CN105688857A - 氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层的制备方法。该方法包括磁性搅拌棒的制备与活化，末端二氨基苯甲羧基修饰的磁性纳米粒的制备及磁场诱导自组装分子印记搅拌棒的制备过程。通过本发明方法制备的外场自组装分子印记搅拌棒对苯二氮卓类化合物具有特异的识别能力，与传统搅拌棒相比聚合步骤减少，吸附量增大，且提供多重作用的分子识别模式，在极性溶剂中吸附效率显著增加。应用于实际样品测定时可提高方法的准确度；反复使用后，涂层无断裂、脱落现象，与色谱联用，可用于保健食品、饲料、生物样品等复杂基质中苯二氮卓类化合物的分离与富集。

Description

氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层的制备方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种磁场诱导自组装氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层的制备方法，制备出的搅拌棒涂层具有自组装快速、专属选择性高、吸附量大和实用性好的特点。
背景技术
在紧张而竞争激烈的社会，睡眠不足或睡眠障碍已经严重影响了现代人的生活。苯二氮卓类药物(BZ)是抗焦虑和失眠领域应用最广泛的药物,具有镇静催眠、抗焦虑、抗惊厥、抗癫痫、中枢性肌松等中枢神经系统抑制的药理作用。不法分子常将BZ非法添加到镇静催眠类中药保健食品中，标榜“纯中药制剂”，欺骗广大消费者而谋取暴利。BZ有致困倦、嗜睡、共济失调等一系列已知的副作用，可见头晕、头痛、兴奋、不安、乏力、言语不清、行为障碍等，长期用药有耐受性和依赖性并且可致体重增加、抑郁状态、性功能异常等。另外中药保健品中其他成分与BZ的药物相互作用可能导致副作用增强从而威胁生命安全。因此，对中药保健品中BZ的测定是很有必要的。
分子印迹搅拌棒吸附萃取技术(MolecularlyImprintedStirBarSorptiveExtraction,MIPs-SBSE)作为一种新型的样品前处理技术，被广泛地应用于选择性分离富集分析物。通过将分子印记聚合物(MolecularlyImprintedpolymers,MIPs)涂覆到SBSE搅拌棒表面作为萃取涂层来改善传统SBSE的萃取性能。MIPs优异的物理化学性能和特异的识别性能非常适合作为SBSE搅拌棒的涂层，适用于非极性到强极性物质的分析，其高度的抗干扰能力能适应各种复杂样品的分析。
分子印迹搅拌棒涂层的厚度决定了吸附量的大小，通常需要聚合多次以达到所需要的涂层厚度，操作繁琐。故简化聚合次数和增大吸附量成为分子印迹搅拌棒的研究热点。另外传统的MIPs一般基于模板分子与功能单体之间的氢键作用来制备，只在非极性溶剂中体现出最佳性能，在极性溶剂氢键不稳定。所以极性溶剂会破坏印记效果和识别能力，而很多分析物在非极性溶剂中溶解度很低，使MIPs-MSB应用受到很大限制，因此迫切需要解决这个问题。
磁性纳米粒子(Magneticnanoparticles，MNPs)具有超顺磁性特点和独特的物理化学性质，近年来在科学界已经获得高度关注。在磁性纳米粒中，Fe3O4NPs作为固相萃取中的新型吸附剂，因其尺寸小，比表面积大，在分析中能获得更好地动力学和更大的吸附容量等优点，受到人们的广泛青睐。功能化修饰的Fe3O4纳米粒可以获得新的性能，例如良好的可控性和丰富的官能团。在Fe3O4NPs表面进行功能化接枝，将其应用于分子印记聚合物的合成，可以提供大量的有效位点。
自组装是制备具有特殊性能的新型材料和设备的最有效的方法之一，被认为是通过热力学和其他约束力的作用将构建模块组织成有序结构的重要过程。这种作用力可以是直接作用力(如颗粒间力量)，也可以是通过模板或者外场(如磁场)的间接作用力。近来，磁场已被认为是定向诱导磁性纳米粒自组装的关键方法。在磁场诱导下，磁性纳米粒可通过偶极相互作用被完全有效地定向自组装，形成可控有序的结构。
将接枝修饰的Fe3O4NPs与分子印记搅拌棒结合，将接枝修饰的Fe3O4NPs与分子印记搅拌棒结合，利用磁性纳米粒表面大量的功能基团与待测物结合，搅拌棒中心的磁性细铁棒具有磁性，通过磁场诱导自组装快速有序吸附磁性纳米粒，增大搅拌棒涂层在极性溶剂中的吸附量，减少搅拌棒聚合次数，具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高，对目标物选择性强，操作简单，具有良好的普适性的氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层的制备方法。利用该氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层分离富集复杂样品中苯二氮卓类药物，克服分子印记搅拌棒在极性溶剂中应用受限，涂层制备繁琐耗时长的缺点。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层的制备方法，该方法包括以下步骤：
a)磁性搅拌棒的制备与活化：将磁性细铁棒套入玻璃管，两端烧结封口，制成磁性搅拌棒；搅拌棒依次经过丙酮清洗、碱溶液、酸溶液超声浸泡，用去离子水洗涤至中性，活化；将活化后的搅拌棒置于硅烷偶联剂中进行硅烷化反应，经甲醇清洗，氮气吹干；
b)末端二氨基苯甲羧基修饰的磁性纳米粒(gf-Fe3O4)的制备：将Fe3O4SiO2纳米粒分散于甲苯中，加入硅烷偶联剂，氮气保护下于100～120℃下反应20～30h，经过磁性分离，得到硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒；在水溶液中加入硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒与二氨基苯甲酸，于60～80℃反应12～24h，经磁性分离，得到末端二氨基苯甲羧基修饰的磁性纳米粒；
c)磁场诱导自组装分子印记搅拌棒(MIPs-MSB)的制备：将模板分子、磁性纳米粒和功能单体甲基丙烯酸置于致孔剂中预聚3-6h，随后加入交联剂和引发剂，超声，最后加入硅烷化的磁性搅拌棒，氮气保护下，55～60℃条件下聚合8～12h；取出搅拌棒老化，用体积比9:1混合的甲醇-乙酸溶液洗脱模板分子，得到磁性纳米粒掺杂的分子印记搅拌棒涂层。
步骤a)所述的碱溶液为0.5～2mol/L的NaOH溶液；酸溶液为0.1～0.5mol/L的盐酸溶液；浸泡时间各为18～24h和1～2h，硅烷偶联剂为质量浓度为20％的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液；
步骤a)所述的磁性搅拌棒直径为0.3～0.4cm，长度为1.0～1.2cm。
步骤a)所述的硅烷化反应时间为1～3h。
步骤b)中：每1gFe3O4SiO2纳米粒与20mL硅烷偶联剂进行反应；与磁性纳米粒反应的硅烷偶联剂为γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷与γ-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷的混合物，两者体积比为1:1。
步骤b)中：磁性纳米粒与二氨基苯甲酸的质量比为1:17～1:20。
步骤c)中：所述的模板分子是氯硝西泮；功能单体为甲基丙烯酸；交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；模板分子、功能单体、交联剂三者的摩尔比为1:4～6:20～30。
步骤c)中：引发剂为偶氮二异丁腈；引发剂的摩尔量为模板分子摩尔量的10％～20％。
步骤c)中：致孔剂为体积比为9:1甲醇-甲苯溶液，模板分子在致孔剂中的浓度为10～15mg/mL。
步骤c)中：老化条件为真空60℃下干燥6～8h。
本发明所用的模板分子是氯硝西泮，其结构式为：
本发明选择具有氨基和苯环的二氨基苯甲酸作为接枝材料，制备出的接枝修饰的磁性纳米粒，不仅对模板分子有氢键结合位点，而且具有π-π相互作用，通过磁场诱导自组装快速有序地吸附在磁性搅拌棒的表面合成MIPs涂层，使MIPs涂层在极性溶剂中对分析物的识别和吸附能力增强。
使用本发明分子印记搅拌棒吸附萃取过程：在1.5mL样品溶液中放入MIPs-MSB，使其完全浸没，搅拌25～45min，取出搅拌棒，甲醇清洗后将其放入1mL甲醇-乙酸溶液(9:1，v/v)中超声20～45min解吸目标物，解吸液用氮气吹干，500μL流动相复溶，复溶液用于高效液相色谱分析。样品用甲醇-甲苯(9:1，v/v)溶解，搅拌速度为400rpmmin-1。
与现有技术比较本发明的有益效果：
(1)磁性搅拌棒使磁性纳米粒在磁场的作用下迅速吸附到搅拌棒的表面，磁性纳米粒末端的双键与交联剂聚合使得搅拌棒与磁性纳米粒既有物理吸附又有化学吸附，结合更加牢固，增加了印记涂层的稳定性。搅拌棒反复使用后涂层无断裂、脱落、腐蚀现象。分别使用10次、20次、25次、30次后，吸附量Q(ng)的RSD均在4％范围内。
(2)搅拌棒与磁性纳米粒的迅速结合，可以带动与磁性纳米粒非共价结合的模板分子与功能单体随之移动到搅拌棒表面进行聚合，极大地增强了溶液中物质的利用率。
(3)包裹SiO2的磁性纳米粒表面与硅烷偶联剂反应后，末端的氨基一部分与二氨基苯甲酸反应，一部分与模板分子形成氢键。二氨基苯甲酸与模板分子既可以形成氢键，也可以形成π-π共轭，两者协同作用，提高在极性溶剂中的稳定性，为模板分子的结合提供大量的特异性结合位点，洗脱后可形成大量的有序的模板分子三维空腔。
(4)本发明对影响MIPs涂层吸附性能的模板分子、功能单体、交联剂、引发剂、溶剂等的用量及试验条件进行了优化，制备出的涂层致密、均匀，涂层的厚度在0.53μm左右(如图1所示)。与其他文献中报道的涂层相比，涂层厚度更薄，有效利用率显著提高，同时兼具选择性好、吸附量高、吸附快和解吸所需时间短等特点。
(5)本发明制备的搅拌棒与高效液相色谱色谱联用，可用于保健食品、饲料、生物样品等复杂基质中苯二氮卓类化合物的快速分离与富集，最终达到样品的高选择性、高灵敏度准确测定。
为了验证本发明的氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层的吸附性能，发明人进行了如下试验:
1.静态吸附试验：在1.5mL不同浓度的氯硝西泮的甲醇-甲苯(9:1，v:v)溶液中放入MIPs-MSB，密封，室温搅拌(400rpm)，达吸附平衡后，取出搅拌棒，甲醇-乙酸(9:1，v:v)超声解吸，解吸液利用HPLC-UV测定浓度，分别计算印迹搅拌棒和非印迹搅拌棒在不同浓度下的吸附容量Q(μg)，结果见图2。磁性非分子印记搅拌棒涂层(NIPs-MSB)的制备过程同本发明氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层，仅仅是磁性诱导自组装过程中不加入模板分子氯硝西泮，其他步骤与MIPs-MSB的制备步骤完全相同。随着模板分子初始浓度的不断增加，MIPs-MSB的吸附量也逐渐增大，当浓度为12.5μgmL-1时，吸附达到平衡，吸附量不再变化，认为此时印记孔穴几乎全部被模板分子占据。而在NIPs-MSB等温吸附线中，由于NIPs-MSB的涂层中没有形成印记孔穴，吸附量明显小于MIPs-MSB。
2.选择性吸附试验：在1.5mL25μg/mL氯硝西泮、硝西泮、咪达唑仑的甲醇-甲苯(9:1，v:v)溶液中分别放入MIPs-MSB，密封，室温搅拌(400rpm),达吸附平衡后，取出搅拌棒，甲醇-乙酸(9:1，v:v)超声解吸，解吸液利用HPLC-UV测定浓度，分别计算印记搅拌棒和非印记搅拌棒(按照本发明实施例1方法制备得到)在对不同物质的吸附容量Q(μg)，结果见图3。非分子印记搅拌棒的制备步骤同本发明分子印记搅拌棒，仅不加模板分子氯硝西泮。MIPs-MSB对氯硝西泮的吸附量分别是对硝西泮和咪达唑仑的1.15倍和6.26倍，表明MIPs-MSB的选择性良好，对模板分子的及其类似物硝西泮有特异性吸附作用。而NIPs-MSB几乎没有选择性，且吸附量低，进一步证明了MIPs-MSB印记涂层的良好的选择性和特异性吸附作用。
3.吸附动力学试验：在1.5mL不同浓度的氯硝西泮的甲醇-甲苯(9:1，v:v)溶液中放入MIPs-MSB，密封，室温搅拌(400rpm)不同时间，根据吸附前后吸附液的浓度变化，分别计算搅拌棒在不同时间对氯硝西泮的吸附量Q(μg)，结果见图4。随着吸附时间的增加，吸附量逐渐增大，约在25min趋于饱和，吸附萃取过程快速。
4.解吸动力学试验：在1.5mL不同浓度的氯硝西泮的甲醇-甲苯(9:1，v:v)溶液中放入MIPs-MSB，密封，室温搅拌(400rpm)至吸附平衡,取出搅拌棒，甲醇-乙酸(9:1，v:v)超声解吸不同的时间，解吸液利用HPLC-UV测定浓度，得出达解吸平衡所需的时间，结果见图5。解吸时间在20min左右即达到平衡，非常快速。
高效液相色谱条件：
固定相为AgilentHC-C18柱，(5μm,150mm×4.6mm)；流动相为0.01molL-1磷酸盐缓冲液(pH2.5)：乙腈＝29:71(v/v)；检测波长为223nm；流速为1mLmin-1；柱温为30℃；进样体积20μL。
附图说明
图1：氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层的扫描电子显微镜图。
图中，(a)本发明制备的磁性纳米粒；(b)氯硝西泮分子印记搅拌棒的涂层横截面；(c)搅拌棒涂层表面。
图2：本发明制得搅拌棒对氯硝西泮静态吸附曲线
图3：选择性吸附试验
图中，CZP：氯硝西泮；NZP：硝西泮；MDZ：咪达唑仑。
图4：吸附动力学曲线
图5：解吸动力学曲线
图6：实际样品检测高效液相色谱图
图中，(a)中药保健品直接进样；(b)在实际样品中添加硝西泮和氯硝西泮后经分子印记搅拌棒处理后进样；(c)实际样品未经添加经分子印记搅拌棒处理后进样。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：
(1)磁性搅拌棒的制备与活化：将磁性细铁棒套入玻璃管，两端烧结封口，制成磁性搅拌棒；搅拌棒依次经过丙酮清洗、碱溶液、酸溶液超声浸泡，用去离子水洗涤至中性，活化；将活化后的搅拌棒置于硅烷偶联剂中进行硅烷化反应，经甲醇清洗，氮气吹干；碱溶液为1mol/L的NaOH溶液；酸溶液为0.5mol/L的盐酸溶液；浸泡时间各为18h和2h，硅烷偶联剂为质量浓度为20％的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液；磁性搅拌棒直径为0.3cm，长度为1.1cm。硅烷化时间为1h。
(2)末端二氨基苯甲羧基修饰的磁性纳米粒(gf-Fe3O4)的制备：将1gFe3O4SiO2纳米粒分散于甲苯中，加入20mL硅烷偶联剂，氮气保护下于110℃下反应25h，经过磁性分离，得到硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒；在水溶液中加入硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒与二氨基苯甲酸，于70℃反应12h，经磁性分离，得到末端二氨基苯甲羧基修饰的磁性纳米粒(df-Fe3O4NPs)；其中，硅烷偶联剂为γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷与γ-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷的混合物，两者体积比为1:1。硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒与二氨基苯甲酸的质量比为1:18。
(3)分子印记搅拌棒涂层的制备：称取50mg氯硝西泮溶于5mL甲醇-甲苯(9:1，v/v)中，加入2.5mg制备好的df-Fe3O4NPs超声分散，加入67.7μLMAA避光室温搅拌3h进行预聚。然后放入功能化的搅拌棒，待吸附完全，溶液澄清后，加入15mgAIBN和0.749mLEGDMA(使得模板分子、功能单体、交联剂三者的摩尔比为1:5:25)。最后塞紧密封，通氮气除氧3min，氮气环境60℃聚合10h。取出搅拌棒，真空60℃老化6h，甲醇-乙酸溶液(9:1，v/v)洗脱模板分子。
(4)吸附萃取过程：在1.5mL萃取溶液(氯硝西泮/甲醇-甲苯溶液)中放入MIPs-SB，使其完全浸没在萃取溶液中，400rpmmin-1搅拌25min，取出MIPs-SB，甲醇清洗后将其放入1mL甲醇-乙酸溶液(9:1，v/v)中超声20min去除吸附目标物，解吸液用氮气吹干，500μL流动相复溶，复溶液用于液相色谱分析。
实施例2：
(1)磁性搅拌棒的制备与活化：将磁性细铁棒套入玻璃管，两端烧结封口，制成磁性搅拌棒；搅拌棒依次经过丙酮清洗、碱溶液、酸溶液超声浸泡，用去离子水洗涤至中性，活化；将活化后的搅拌棒置于硅烷偶联剂中进行硅烷化反应，经甲醇清洗，氮气吹干；碱溶液为1mol/L的NaOH溶液；酸溶液为0.5mol/L的盐酸溶液；浸泡时间各为18h和2h，与搅拌棒反应的硅烷偶联剂为质量浓度为20％的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液；磁性搅拌棒直径为0.3cm，长度为1.1cm。硅烷化反应时间为2h。
(2)末端二氨基苯甲羧基修饰的磁性纳米粒(gf-Fe3O4)的制备：将1gFe3O4SiO2纳米粒分散于甲苯中，加入20mL硅烷偶联剂，氮气保护下于110℃下反应25h，经过磁性分离，得到硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒；在水溶液中加入硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒与二氨基苯甲酸，于70℃反应12h，经磁性分离，得到末端二氨基苯甲羧基修饰的磁性纳米粒(df-Fe3O4NPs)；其中，硅烷偶联剂为γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷与γ-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷的混合物，两者体积比为1:1。硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒与二氨基苯甲酸的质量比为1:18。
(3)分子印记搅拌棒涂层的制备：称取50mg氯硝西泮溶于5mL甲醇-甲苯(9:1，v/v)中，加入2.5mg制备好的df-Fe3O4NPs超声分散，加入67.7μLMAA避光室温搅拌4h进行预聚。然后放入功能化的搅拌棒，待吸附完全，溶液澄清后，加入15mgAIBN和0.749mLEGDMA(使得模板分子、功能单体、交联剂三者的摩尔比为1:5:25)。最后塞紧密封，通氮气除氧3min，氮气环境60℃聚合11h。取出搅拌棒，真空60℃老化7h，甲醇-乙酸溶液(9:1，v/v)洗脱模板分子。
(4)吸附萃取过程：在1.5mL萃取溶液(氯硝西泮/甲醇-甲苯溶液)中放入MIPs-SB，使其完全浸没在萃取溶液中，400rpmmin-1搅拌30min，取出MIPs-SB，甲醇清洗后将其放入1mL甲醇-乙酸溶液(9:1，v/v)中超声25min去除吸附目标物，解吸液用氮气吹干，500μL流动相复溶，复溶液用于液相色谱分析。
实施例3：
(1)磁性搅拌棒的制备与活化：将磁性细铁棒套入玻璃管，两端烧结封口，制成磁性搅拌棒；搅拌棒依次经过丙酮清洗、碱溶液、酸溶液超声浸泡，用去离子水洗涤至中性，活化；将活化后的搅拌棒置于硅烷偶联剂中进行硅烷化反应，经甲醇清洗，氮气吹干；碱溶液为1mol/L的NaOH溶液；酸溶液为0.5mol/L的盐酸溶液；浸泡时间各为18h和2h，与搅拌棒反应的硅烷偶联剂为质量浓度为20％的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液；磁性搅拌棒直径为0.3cm，长度为1.1cm。硅烷化反应时间为3h。
(2)末端二氨基苯甲羧基修饰的磁性纳米粒(gf-Fe3O4)的制备：将1gFe3O4SiO2纳米粒分散于甲苯中，加入20mL硅烷偶联剂，氮气保护下于110℃下反应25h，经过磁性分离，得到硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒；在水溶液中加入硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒与二氨基苯甲酸，于70℃反应12h，经磁性分离，得到末端二氨基苯甲羧基修饰的磁性纳米粒(df-Fe3O4NPs)；其中，硅烷偶联剂为γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷与γ-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷的混合物，两者体积比为1:1。硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒与二氨基苯甲酸的质量比为1:18。
(3)分子印记搅拌棒涂层的制备：称取50mg氯硝西泮溶于5mL甲醇-甲苯(9:1，v/v)中，加入2.5mg制备好的df-Fe3O4NPs超声分散，加入67.7μLMAA避光室温搅拌5h进行预聚。然后放入功能化的搅拌棒，待吸附完全，溶液澄清后，加入15mgAIBN和0.749mLEGDMA(使得模板分子、功能单体、交联剂三者的摩尔比为1:5:25)。最后塞紧密封，通氮气除氧3min，氮气环境60℃聚合11h。取出搅拌棒，真空60℃老化8h，甲醇-乙酸溶液(9:1，v/v)洗脱模板分子。
(4)吸附萃取过程：在1.5mL萃取溶液(氯硝西泮/甲醇-甲苯溶液)中放入MIPs-SB，使其完全浸没在萃取溶液中，400rpmmin-1搅拌35min，取出MIPs-SB，甲醇清洗后将其放入1mL甲醇-乙酸溶液(9:1，v/v)中超声30min去除吸附目标物，解吸液用氮气吹干，500μL流动相复溶，复溶液用于液相色谱分析。
实施例4：
(1)磁性搅拌棒的制备与活化：将磁性细铁棒套入玻璃管，两端烧结封口，制成磁性搅拌棒；搅拌棒依次经过丙酮清洗、碱溶液、酸溶液超声浸泡，用去离子水洗涤至中性，活化；将活化后的搅拌棒置于硅烷偶联剂中进行硅烷化反应，经甲醇清洗，氮气吹干；碱溶液为0.5mol/L的NaOH溶液；酸溶液为0.3mol/L的盐酸溶液；浸泡时间各为24h和1h，与搅拌棒反应的硅烷偶联剂为质量浓度为20％的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液；磁性搅拌棒直径为0.3cm，长度为1cm。硅烷化反应时间为2h。
(2)末端二氨基苯甲羧基修饰的磁性纳米粒(gf-Fe3O4)的制备：将1gFe3O4SiO2纳米粒分散于甲苯中，加入20mL硅烷偶联剂，氮气保护下于110℃下反应25h，经过磁性分离，得到硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒；在水溶液中加入硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒与二氨基苯甲酸，于70℃反应12h，经磁性分离，得到末端二氨基苯甲羧基修饰的磁性纳米粒(df-Fe3O4NPs)；其中，硅烷偶联剂为γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷与γ-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷的混合物，两者体积比为1:1。硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒与二氨基苯甲酸的质量比为1:17。
(3)分子印记搅拌棒涂层的制备：称取50mg氯硝西泮溶于5mL甲醇-甲苯(9:1，v/v)中，加入2.5mg制备好的df-Fe3O4NPs超声分散，加入67.7μLMAA避光室温搅拌5h进行预聚。然后放入功能化的搅拌棒，待吸附完全，溶液澄清后，加入15mgAIBN和0.749mLEGDMA(使得模板分子、功能单体、交联剂三者的摩尔比为1:5:25)。最后塞紧密封，通氮气除氧3min，氮气环境60℃聚合12h。取出搅拌棒，真空60℃老化8h，甲醇-乙酸溶液(9:1，v/v)洗脱模板分子。
(4)吸附萃取过程：在1.5mL萃取溶液(氯硝西泮/甲醇-甲苯溶液)中放入MIPs-SB，使其完全浸没在萃取溶液中，400rpmmin-1搅拌35min，取出MIPs-SB，甲醇清洗后将其放入1mL甲醇-乙酸溶液(9:1，v/v)中超声35min去除吸附目标物，解吸液用氮气吹干，500μL流动相复溶，复溶液用于液相色谱分析。
实施例5：
(1)磁性搅拌棒的制备与活化：将磁性细铁棒套入玻璃管，两端烧结封口，制成磁性搅拌棒；搅拌棒依次经过丙酮清洗、碱溶液、酸溶液超声浸泡，用去离子水洗涤至中性，活化；将活化后的搅拌棒置于硅烷偶联剂中进行硅烷化反应，经甲醇清洗，氮气吹干；碱溶液为1mol/L的NaOH溶液；酸溶液为0.5mol/L的盐酸溶液；浸泡时间各为18h和2h，与搅拌棒反应的硅烷偶联剂为质量浓度为20％的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液；磁性搅拌棒直径为0.3cm，长度为1.1cm。硅烷化反应时间为2h。
(2)末端二氨基苯甲羧基修饰的磁性纳米粒(gf-Fe3O4)的制备：将1gFe3O4SiO2纳米粒分散于甲苯中，加入20mL硅烷偶联剂，氮气保护下于110℃下反应25h，经过磁性分离，得到硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒；在水溶液中加入硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒与二氨基苯甲酸，于70℃反应12h，经磁性分离，得到末端二氨基苯甲羧基修饰的磁性纳米粒(df-Fe3O4NPs)；其中，硅烷偶联剂为γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷与γ-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷的混合物，两者体积比为1:1。硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒与二氨基苯甲酸的质量比为1:18。
(3)分子印记搅拌棒涂层的制备：称取50mg氯硝西泮溶于5mL甲醇-甲苯(9:1，v/v)中，加入2.5mg制备好的df-Fe3O4NPs超声分散，加入67.7μLMAA避光室温搅拌6h进行预聚。然后放入功能化的搅拌棒，待吸附完全，溶液澄清后，加入15mgAIBN和0.749mLEGDMA(使得模板分子、功能单体、交联剂三者的摩尔比为1:4:20)。最后塞紧密封，通氮气除氧3min，氮气环境60℃聚合12h。取出搅拌棒，真空60℃老化8h，甲醇-乙酸溶液(9:1，v/v)洗脱模板分子。
(4)吸附萃取过程：在1.5mL萃取溶液(氯硝西泮/甲醇-甲苯溶液)中放入MIPs-SB，使其完全浸没在萃取溶液中，400rpmmin-1搅拌40min，取出MIPs-SB，甲醇清洗后将其放入1mL甲醇-乙酸溶液(9:1，v/v)中超声40min去除吸附目标物，解吸液用氮气吹干，500μL流动相复溶，复溶液用于液相色谱分析。
实施例6：
(1)磁性搅拌棒的制备与活化：将磁性细铁棒套入玻璃管，两端烧结封口，制成磁性搅拌棒；搅拌棒依次经过丙酮清洗、碱溶液、酸溶液超声浸泡，用去离子水洗涤至中性，活化；将活化后的搅拌棒置于硅烷偶联剂中进行硅烷化反应，经甲醇清洗，氮气吹干；碱溶液为2mol/L的NaOH溶液；酸溶液为0.1mol/L的盐酸溶液；浸泡时间各为18h和2h，与搅拌棒反应的硅烷偶联剂为质量浓度为20％的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液；磁性搅拌棒直径为0.4cm，长度为1.2cm。硅烷化时间为2h。
(2)末端二氨基苯甲羧基修饰的磁性纳米粒(gf-Fe3O4)的制备：将1gFe3O4SiO2纳米粒分散于甲苯中，加入20mL硅烷偶联剂，氮气保护下于110℃下反应25h，经过磁性分离，得到硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒；在水溶液中加入硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒与二氨基苯甲酸，于70℃反应12h，经磁性分离，得到末端二氨基苯甲羧基修饰的磁性纳米粒(df-Fe3O4NPs)；其中，硅烷偶联剂为γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷与γ-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷的混合物，两者体积比为1:1。硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒与二氨基苯甲酸的质量比为1:20。
(3)分子印记搅拌棒涂层的制备：称取50mg氯硝西泮溶于5mL甲醇-甲苯(9:1，v/v)中，加入2.5mg制备好的df-Fe3O4NPs超声分散，加入67.7μLMAA避光室温搅拌6h进行预聚。然后放入功能化的搅拌棒，待吸附完全，溶液澄清后，加入15mgAIBN和0.749mLEGDMA(使得模板分子、功能单体、交联剂三者的摩尔比为1:6:30)。最后塞紧密封，通氮气除氧3min，氮气环境60℃聚合12h。取出搅拌棒，真空60℃老化8h，甲醇-乙酸溶液(9:1，v/v)洗脱模板分子。
(4)吸附萃取过程：在1.5mL萃取溶液(氯硝西泮/甲醇-甲苯溶液)中放入MIPs-SB，使其完全浸没在萃取溶液中，400rpmmin-1搅拌40min，取出MIPs-SB，甲醇清洗后将其放入1mL甲醇-乙酸溶液(9:1，v/v)中超声45min去除吸附目标物，解吸液用氮气吹干，500μL流动相复溶，复溶液用于液相色谱分析。
高效液相色谱条件：
固定相为AgilentHC-C18柱，(5μm,150mm×4.6mm)；流动相为0.01molL-1磷酸盐缓冲液(pH2.5)：乙腈＝29:71(v/v)；检测波长为223nm；流速为1mLmin-1；柱温为30℃；进样体积20μL。
样品测定方法学：
1.标准曲线与检测限
分别配制氯硝西泮和硝西泮浓度为0μgL-1-4×103μgL-1的系列溶液，在最优实验条件下，进行HPLC-UV测定。结果表明，氯硝西泮和硝西泮在浓度为0μgL-1-4×103μgL-1范围内呈良好的线性关系。线性回归方程分别为氯硝西泮：A＝146.75C+3283.5，相关系数为0.9991；硝西泮：A＝132.12C+1107.1相关系数为1。检测限为10μgL-1，S/N＝3。
2.实际样品分析
以本实施例1制得MIPs-MSB测定中药保健品中的苯二氮卓类药物。取0.5g实际样品粉末在2mL甲醇中超声1h。将超声提取液用0.45μm滤膜过滤，滤液用氮气吹干,复溶于1.5mL甲醇-甲苯(9:1,v/v)。放入MIPs-MSB，密封，室温搅拌(400rpm),达吸附平衡后，取出搅拌棒，甲醇-乙酸(9:1，v:v)超声解吸，解吸液利用HPLC-UV测定浓度。结果见图6。分别在实际样品溶液中加入氯硝西泮和硝西泮标准溶液进行加样回收率试验(n＝3)，具体结果见表1。
表1中药保健品中苯二氮卓类药物的测定(n＝3)

Claims (10)

1.氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
a)磁性搅拌棒的制备与活化：将磁性细铁棒套入玻璃管，两端烧结封口，制成磁性搅拌棒；搅拌棒依次经过丙酮清洗、碱溶液、酸溶液超声浸泡，用去离子水洗涤至中性，活化；将活化后的搅拌棒置于硅烷偶联剂中进行硅烷化反应，经甲醇清洗，氮气吹干；
b)末端二氨基苯甲羧基修饰的磁性纳米粒的制备：将Fe3O4SiO2纳米粒分散于甲苯中，加入硅烷偶联剂，氮气保护下于100～120℃下反应20～30h，经过磁性分离，得到硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒；在水溶液中加入硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒与二氨基苯甲酸，于60～80℃反应12～24h，经磁性分离，得到末端二氨基苯甲羧基修饰的磁性纳米粒；
c)磁场诱导自组装分子印记搅拌棒的制备：将模板分子、磁性纳米粒和功能单体甲基丙烯酸置于致孔剂中预聚3-6h，随后加入交联剂和引发剂，超声，最后加入硅烷化的磁性搅拌棒，氮气保护下，55～60℃条件下聚合8～12h；取出搅拌棒老化，用体积比9:1混合的甲醇-乙酸溶液洗脱模板分子，得到磁性纳米粒掺杂的分子印记搅拌棒涂层。
2.根据权利要求1中所述的氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层的制备方法，其特征在于在步骤a)中：所述的碱溶液为0.5～2mol/L的NaOH溶液；酸溶液为0.1～0.5mol/L的盐酸溶液；浸泡时间各为18～24h和1～2h，硅烷偶联剂为质量浓度为20％的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液。
3.根据权利要求1中所述的氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层的制备方法，其特征在于在步骤a)中所述的磁性搅拌棒直径为0.3～0.4cm，长度为1.0～1.2cm。
4.根据权利要求1中所述的氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层的制备方法，其特征在于硅烷化反应时间为1～3h。
5.根据权利要求1中所述的氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层的制备方法，其特征在于在步骤b)中：每1gFe3O4SiO2纳米粒与20mL硅烷偶联剂进行反应；硅烷偶联剂为γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷与γ-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷，两者体积比为1:1。
6.根据权利要求1中所述的氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层的制备方法，其特征在于在步骤b)中：磁性纳米粒与二氨基苯甲酸的质量比为1:17～1:20。
7.根据权利要求1中所述的氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层的制备方法，其特征在于步骤c)中：所述的模板分子是氯硝西泮；功能单体为甲基丙烯酸；交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；模板分子、功能单体、交联剂三者的摩尔比为1:4～6:20～30。
8.根据权利要求1中所述的氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层的制备方法，其特征在于步骤c)中：引发剂为偶氮二异丁腈；引发剂的摩尔量为模板分子摩尔量的10％～20％。
9.根据权利要求1中所述的氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层的制备方法，其特征在于步骤c)中：致孔剂为体积比为9:1甲醇-甲苯溶液，模板分子在致孔剂中的浓度为10～15mg/mL。
10.根据权利要求1中所述的氯硝西泮分子印记搅拌棒涂层的制备方法，其特征在于步骤c)中：老化条件为真空60℃下干燥6～8h。
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