mL/min，干法上样，每次上样量3.0g，阶段等度洗脱[洗脱条件同实施例1中步骤(6)]，检测波长280nm，每4min收集1管，共收集106管，各管于45℃旋转蒸发去除洗脱用的有机溶剂后用纯水复溶，测定各管对单胺氧化酶的抑制率，其中第43-51管为具有较高单胺氧化酶抑制作用的活性组分，这些管的组分也在280nm具有特征紫外吸收，实际经HPLC验证，该组分最大紫外吸收在300nm。
(7)将(6)所得粗品(第43-50管)经制备型高效液相色谱(HPLC)分离纯化得到活性组分的HPLC级纯品：
具体步骤同实施例1的步骤(7)。
(8)活性组分结构鉴定：
将(7)所得纯品经高分辨质谱结合核磁共振谱鉴定其结构也为乳酰乳酸。
实施例6乳酰乳酸对单胺氧化酶的抑制作用
(1)MAO溶液的制备：
首先将雄性老年(一岁龄以上)的SD大鼠(中科院上海实验动物中心)断髓致死，在无菌条件下操作取出肝脏，放入冰水浴中预冷的磷酸钾缓冲液(0.2mo1/L、pH7.4)中洗涤，去掉结缔组织后剪碎。将剪碎的肝组织(86.61g)置于700mL、0.25mo1/L的蔗糖溶液中匀浆，在整个过程中温度控制应在0-4℃范围中。将此匀浆于4℃经1000×g离心l0min，保留上清液，再将上清液于4℃经10000×g离心30min，弃去上清液和中间粉色的部分沉淀层，保留最下层结实的沉淀层。
再将沉淀重悬于210mL、1.2mo1/L的蔗糖溶液中，充分混匀后于4℃经53000×g离心2h，弃去上清液得到的下层沉淀为纯度较高的肝脏线粒体，此时MAO紧密结合在线粒体外膜上。将此沉淀先后用1.15％的KCl(质量体积比)溶液和0.02mol/L、pH7.4的磷酸钾缓冲液各洗涤一次，均于4℃经53000×g离心30min取沉淀，最终将沉淀悬浮在40mL、0.2mol/LpH7.4的磷酸钾缓冲液中，按照1mL/管进行分装，-85℃储存备用。上述样品为单胺氧化酶溶液，即MAO溶液。
(2)MAO-A溶液和MAO-B溶液的制备：
分别将50μmol/L、selegiline(司来吉兰，美国Sigma公司)和50μmol/L、clorgyline(氯吉兰，美国Sigma公司)分别以1:100的体积比加到上述所得MAO溶液中，使抑制剂终浓度为500nmol/L，37℃水浴1h，分别抑制酶液中MAO-B和MAO-A的活性，从而分别得到了MAO-A溶液和MAO-B溶液。
(3)乳酰乳酸对单胺氧化酶的抑制作用测定
乳酰乳酸溶液配制：配制不同浓度梯度的乳酰乳酸溶液，其浓度为0.1mg/mL～10mg/mL。
底物配制：配制lmmol/L的Kynuramine(犬尿胺，美国Sigma公司)。
①乳酰乳酸对单胺氧化酶(MAO)抑制反应
在96孔酶标板中分别加入138μL磷酸钾缓冲液(0.2mol/L、pH7.4)，2μL供试样品(上述乳酰乳酸溶液)，20μL、MAO溶液和40μL、lmmol/L的底物(上述犬尿胺溶液)，混匀30s。在360nm波长下，分别测定开始时混合液的吸光值(A1)，37℃保温1h再测其吸光值(A2)；空白对照的吸光值(ΔA0)是以2μL的磷酸钾缓冲液代替待测样品。按下述公式计算对MAO的抑制作用：
MAO相对抑制率(％)＝1-[(A1-A2)/ΔA0]×100％
测定结果为：乳酰乳酸在终浓度为0.25mg/mL时，即具有显著的体外MAO抑制活性，其抑制率随着乳酰乳酸的浓度增加而增加。乳酰乳酸终浓度为0.25mg/mL至0.80mg/mL时，其对MAO的抑制率为33.13％至91.43％，其半数抑制率IC50为2.70mmol/L。
②乳酰乳酸对单胺氧化酶-A(MAO-A)抑制反应
在96孔酶标板中分别加入148μL磷酸钾缓冲液(0.2mol/L、pH7.4)，2μL供试样品(上述乳酰乳酸溶液)，20μL MAO-A溶液和30μL lmmol/L的底物(上述犬尿胺溶液)，混匀30s。在360nm波长下，分别测定开始时混合液的吸光值(A1)，37℃保温1h再测其吸光值(A2)；空白对照的吸光值(ΔA0)是以2μL的磷酸钾缓冲液代替待测样品。按下述公式计算对MAO-A的抑制作用：
MAO-A相对抑制率(％)＝1-[(A1-A2)/ΔA0]×100％。
测定结果为：乳酰乳酸在浓度为0.25mg/mL时，即具有显著的体外MAO-A抑制活性，乳酰乳酸浓度为0.25mg/mL至0.80mg/mL时，其对MAO-A的抑制率为32.50％至98.97％，其IC50为2.34mmol/L。
③乳酰乳酸对单胺氧化酶-B(MAO-B)抑制反应
在96孔酶标板中分别加入148μL磷酸钾缓冲液(0.2mol/L pH 7.4)，2μL供试样品(上述乳酰乳酸溶液)，20μL MAO-B溶液和30μL lmmol/L的底物(上述犬尿胺溶液)，混匀30s。在360nm波长下，分别测定开始时混合液的吸光值(A1)，37℃保温1h再测其吸光值(A2)；空白对照的吸光值(ΔA0)是以2μL的磷酸钾缓冲液代替待测样品。按下述公式计算对MAO-B的抑制作用：
MAO-B相对抑制率(％)＝1-[(A1-A2)/ΔA0]×100％。
测定结果为：乳酰乳酸在浓度为0.25mg/mL时，即具有显著的体外MAO-B抑制活性，且抑制浓度随着浓度增加而增加。乳酰乳酸浓度为0.25mg/mL至0.80mg/mL时，其对MAO-B的抑制率为32.26％至89.35％，其IC50为2.72mmol/L。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (17)
1.一种单胺氧化酶抑制剂的制备方法，其包括下述步骤：
(1)用乙醇沉淀乳杆菌(Lactobacillus)的发酵液，取上清液；
(2)在上清液中加入水和乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯相提取液蒸发除去溶剂得到酯相提取物；
(3)将步骤(2)的酯相提取物进行柱层析正相洗脱，即可，其中所述的柱层析正相洗脱用洗脱剂按照下述洗脱步骤进行：①(70～95)％A+(5～30)％B→②100％A→③(97～99)％A+(1～3)％C→④(90～97)％A+(3～10)％C→⑤(80～90)％A+(10～20)％C；所述的A为乙酸乙酯，所述的B为正己烷，所述的C为甲醇；所述的百分比为体积百分比。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的乳杆菌为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的乳杆菌的发酵液通过下述步骤制得：将乳杆菌在液体培养基中发酵即得乳杆菌的发酵液；
和/或，步骤(1)中，所述的乳杆菌的发酵液在用乙醇沉淀之前，先进行浓缩；
和/或，步骤(1)中所述的乙醇的用量为使得溶液中乙醇的最终体积浓度为68％～72％为止；
和/或，步骤(1)中，所述的沉淀通过下述步骤进行：加入乙醇，搅拌均匀后于2-6℃静置24-72h使充分沉淀，然后以5000-12000rpm的转速于2-6℃下离心10-30min。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的乳杆菌的发酵液通过下述步骤制得：将-80℃冻存的乳杆菌接种于乳酸细菌培养基平板，在37℃厌氧培养24-72h；从该平板上挑取单菌落接种于液体培养基中于30-42℃厌氧培养8-16h获得一级种子液；接着再将该一级种子液以3-5％的接种量接种于液体培养基进行扩大培养即得。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的浓缩通过下述步骤进行：将所述的乳杆菌的发酵液于40-65℃、真空度小于0.1MPa条件下浓缩至原发酵液浓度的5-20倍。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述浓缩通过下述步骤进行：将所述的乳杆菌的发酵液在温度为60℃、相对压力为-0.08MPa的条件下浓缩至原发酵液浓度的10倍。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，在萃取之前先进行浓缩；
和/或，步骤(2)中，所述的萃取通过下述步骤进行：加入0.5-2倍体积水稀释均匀后，再加入与水等体积的乙酸乙酯振荡后静置0.5-2h，再将水相用等体积的乙酸乙酯再萃取1-4次。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的浓缩通过下述步骤进行：将所述的上清液经40-65℃条件下旋转蒸发浓缩至体积减少一半。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的柱层析正相洗脱用洗脱剂按照下述洗脱步骤进行：①80％A+20％B→②100％A→③98％A+2％C→④95％A+5％C→⑤85％A+15％C。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，
其中步骤①的洗脱剂的体积为(0.5～0.6)个柱体积，所述的柱体积是指柱层析正相洗脱的层析柱除去填料之外的体积；
其中步骤②的洗脱剂的体积为(0.5～0.6)个柱体积，所述的柱体积是指柱层析正相洗脱的层析柱除去填料之外的体积；
其中步骤③的洗脱剂的体积为(1～1.1)个柱体积，所述的柱体积是指柱层析正相洗脱的层析柱除去填料之外的体积；
其中步骤④的洗脱剂的体积为(1～1.1)个柱体积，所述的柱体积是指柱层析正相洗脱的层析柱除去填料之外的体积；
其中步骤⑤的洗脱剂的体积为(1～1.1)个柱体积，所述的柱体积是指柱层析正相洗脱的层析柱除去填料之外的体积。
11.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的柱层析的条件如下：层析柱为内径1-3.5cm、长度20-120cm的扩口玻璃层析柱，用200-400目硅胶装柱，乙酸乙酯：正己烷按体积比为(70～95):(30～5)的混合溶剂装柱及平衡，流速1-5mL/min，干法上样，每次上样量0.5-5g，检测波长250-350nm。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，
所述的柱层析的条件如下：层析柱选用2.5cm×100cm的扩口玻璃层析柱，先用200-300目硅胶装柱、再用300-400目硅胶装柱，乙酸乙酯：正己烷按体积比80:20的混合溶剂装柱及平衡，流速3mL/min，干法上样，每次上样量3.0g，检测波长280-340nm。
13.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中的柱层析正相洗脱后，还进行精制纯化：经制备型高效液相色谱分离纯化即可；其中，高效液相色谱的条件如下：流动相D为水，流动相E为甲醇，以流动相D与流动相E按照下述体积比进行梯度洗脱：0min:(90～98)％D+(2～10)％E→20min:(60～65)％D+(35～40)％E→25min:(35～45)％D+(55～65)％E→30min:(35～45)％D+(55～65)％E→30.5min:(90～98)％D+(2～10)％E→40min:(90～98)％A+(2～10)％B；流速为1～3mL/min。
14.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的高效液相色谱的条件如下：流动相D为水，流动相E为甲醇，以流动相D与流动相E按照下述体积比进行梯度洗脱：0min:95％D+5％E→20min:62.5％D+37.5％E→25min:40％D+60％E→30min:40％D+60％E→30.5min:95％D+5％E→40min:95％D+5％E；流速为1.8mL/min。
15.如权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述的高效液相色谱的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
16.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的参数为：7.8mm×300mm，粒径5-10μm，孔径
柱温为15-35℃，紫外检测波长为210-340nm。
17.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的参数为7.8mm×300mm，粒径10μm，孔径
柱温为20℃，紫外检测波长为300nm。
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| 干酪乳杆菌JH23代谢产物对单胺氧化酶的抑制作用;何一薇等;《天然产物研究与开发》;20120715;第882-887页 * |
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