CN105687647A - 青娥丸抗抑郁抗焦虑的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了青娥丸在制备抗抑郁抗焦虑的组合物中的用途。青娥丸口服给药，增加实验动物矿场活动总路程，降低悬尾不动时间，增加进入高架十字迷宫开臂时间，减少强迫游泳不动时间，表现出较好的抗抑郁作用。青娥丸可增加海马区5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、γ-氨基丁酸(γ-GABA)的含量，降低谷氨酸(Glu)的含量。一方面，青娥丸对γ-GABA的增加作用和Glu的降低作用说明青娥丸具有调节中枢神经系统神经递质Glu和γ-GABA代谢的作用，降低Glu/γ-GABA的比值，减弱GABA能神经递质的传递，调控受体儿茶酚胺的反应性，从而发挥抗抑郁抗焦虑作用。另一方面，青娥丸通过抑制单胺氧化酶的活性，增加中枢神经系统5-HT的水平，发挥抗抑郁抗焦虑作用。

Description

青娥丸抗抑郁抗焦虑的新用途

技术领域

本发明涉及青娥丸的新用途，特别是涉及青娥丸用于治疗或缓解抑郁症和焦虑症的新用途。

技术背景

抑郁症是以持续情绪低落和认知功能障碍为主要临床特征，包括焦躁情绪、快感缺失、睡眠障碍、负罪感和反复自杀念头等。全球的抑郁症患者已达3.4亿人。目前抑郁症在中国发病率大约为4％。据世界卫生组织统计，抑郁症已成为世界第四大疾患，预计到2020年，可能成为仅次于冠心病的第二大疾病。抑郁症不仅给患者带来精神上的损失，也给患者造成沉重的经济负担。抑郁症在中国造成的总经济负担达到622亿元人民币，美国每年因抑郁症造成的经济损失达到437亿美元。世界卫生组织、世界银行和哈佛大学的一项联合研究表明，抑郁症已经成为中国疾病负担的第二大疾病。

抑郁症伴随单胺类神经递质、下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能失调、神经营养因子和炎症反应等生物学机制相关，很难以用单一的病因和发病机制来解释。临床上常用抗抑郁药物主要是：三环类抗抑郁药(TCA)、单胺氧化酶抑制剂(MAOI)、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRS)，普遍存在耐药性、副作用大等弊端，因此寻找安全、高效、副作用小的抗抑郁药物尤其是天然抗抑郁药物成为了该领域的研究热点。

《中国药典》所载的青娥丸是以《太平惠民和剂局方》配方为基础，药材细粉，配以炼蜜制成的大蜜丸或水蜜丸。具有补肾强腰，用于肾虚腰痛，起坐不利，膝软乏力等症。

本发明涉及青娥丸在抗抑郁及抗焦虑方面的作用和功效，尚未见相关报道。

发明内容

本发明涉及青娥丸在制备抗抑郁抗焦虑的组合物中的用途。

青娥丸在制备抗抑郁抗焦虑的组合物中的用途，其特征在于：青娥方由杜仲(盐炒)480克，补骨脂(盐炒)240克，核桃仁(炒)150克，大蒜120克组成。

以上四味，将大蒜蒸熟，干燥，与盐炒杜仲、盐炒补骨脂粉碎成细粉，过筛，再将炒核桃仁捣烂，与上述粉末掺研，过筛，混匀。每100g粉末用炼蜜20～30g加适量的水泛丸，干燥，制成水蜜丸；或加炼蜜50～70g制成大蜜丸，即得。

本发明提供了青娥丸抗抑郁及抗焦虑的技术方案，为开拓青娥丸抗抑郁及抗焦虑的新用途提供了依据。

本发明中青娥丸可使嗅球切除抑郁模型小鼠行为学得到改善，并能增加脑中5-HT，NE，Glu的含量，降低γ-GABA的含量，从而起到治疗和改善抑郁及焦虑疾病的作用。

有益效果

本发明的优点和积极效果在于，通过生物学研究表明，青娥丸对实验性抑郁小鼠具有一定的保护作用，主要体现在对行为学评价的改善作用。青娥丸一方面能显著增加嗅球切除小鼠海马去甲肾上腺素NE，5-HT/5-HIAA的比值，提示青娥丸可通过抑制单胺氧化酶的活性发挥抗抑郁及抗焦虑作用。另一方面青娥丸通过增加脑内Glu含量，减少γ-GABA的含量，发挥调节中枢神经系统神经递质Glu和γ-GABA代谢的作用，从而调控受体对儿茶酚胺的反应性，发挥抗抑郁及抗焦虑作用。因此青娥丸具有对抑郁的治疗和缓解作用。提示其具有开发新的抗抑郁及抗焦虑药物的前景。

附图说明

附图1青娥丸对嗅球切除模型小鼠抗抑郁作用操作流程图

具体实施方式

以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实验例1本发明青娥丸致大鼠嗅球损毁模型的改善作用

(一)实验药物和仪器

药物：青娥丸，批号20120509，上海雷允上制药有限公司生产。盐酸氟西汀(又称百忧解)，批号2076A，法国FatheonFrance生产。文拉法辛，批号1308025，PfizerIretandPharmaceuticals生产。异氟烷，r-氨基丁酸(GABA)，谷氨酸(Glu)，5-羟色胺(5-HT)5-HT，肾上腺素(Epi)，多巴胺(DA)DA，去甲肾上腺素(NE)NE，5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)，3，4-二羟基苄胺(内标)以上几种均为Sigma公司产品。仪器：“鼠博士“动物行为学分析：高架十字迷宫(RD1108-EPM-M)，强迫游泳实验分析系统型号(RD1119-FST-M)，悬尾实验分析系统型号(RD1118-TST-M)，旷场实验分析系统(RD1112-OFT-M)。麻醉机：(SNMSSN5374.UK)，电动骨钻(BJ1102SAO)，“鼠博士”动物行为学视频分析系统(R.D)

(二)实验方法与结果

动物分组及给药

1双侧嗅球切除模型(OB)的抑郁模型的建立

C57BL/6J雄性小鼠，SPF级，四周周龄，由上海中医药大学实验动物中心提供。所有的动物年龄和体重相当的，实验动物的初始体重为25–30g，实验动物饲养在一个装有垫料塑料盒内(45cm×25cm×20cm)，保持室温20±2℃，湿度40–60％，保持12小时光照和12小时熄灯循环，光照时间从7:00-19:00。水和食物可以自由获得。实验操作程序完全按照上海中医药大学实验动物中心动物福利委员会的相关指导方案进行。

双侧嗅球切除手术

C57BL/6J小鼠用7.5％(w/v)水合氯醛腹腔注射(375mg/kgi.p.:Merck，Germany)或用异氟烷吸入麻醉(0.5％in1ml/minO2)，操作过程遵照文献报道.简单的说，用剃毛刀剔去头部毛发后，沿径向中线切口，从前囱前1cm至后1cm正中线处，暴露颅骨。用钻头在距离前囱前8mm，正中线两侧各1mm分别开一骨窗，直径约1.5mm。将电热探头垂直插入颅内约2s，损伤双侧嗅球。并用5mm吸头插入骨窗内，用水泵温和吸出损毁的嗅球，保证不损伤前额叶皮质，钻孔中塞入止血海绵以免出血。于创面撒上灭菌磺胺结晶以防止感染，缝合皮肤。假手术组合嗅球切除手术过程完全相同，只是不损毁和吸出嗅球。所有的动物每天都给予监护，并通过随后的实验证实OB模型是成功的，如果OB动物被证实嗅球切除不完全或前额叶皮质受到损伤的应剔除。假手术动物如果嗅球或前额叶皮质受损的也应剔除。随后实验程序附图1所示。术后恢复14天，第十五天进行旷场实验(OFT)，然后连续给药28d。实验末次给药后依次进行旷场实验，强迫游泳，悬尾，高架十字迷宫。两实验之间间隔<2d；每只动物实验结束后清除粪便，用70％乙醇喷洒箱底并用洁净纱布抹干，以免前1只动物的残留气味造成对本次实验的影响；全部实验结束后由不熟悉实验设计人员进行数据提取录入。

2动物分组和给药

造模成功的C57BL/6mice，60只，随机分为6组：模型组(OB组，给予等体积蒸馏水)；阳性药I组(Fluoxetine)；阳性药I组(venlafaxine)，青娥丸I组(3.6g/kg)、高剂量组(5.4g/kg)。假手术组10只(sham，给予等体积蒸馏水)；

灌胃药物的配制：c57BL小鼠剂量是人剂量的10倍。给药时平均体重25g，按每公斤体重20ml/kg/d，每天灌胃两次，相当于25g小鼠每次灌胃0.25ml.青娥丸正常人剂量为中剂量：9g*2＝18g，高剂量9g*3＝27g，人体重按50公斤体计算，中剂量相当于：0.36g/kg/d，高剂量相当于0.54g/kg/d，

通过折算，c57BL小鼠中剂量为3.6g/kg/d，高剂量为5.4g/kg/d

中剂量配药浓度应为3.6g/20ml：即浓度为0.18g/ml.

高剂量配药浓度应为5.4g/20ml，称取青娥丸粉末54g，定容至200ml，即浓度为0.27g/ml。

灌胃方案：实验c57BL小鼠分组：

假手术组，每日两次，每次灌胃0.25ml生理盐水或0.5％CMC-Na；模型组，每日两次，每次灌胃0.25ml生理盐水或0.5％CMC-Na；

氟西叮组，每日两次，每次灌胃给予0.25ml药液，相当于10mg/kg/d；

文拉法辛组，每日两次，每次灌胃给予0.25ml药液，相当于10mg/kg/d；

青娥丸I组，每日两次，每25g体重每次灌胃0.25ml浓度为0.18g/ml，随着体重的增加，相应的给药体积随体重而变化，相当于3.6g/kg/d；

青娥丸II组，每日两次，每25g体重每次灌胃0.25ml浓度为0.27g/ml，随着体重的增加，相应的给药体积随体重而变化。相当于5.4/kg/d。

3实验方法

3.1旷场实验(OFT)

测试动物在新奇开场环境下的自发性活动和探索行为，可用于评价其兴趣大小程度。实验前，小鼠在测试房间内先适应1h，房间内保持安静，光照柔和。旷场箱由4块50cm高的白色亚克力板围成50cm*50cm大小的正方形，底板也为白色亚克力板，正上方有一摄像头连接计算机轨迹跟踪系统。每只大鼠放置于旷场中央，记录其3min行为活动。通过计算机轨迹跟踪系统分析下列参数：行走总距离和站立次数(动物两前爪同时离地次数)。行走总距离和站立次数降低表明动物在新奇环境下兴趣度下降。每测试1只动物后用酒精清洁旷场箱底板

3.2强迫游泳(FST)

小鼠进行强迫游泳刺激：实验时迫使小鼠在一局限的空间游泳，它们首先拼命泳动试图逃跑，随后处于一种漂浮的不动状态，仅露出鼻孔维持呼吸，四肢偶尔划动以保持身体不至于沉下去，这种状态被称为不动状态，实际是动物放弃逃脱的希望。每次刺激从大鼠入水到离开泳池，时间为10min(适应6分钟，取样测定4分钟)。

3.3悬尾(TST)

悬尾(TST)是一种经典而又能快速评价抗抑郁药物的方法。其原理是利用小鼠悬尾后企图逃脱但又无法逃脱，从而放弃挣扎，进入特有的抑郁不动状态，实验过程中记录动物不动时间来反映抑郁状态，抗抑郁药物、兴奋药物能明显地缩短改变其状态。

小鼠进行进行悬尾刺激。实验时将大鼠尾部夹住悬起，悬尾大鼠为克服不正常体位而挣扎活动，但活动一定时间后，出现间断性不动。表现出放弃调整的希望。每次刺激从大鼠尾部夹住悬起到放下休息，时间为10min((适应6分钟，取样测定4分钟)。

3.4高架十字迷宫(EPM)

高架十字迷宫是利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突行为来考察动物的焦虑状态。高架十字迷宫具有一对开臂和一对闭臂，啮齿类动物由于嗜暗性会倾向于在闭臂中活动，但出于好奇心和探究性又会在开臂中活动，在面对新奇刺激时，动物同时产生探究的冲动与恐惧，这就造成了探究与回避的冲突行为，从而产生焦虑心理。而抗焦虑药物能明显增加进入开臂的次数与时间。木质十字(65am×5cm)，包括3部分：两相对开臂区(30cm×5cm)，两相对闭臂区附有立墙(30cm×5cm×30cm)，中央区(5cm×5cm)；十字迷宫离地面50cm，实验由25W红灯泡离中央区40cm高处照明；EPM将小鼠放入高架十字迷宫中央区，头面对开臂区，用摄像系统记录动物5min内的行为变化，包括两臂停留时间、进入次数；其中，4只爪子经中央区均进入一臂方可开始记录实验参数。进入开放臂次数及停留时间与大鼠的焦虑情绪成负相关，进入开放臂次数越少，停留时间越短，说明老鼠的焦虑情绪越严重。3.5脑内神经递质的测定

末次行为学实验结束后，小鼠摘眼球取血，处死后于冰浴中迅速取出小鼠脑组织，并分离海马，迅速置于液氮中，随后转移至-80℃保存，备用。

3.5.1神经递质样品前处理方法：

3.5.1.1海马及前额叶皮质样品的处理

组织称重+400μL0.1％甲酸-甲醇+10μLIS(3，4-二羟基苄胺，10μg/mL，甲醇溶)→匀浆→13000rpm，15min，4℃离心→取上清，氮吹干→100μL初始流动相(0.1％甲酸-水:乙腈＝98:2)复溶，涡旋→13000rpm，15min，4℃离心→小心吸取上清，10μL进样。(最终样品浓度：组织重/100μL，内标浓度：1μg/mL)

3.5.1.2血清样品前处理方法：

未抗凝的Ep管摘小鼠眼球取全血→13000rpm，15min，4℃离心取上清(置4℃冰箱备用)→取100vL血清+10μLIS(3，4-二羟基苄胺，10μg/mL，甲醇溶)→涡旋→13000rpm，15min，4℃离心→取上清，氮吹干→100μL初始流动相(0.1％甲酸-水:乙腈＝98:2)复溶，涡旋→13000rpm，15min，4℃离心→小心吸取上清，10μL进样。

3.5.1.3神经递质测定条件

UPLC：AgilentTechnologies6410TripleQuadLC/MS，液相条件：色谱柱：WatersACQUITYHSST3柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相：梯度洗脱，流动相组成件表1，流动相A为，流动相B为。流速：0.1mL·min-1；进样室温度：4℃；柱温：35℃；进样量：10.0μL。质谱条件见表2，质谱参数见表3.

表1神经递质测定的流动相

表2神经递质测定的质谱条件

表3神经递质测定的质谱参数

3.6统计分析

采用SPSS13.0软件进行统计分析，实验数据以采用单因素方差分析，组间差异采用Dunnett’S后检验，P<0.05表示有统计学意义。

4实验结果

4.1旷场(OFT)实验

术后恢复14天，第十五天进行OFT实验，结果表示OB模型成功，OB手术引起小鼠在矿场活动总路程明显增加。给药28天后，旷场实验(OFT)测试动物在新奇环境下的自发性活动和探索行为，青娥丸组行走总距离均较模型组提高，表明青娥丸可增加抑郁模型动物在新奇环境下兴趣度。

表4给药28天后各组动物在旷场中活动总路程

4.2悬尾实验(FST)

给药28天后，悬尾实验的结果见表5，由结果可知，青娥丸高剂量和青娥方提取物组可明显缩短OB小鼠悬尾不动时间，这表明青娥丸及青娥方提取物对抑郁的治疗作用，小鼠悬尾后企图逃脱，挣扎逃脱的欲望增加。

表5青娥丸对小鼠悬尾不动时间的影响

4.3高架十字迷宫(EPM)

给药28天后，高架十字迷宫实验的结果见表6，由结果可知，阳性药物百忧解和文拉法辛均能增加小鼠在开臂的停留时间，青娥丸能显著增加OB小鼠进入开臂的时间，表明青娥丸能增加抑郁小鼠对新异环境的探究特性，青娥丸对抗动物的焦虑情绪具有很好的作用。其抗焦虑情绪作用甚至强于阳性药物百忧解及文拉法辛。相对开臂时间是进入开臂时间和进入闭臂时间的比值，是衡量抗焦虑作用的一个重要参数。青娥丸可显著增加OB小鼠的相对开臂时间，表明其具有较好的抗焦虑作用。

表6青娥丸抗焦虑作用

4.4游泳实验(FST)

给药28天后，游泳实验结果见表7，结果表明给予青娥丸及提取物治疗后，OB小鼠强迫游泳不动时间明显较模型组缩短，表明青娥丸的抗抑郁作用明显。

表7青娥丸对抑郁小鼠强波游泳实验不动时间的影响

4.5嗅球切除小鼠给予药物治疗后对海马神经递质的影响

嗅球切术小鼠给予阳性药物和青娥丸治疗后，海马γ-GABA水平较模型组显著增加(p<0.05)，海马Glu水平较模型组显著降低(p<0.05)，且Glu/GABA较模型组有显著降低，且青娥丸治疗28天后，小鼠海马Glu/GABA趋于和假手术组一致。海马多巴胺和NE的含量较模型组显著增加(p<0.05)，且5-HT/5-HIAA比值显著增加(p<0.05)，结果见表8。

表8嗅球切除小鼠给予药物治疗后对海马神经递质的影响

(三)结论

海马在解剖结构上属于边缘系统前脑皮质，它与下丘脑，杏仁核，脑干有着极其复杂的相互联系，与情绪认知密切相关，尤其是控制抑郁方面非常重要。是目前情绪应激，抑郁症研究涉及最多的脑区。抑郁模型大鼠存在Glu/GABA平衡的失调。青娥丸能够逆转OB造成的Glu/GABA比值的增加，该研究结果提示青娥丸及提取物可能通过影响脑内的Glu和GABA代谢，即主要通过Glu/GABA-Glu代谢环路循环而发挥抗抑郁作用。

5-羟色胺属于吲哚胺类神经递质，不能透过血脑屏障，所以中枢的5-羟色胺是脑内合成的。值得一提的是，5-HIAA是5-HT的代谢产物，5-HT/5-HIAA的比值的增加，说明5-HT的代谢受到了抑制，该过程由单胺氧化酶所催化，青娥丸能显著增加OB鼠海马5-HT/5-HIAA的比值，提示青娥丸可通过抑制单胺氧化酶的活性发挥抗抑郁作用。

本实验结果表明，青娥丸可增加抑郁小鼠矿场活动总路程，降低悬尾不动时间，增加小鼠进入高架十字迷宫开臂时间，减少抑郁小鼠强迫游泳不动时间，表现出较好的抗抑郁作用。青娥丸的抗抑郁的作用可能通过多条途经发挥作用，一方面，青娥丸对γ-GABA的增加作用和Glu的降低作用说明青娥丸具有调节中枢神经系统神经递质Glu和γ-GABA代谢的作用，降低Glu/γ-GABA的比值，减弱GABA能神经递质的传递，调控受体儿茶酚胺的反应性，从而发挥抗抑郁作用的。另一方面，青娥丸通过抑制单胺氧化酶的活性，增加中枢神经系统5-HT的水平，发挥抗抑郁作用。该研究的结果很好的解释了中药发挥药效的多靶点多途径的作用。

具体实施例2

青娥丸在制备抗抑郁抗焦虑的组合物中的用途，其特征在于：青娥方由杜仲(盐炒)480克，补骨脂(盐炒)240克，核桃仁(炒)150克，大蒜120克组成。

以上四味，将大蒜蒸熟，干燥，与盐炒杜仲、盐炒补骨脂粉碎成细粉，过筛，再将炒核桃仁捣烂，与上述粉末掺研，过筛，混匀。每100g粉末用炼蜜30g加适量的水泛丸，干燥，制成水蜜丸；或加炼蜜70g制成大蜜丸，即得。

Claims (3)

1.青娥丸在制备抗抑郁抗焦虑的组合物中的用途。

2.根据权利要求1的青娥丸在制备抗抑郁抗焦虑的组合物中的用途，其特征在于：青娥丸由杜仲(盐炒)480克，补骨脂(盐炒)240克，核桃仁(炒)150克，大蒜120克组成。

3.根据权利要求2的青娥丸在制备抗抑郁抗焦虑的组合物中的用途，其特征在于：以上四味，将大蒜蒸熟，干燥，与盐炒杜仲、盐炒补骨脂粉碎成细粉，过筛，再将炒核桃仁捣烂，与上述粉末掺研，过筛，混匀。每100g粉末用炼蜜20～30g加适量的水泛丸，干燥，制成水蜜丸；或加炼蜜50～70g制成大蜜丸，即得。