CN105683144B - 用于制备超极化羧化物化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备包含诊断感兴趣的含[1‑13C]‑超极化羧化物分子的水溶液的方法，其包括用分子仲氢仲氢化所关注的13C‑羧化物分子的不饱和的烯基或炔基酯。

Description

用于制备超极化羧化物化合物的方法
发明领域
本发明一般涉及磁共振成像(MRI)领域。更特别地，本发明涉及使用仲氢诱导极化(Para Hydrogen Induced Polarisation)(PHIP)技术制备作为MR代谢探针的诊断感兴趣的[1-13C]-超极化羧化物化合物的方法。
现有技术
磁共振成像是一种用于体外和体内进行医学和生物学研究的确认的有力工具。该技术的主要缺点应归于作为MRI基础的NMR光谱的固有的低灵敏度。实际上，NMR信号的强度取决于成像核的核自旋态数量之间的差异。根据众所周知的Boltzman方程(ΔN＝γhB0/(2πkT))，该差异是温度和施用的磁场的函数，并且在热平衡下，其在10-5的数量级，即非常低。
最近已经提出使用超极化分子作为所述缺点的可能解决方式，并且近年来，许多努力已经致力于开发可行有效的MR-超极化方法。
所报道发展中的推动力赋予该技术提供克服常规MR成像的灵敏度限制的可能性，开辟了在化学且特别是生物学中的大量新应用。
实际上，对于代表代谢过程中关键分子的可检测化合物，该技术能够显著改善信号强度，产生了开发检测直接报告细胞过程的特定步骤的关键代谢物的新MR方法(代谢成像)。例如，使用合适地超极化代谢物质进行体内成像，并且已经用1-13C-标记的丙酮酸化物作为代谢标记物观察实时代谢成像(参见，例如Goldman K.et al,Real time metabolicimaging.PNAS 2006,103(30),11270-11275)，强烈表明在利用超极化的13C磁共振(MR)成像的体内肿瘤诊断中可有利地使用该(及其它)关键代谢物(Albers MJ.et al.,Hyperpolarized13C lactate,pyruvate,and alanine:noninvasive biomarkers forprostate cancer detection and grading；Cancer Research 2008,68(20):8607-15)。
同时，用于13C超极化的方法的开发已经在使用13C标记的超极化分子的体内灌注研究中开辟了一个新的领域(Mansson,S.et al,Eur.Radiol.,2006,16,57-67)。
在这个意义上，最常用的超极化方法依赖使用动态核极化(DNP)的过程，其基本上由下述步骤组成：i)制备具有稳定的有机基团的感兴趣底物的固体玻璃状溶液；ii)使固体溶液达到低温(接近于1K)，进入磁铁中，并以所述有机基团的电子顺磁共振(e.p.r.)跃迁频率辐射几分钟，以便将电子极化转移到底物分子的NMR活性核；iii)超极化物质的快速溶出；iv)将超极化分子给予体内，并通过NMR或图象获取记录它们的分布和代谢转化。
一些代谢物已经利用DNP-溶解法极化，其中包括丙酮酸化物、乙酸化物、富马酸酸化物、谷氨酸化物和许多其它代谢感兴趣的分子。通常，检测的共振是羧化物部分的13C碳原子的共振，其具有的T1值在20-60s的范围内。
总的来说，即使一般地任何底物都有超极化的可能性，但是DNP-溶解法需要复杂且昂贵的装置。该技术的另一个代表性缺点是：达到令人满意的核极化所需约1小时的长极化周期。
可替代的仲氢诱导极化(PHIP)方法依赖将仲氢(仲氢或parahydrogen，如本文可互换地使用)分子加入到不饱和的底物，其允许将仲氢的自旋序(spin order)转化成异核的超极化。
与DNP方法不同，基于使用仲氢的超极化过程相当容易处理且需要简单的装置，并且提供具有如1分钟那么短的超极化周期的更快的制备。仅采用很小的技术努力就获得了至多105的信噪比增强。
相反，使用该技术的瓶颈以相关不饱和分子前体的有限利用率为代表，所述不饱和分子前体是加入仲氢的分子所需的，所述仲氢作为自旋序的来源起所述作用。
用于制备13C或15N超极化分子的最佳底物前体(由于具有约零背景信号和较长张弛时间T1，允许限制由于松弛引起的极化损耗，因此被认为在体内应用中是优选的)包括靠近要极化的异核的不饱和的-C＝C-或-C≡C-键。对于13C化合物，这代表着三碳限制，其成功地由例如丙烯酸化物部分为代表，其在仲氢化之后，得到发现对于血管造影成像有用应用的丙酸化物化合物(Goldman,M.et al.,C.R.Phys.2005,6,575-581)。然而，适合的底物(包括可氢化的双键或三键)的需求实际上强烈限制了使用该极化技术可获得的超极化分子的数量。
导致进一步还原有吸引力的不饱和前体的另一个代表性问题是：由于其稳定的分子内重排(所谓的酮-烯醇互变异构，将乙烯醇转化成相应醛)引起的不稳定性。烯醇式的PHIP仲氢化通过形成磷酸化物(即，在加入仲氢之后形成的磷酸烯醇丙酮酸化物)而稳定，Chekmenev et al.报道了超极化的磷酸乳酸化物，例如在J.Am.Chem.Soc.2012,134,3957-3960中。
最近，已经介绍了利用仲氢获得超极化分子的一种新方法，称为SABRE，其允许通过可逆地形成超极化底物、仲氢和有机金属络合物的三重加合物获得分子极化(Adams,R.W.et al.,Science 2009.323,17081711)。该方法允许获得分子极化而无需进行加氢，因此可以绕过PHIP应用的主要限制之一。
此外，获得仲氢化的分子的水溶液的一步方法由本申请人公开在WO2010/037771中，所述方法依赖于在有机相中仲氢化期望的超极化烷基的或烯基的产物的烯基或炔基前体，接着将其快速转化成最终分子，并在水相中萃取。通过使用该方法，例如，已经通过在氯仿/丙酮混合物中仲氢化马来酸酐，接着用碱性水溶液稀释和相转移得到琥珀酸水溶液。
然而，基于我们的最佳认识，诊断感兴趣的13C-超极化分子，比如尤其是13C-超极化乙酸化物和丙酮酸化物目前仅用DNP超极化技术可获得(Kohler,S.J.et al.；MagnReson.Med.2007,58,6569)，而用PHIP技术进行其制备被认为是即便是可能的，也是高度挑战性的(参见前述的J.Am.Chem.Soc.2012,134,3957-3960)。
发明简述
如本文所公开的，现在已经鉴定的适合的不饱和的底物及制备方法，其允许获得诊断感兴趣的含[1-13C]-超极化羧化物分子，该分子不是用PHIP技术通过将仲氢加入到其一种不饱和的直接前体直接获得的并且因此目前是利用DNP过极化技术获得的。
特别地，本文提出了一种可选的基于PHIP的极化方法，其包括使用本文鉴定的合适的不饱和的酯作为适合的可氢化底物前体来制备诊断感兴趣的含[1-13C]-超极化羧化物分子。
根据所提出的方法，获得感兴趣的羧化物分子的适合的不饱和的酯，并用分子仲氢氢化，从而得到相应的仲氢化酯；然后，通过已知方法，将H原子加入到羧化物碳原子的13C信号，诱导极化转移，例如，通过应用场循环，得到[1-13C]-超极化氢化酯，其通过除去氢化基团转化成期望的[1-13C]-超极化的游离羧化物分子，最后，如此或以质子化形式呈相应羧酸收集在水溶液中。
根据本发明的诊断感兴趣的含羧化物分子是发现适合用作磁共振成像(MRI)或磁共振波谱(MRS)中，典型地用于脉管成像、灌流成像、介入成像、或分子成像中的MR探针的羧化物化合物，并且是生物过程和代谢途径的关键部分的羧化物分子，所述生物过程和代谢途径为比如例如三羧酸(TCA)循环(也称为柠檬酸循环)、糖酵解、β-氧化、尿素循环和酮体代谢途径，发现所述含羧化物分子反而具有总是增强作为代谢性MR标记物的作用。
用于本发明、即作为上述含羧化物分子的适合的可氢化底物前体的最佳不饱和的酯是乙烯基酯，其在期望的、距离乙烯基的加入仲氢化的质子的三个键长处具有13C羧化物碳原子。
然而，由于因酮-烯醇平衡而不可能容易具有适合的乙烯醇或乙炔醇，因此简便制备感兴趣的羧化物分子的适合的乙烯基酯几乎不能实现，如在例如丙酮酸化物的情况下，或以同意满足持续增加的医学需要的规模制备几乎是不现实的。
我们现在意想不到地发现，尽管这包括将可氢化的不饱和现象移动到距离13C羧化物碳原子超出了通常使用且推荐具有令人满意的极化转移所必需的最佳三键处，但是不同家族的不饱和的酯(例如包括烯丙基和炔丙基酯)可以方便地制备且用作适合的可氢化前体分子，允许得到感兴趣的相应[1-13C]-超极化羧化物分子或相应羧酸，产率良好且满足极化度，其被证实与采用相邻不饱和的碳-碳键比如例如乙烯基酯的不饱和的碳-碳键获得的基本上相同。
实际上，用分子仲氢氢化感兴趣的含羧化物分子的这些不饱和的酯被证实允许方便地基于PHIP制备相应[1-13C]-超极化羧化物分子或相应羧酸，最后可以将其收集在水溶液中，备用于(ready for use)体内MR应用。
因此，本发明一般涉及使用仲氢诱导极化技术制备诊断感兴趣的含[1-13C]-超极化羧化物的方法，其包括用分子仲氢氢化关注的羧化物分子的不饱和的烯基或炔基酯，用作感兴趣的羧化物分子的适合的可氢化底物前体。
更特别地，在一个实施方案中，本发明涉及用于制备用于MR诊断应用的含[1-13C]-超极化羧化物分子的PHIP方法，其包括步骤：a)获得感兴趣的含羧化物分子的不饱和的烯基或炔基酯，并使所述不饱和的酯与分子仲氢反应，得到相应仲氢化酯；
b)诱导所加入极化的H极化转移至[1-13C]-羧化物碳原子的13C信号，得到相应[1-13C]-超极化羧化物酯；
c)除去氢化的酯部分，并收集含[1-13C]-超极化羧化物的分子或相应[1-13C]-超极化羧酸的水溶液。
在一个不同的实施方案中，上述方法进一步包括将所收集的感兴趣的[1-13C]-超极化羧化物分子的水溶液用于体内或体外、离体MR评估诊断感兴趣的生物参数或代谢特性。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及不饱和的烯基或炔基酯作为适合的可氢化底物前体在制备诊断感兴趣的含[1-13C]-超极化羧化物分子中的用途，所述分子用于利用PHIP技术的MR应用。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的仲氢化烷基或烯丙酯作为PHIP方法中的中间体化合物，用于制备用作代谢标记物的含[1-13C]-超极化羧化物分子。
在又另一个实施方案中，本发明涉及一种用于体内或体外(离体)诊断显影个体患者中身体器官、部位、体液或组织或用于基于MR评估个体患者中诊断感兴趣的生物参数或代谢特性的方法，其包括：
i)收集根据如上所述本发明的方法得到的感兴趣的[1-13C]-超极化羧化物分子的无杂质水溶液；
ii)向所述个体患者给药所述收集的水溶液，或使所述水溶液接触所述患者的身体器官、体液或组织的离体样品；
iii)将所述给药的患者或所述接触的离体样品暴露于允许激发所述羧化物分子的超极化13C-碳原子的辐射频率；和
iv)记录所述给药的羧化物分子和/或其任何适合的代谢物或分解产物的激发核产生的信号强度，和
v)获得所述个体患者身体器官、部位或组织的图像，或由记录的信号强度值适当评估感兴趣的生物参数或代谢特性。
附图说明
图1.根据本发明的超极化方法利用仲氢化制备[1-13C]-超极化羧化物分子的水溶液的示意图：a)水介质中羧基分子的乙烯基酯；b)水介质中羧基分子的丙炔酯；c)有机介质中羧基分子的丙炔酯，和水相中相应超极化羧化物化合物的分离。
图2.在乙烯基酯的水中仲氢化之后，乙酸乙酯的13C-NMR光谱(14T，298K,D2O)显示在应用场循环之前，唯一可检测13C信号是乙基的脂肪族碳原子的13C信号，其受连接其的仲氢原子的影响，而羰基信号不受影响，因此是非极化的。
图3.13C-NMR光谱(14T,298K,D2O)a)在乙烯基酯的水中仲氢化和场循环之后乙酸乙酯的13C超极化信号；b)从超极化乙酸乙酯在水中水解得到的乙酸钠；c)来自炔丙基乙酸酯在水中仲氢化和场循环的烯丙基乙酸酯；d)来自烯丙基-乙酸酯水解的乙酸Na。
图4.在场循环之后炔丙基丙酮酸酯的仲氢化产物的13C羰基信号。仲氢化是在加入15％甲醇的水中进行的。由于丙酮酸酯的烯丙基酯(160ppm:图中的结构a))、水合形式(172ppm：图中的结构b))和半缩醛(emiacetal)(171ppm:图中的结构c))，羰基区域的三个信号是明显可检测的。
图5.甲醇中丙酮酸酯的缩醛形式。
图6.a)在甲醇中的仲氢化炔丙基丙酮酸酯提供的13C超极化信号：最强信号对应于甲醇介质中的缩醛形式；b)在加入200μl的NaOD 1M之后的13C超极化信号。
图7.a)在甲醇/CDCl 3中得到的氢化炔丙基-丙酮酸酯(即，烯丙基-丙酮酸酯)的13C极化信号：烯丙基-丙酮酸酯羰基形式(163.8ppm)和水合形式(174.2ppm)；b)在碱性水解(NaOD 1M)和用DCl(1M)pH＝2酸化之后：丙酮酸，羰基形式(164.5ppm)，水合形式(174ppm)和半缩醛(emi-acetalic)形式(173ppm)；c)在用NaOD碱性水解和加入DCl pH＝4酸化之后：丙酮酸钠(168ppm)；d)记录在MeOH相关区域中的光谱，证实不存在任何可检测的MeOH信号。
图8.通过将仲氢加入到相应乙烯基甘氨酸且在MeOH中进行场循环得到的仲氢化的TFA-乙基甘氨酸的13C极化羰基信号(167ppm)。
图9.直接从实施例5的试验收集的水溶液的13C-NMR光谱，显示通过碱性水解13C超极化TFA-烯丙基甘氨酸得到的13C极化信号(181ppm)，其归属于游离甘氨酸。没有观察到甲醇信号(49.5ppm)。
图10.氢化产物烯丙基-丙酮酸酯的1H NMR光谱：c,c’5.75ppm(m)；e,e’5.15ppm(dd,2J＝17.5Hz,3J＝17Hz)；d,d’5.07ppm(dd,2J＝17.5Hz,3J＝10Hz)；b 4.49ppm(d 3J＝5.93Hz)；b’5.54ppm(d,3J＝5.5Hz)；a 2.27ppm(s)；a’1.28ppm(s)；源自氢化催化剂的COA环-辛烷)。
图11.氢化产物烯丙基-丙酮酸酯在氢化溶剂MeOD/CDCl3中的13C光谱。A:26ppm；A’24ppm；D:66.5ppm；D’66ppm；B66ppppm；E,F 119,131ppm；E’,F’132,118ppm；C 160ppm；C’171ppm；B 192ppm；所观察的辛烷信号来自有机溶液中的氢化催化剂。
图12.在仲氢化乙烯基酯和场循环之后(上面光谱)和在随后水解该超极化酯(下面的光谱)之后的13C超极化乳酸乙酯的13C-NMR光谱(14T，298K,D2O)。在上面的光谱中，2-乙酰氧基-丙酸乙酯(3)的13C极化羰基信号在173ppm可检测；在下面的光谱中，[1-13C]-极化的乳酸化物的13C-超极化信号在177.5ppm可检测。
发明详述
本发明涉及不饱和的烯基或炔基酯及使用其作为可氢化的底物前体的仲氢诱导极化方法，其用于制备诊断感兴趣的含有[1-13C]-超极化羧化物的分子，特别地作为MR代谢探针。
根据本发明的含有羧化物的分子(其[1-13C]-超极化衍生物可以方便地通过使用本发明建议的仲氢诱导极化方法制备)优选地包括具有下述通式(I)的羧基化合物：
R-C*(O)-OH (I)
其中
C*表示根据所提出的方法进行13C超极化的羧化物碳原子；
R为C1-C5直链或支链烷基链，其任选地插入一个或多个下述基团或被一个或多个下述基团取代：羰基(-CO-)、羟基(-OH)、氨基(-NHR1)、卤素原子和卤代-烷基、或碳环脂肪族或芳族环(其又任选地被一个或多个羟基取代)；
R1为H或氨基保护基，比如例如三氟乙酰基、乙酰基、苯甲酰基、苄酯基、叔丁基碳酸酯基，优选三氟乙酰基，
及其生理学可接受的盐。
对于如本文使用的C1-C5直链或支链烷基链或C1-C5烷基残基，我们预期C1-C5烷基残基中任一个，因此包括甲基、乙基、正-丙基、正丁基、正戊基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、2-甲基丁基，其中甲基、乙基、丙基和异丙基是优选的。对于卤素(或卤素原子，如本文可互换地使用的)，单独或作为基团的一部分(例如卤化烷基)，我们指氯、溴和氟，后者是优选的。
根据本发明的卤代-烷基包括例如全氟代C1-C3烷基残基，即任一个C1-C3烷基残基，其中所有的氢原子都被氟原子取代，如例如-CF3、-C2F5和-C3F7基团，其中-CF3(即三氟甲基)是优选的。
根据本发明的碳环环的实例例如包括脂肪族或芳族C6元环，比如优选苯基环。
优选地，在上式(I)中，R代表选自下述的基团：式-C1-C5的C1-C5烷基残基、式CH3C-(O)-的甲基羰基、羟基烷基比如优选式CH3CH(OH)-的羟基乙基残基、和式R2-CH(NHR1)-的氨基烷基残基，其中R1为如上定义的，并且R2为H或C1-C4直链或支链烷基链，比如优选甲基、乙基、丙基、异丙基、仲丁基和异丁基，其任选地被羟基(-OH)基团或苯基或羟苯基环取代。
更优选地，R选自甲基、丙基、羟乙基、甲基羰基和式R2-CH(NHR1)-的氨基烷基残基，其中R1为H且R2为H或如上定义的C1-C4直链或支链烷基链，其任选地被羟基(-OH)基团或苯基或羟基苯基环取代，比如最优选异丙基、异丁基、仲丁基、1-羟基乙基、羟基甲基和对-羟基苯甲基。
在一个优选的实施方案中，在上式(I)中，R为甲基残基(-CH3)，并且根据本发明的感兴趣的含羧化物分子为乙酸化物。
在另一个优选的实施方案中，在上式(I)中，R为式CH3CH(OH)-的羟乙基残基，且根据本发明的感兴趣的含羧化物分子为乳酸化物。
在一个进一步优选的实施方案中，在上式(I)中，R为式R2-CH(NHR1)-的氨基烷基，其中R1为H且R2为H，或选自异丙基、异丁基、仲丁基、羟甲基、1-羟乙基和对-羟基苯甲基的基团，并且根据本发明感兴趣的含羧化物分子为天然氨基酸。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，在上式(I)中，R为式CH3C(O)-的甲基羰基基团，并且根据本发明的感兴趣的含羧化物分子是丙酮酸化物。
根据本发明的含羧化物分子进一步包括如前所述上述式(I)的化合物的生理学可接受的盐。
对于如本文使用的可药用盐，我们指上述式(I)的羧化物化合物的衍生物，其中还没有内部中和的羧基为无毒、稳定的盐的形式，其不会破坏或影响超极化化合物的活性。
所述盐的适合的实例典型地包括式(I)的羧酸残基的碱金属盐或有机盐。
在这个意义上，可以适合用于与本发明的化合物成盐的优选的无机碱阳离子包括碱金属或碱土金属的离子，比如钾、钠、钙或镁。优选的有机碱阳离子特别地包括伯胺、仲胺和叔胺的那些，比如乙醇胺、二乙醇胺、吗啉、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、N,N-二甲基葡糖胺。优选的氨基酸阳离子包括例如门冬氨酸和谷氨酸的阳离子。
特别优选的是钠盐和钾盐。
上述式(I)给出的羧化物化合物不包括R残基中适合的不饱和碳-碳键，因此它们不能通过将分子仲氢合适地加入现有的不饱和键且极化转移到羧化物基团的13C碳原子来超极化。
本发明提出的方案包括获得不饱和的烯基或炔基酯，优选上述式(I)的羧化物化合物的C2-C4直链或支链的烯基或炔基酯，并且使用所得到的不饱和的酯作为期望的[1-13C]-超极化羧化物分子的方便可氢化底物前体。
在本发明的范围之内，本文中可互换地使用的术语“底物前体”或“可氢化的前体”或“不饱和的前体”或仅仅“前体”指如下不饱和的分子：包括一个不饱和键(例如双或三碳-碳键)，通过用分子仲氢氢化所述不饱和键得到期望的超极化产物，将该极化转移到非质子核，并且将得到的氢化化合物转化成期望的超极化产物。
可超极化的非质子核(或异核)的实例典型地包括19F、13C、15N或29Si。根据本发明，除非另有规定，否则对于术语可超极化的杂核，我们指13C，更特别地，我们指感兴趣的羧化物分子的13C-羧基碳原子(或1-13C-碳原子)。
供本发明使用的底物前体是感兴趣的羧化物分子的不饱和的烯基或炔基酯，即包括一个不饱和键(例如在-O-R’酯部分的烃R’链中的双或三碳-碳键)且容易可氢化的酯。
因此，本发明的一个目的涉及诊断感兴趣的含羧化物分子的不饱和的烯基或炔基酯的用途，所述含羧化物分子的不饱和的烯基酯或炔基酯作为通过使用PHIP技术制备相应含[1-13C]-超极化羧化物分子的可氢化底物前体。
更特别地，本发明涉及用于制备诊断感兴趣的含[1-13C]-超极化羧化物分子的PHIP方法，其包括用分子仲氢氢化所关注的羧化物分子的不饱和的烯基或炔基酯。
在这个意义上，根据本发明的不饱和的烯基或炔基酯，即用作采用PHIP技术制备[1-13C]-超极化羧化物化合物的可氢化底物前体，优选地包括所关注的含羧化物分子的C2-C4直链或支链烯基或炔基酯，更优选地选自所述的关注的羧化物分子的乙烯基、烯丙基或炔丙基酯。
根据一个优选的实施方案，根据本发明的不饱和的酯是13C富集的或13C标记的，如本文可互换地使用。术语“富集的”或可选地“标记的”指化合物中非零自旋核的浓度高于所述核的天然丰度的典型值，优选地高于天然丰度的至少10％，更优选地高于至少25％，并且甚至更优选地高于其天然丰度的至少75％，且最优选高于其天然丰度的至少90％。根据本发明，富集集中在酯的羧基1-C碳原子上，其变成13C-富集的(或[1-13C]-富集的，如本文可互换地使用)。所述非零13C核赋予获得的含羧化物分子(或羧化物产物，或简单地说产物，如本文可互换地使用的)至少5秒(以s表示)、优选地至少10s、优选地至少20s、优选地至少30s并且甚至更优选地至少40s的T1弛豫时间，在接受约0.5mT至约20T(Tesla)的磁场的溶液中测量的。合适的13C富集可以是天然的，当羧化物酯是天然1-13C富集的时，或者其可以包括分子的羧基1-C碳原子的选择性富集(或13C标记，如本文可选地使用的)。在这个意义上，可以适合地使用市售可获得的富集前体，或者在一定情况下，可以通过根据众所周知的现有技术教导化学合成或生物标记实现选择性富集。
用于本发明作为底物前体的不饱和的酯应当是高度可极化的。特别地，优选的酯是可极化至相当于至少5％、优选地至少10％且更优选地至少20％或甚至更高的程度，并且在除去氢化部分和分离诊断感兴趣的游离超极化羧化物分子之后，能够将羧化物产物中的13C净磁化保持在上述限度内。
在这个意义上，在用分子仲氢氢化且将极化转移至羧基13C-碳原子之后，根据本发明优选的不饱和的酯应当允许容易地在水性介质中除去氢化部分，典型地通过水解，从而能够快速分离游离[1-13C]-超极化羧化物分子的水溶液，备用于体内MR应用。
一般地说，用于本发明的不饱和的酯可以优选地由下述通式(II)表示：R-C*(O)-O-R’ (II)
其中：
C*表示天然13C富集的，或任选地，经历13C超极化的13C标记的羧化物碳原子；
R为如上对于式(I)定义的，和
R’为C2-C4直链或支链烃链，包括碳-碳双键或者三键。
优选地，在上式(II)中，R’为选自乙烯基(式-CH＝CH2)、烯丙基(式-CH2-CH＝CH2)和炔丙基(式-CH2-C≡CH)的烯基或炔基残基。
更优选地，R’为乙烯基或炔丙基残基。
在一个优选的实施方案中，本发明指上述式(II)的不饱和的酯，其中R'为乙烯基残基。
在另一个优选的实施方案中，本发明指式(II)的不饱和的酯，其中R’为炔丙基残基。
本发明的另一个目的涉及一种通过使用仲氢诱导极化技术制备诊断感兴趣的含[1-13C]-超极化羧化物分子的方法，其包括用分子仲氢氢化不饱和的烯基或炔基酯，优选地具有上式(II)的不饱和的烯基或炔基酯，所述含[1-13C]-超极化羧化物分子特别地用作MR代谢探针。
更特别地，在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种用于制备式(I)的含[1-13C]-超极化羧化物分子的方法，其包括步骤：
a)获得感兴趣的含羧化物分子的不饱和的烯基或炔基酯，并使所述不饱和的酯与分子仲氢反应，得到相应仲氢化酯；
b)诱导所加入的仲氢极化转移至[1-13C]-羧化物碳原子的13C信号，得到相应[1-13C]-超极化酯；
c)除去氢化的酯部分，并收集含[1-13C]-超极化羧化物的分子或相应[1-13C]-超极化羧酸的水溶液。
优选地，所述方法的步骤a)得到的不饱和的酯为上述式(II)的烯基或炔基酯。
在这个意义上，上述式(II)的适合的不饱和的酯可以是市售可获得的，例如乙酸乙烯基酯的不饱和的酯的情形就是这样，或者可以通过使用对合成有机化学技术领域的人员容易可获得的常规制备方法方便地获得。而且，根据本发明代表性的不饱和的酯的非限制性实例的制备提供在随后试验部分中。
根据本发明方法的步骤a)的不饱和的酯的氢化是使用PHIP技术在适合的氢化催化剂的存在下进行的。典型地，后者以本领域技术人员已知的催化量使用，例如以10:1到5:1范围的底物/催化剂-比例。
因此，本发明的一个进一步实施方案涉及仲氢化烷基或烯丙基酯，例如通过用分子仲氢氢化根据本发明的不饱和的酯，优选地上述式(II)的不饱和的酯来获得，发现其用作制备超极化分子的PHIP方法的中间体化合物，例如用于制备用作MR代谢标记物的含[1-13C]-超极化羧化物分子。
更特别地，在一个进一步的实施方案中，本发明涉及式(III)的仲氢化酯。
R-C*(O)-O-R″ (III)
其中C*和R为如上定义的，且R”为仲氢化烷基或烯丙基残基，比如优选仲氢化的乙基、丙基或烯丙基，最优选乙基或烯丙基，例如通过用分子仲氢氢化上述式(II)的不饱和的酯获得的，其中R’分别代表乙烯基、烯丙基或炔丙基，最优选乙烯基或炔丙基残基，以及其在PHIP方法中的用途，例如用作制备含[1-13C]-超极化羧化物分子的中间体化合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种通过使用仲氢诱导极化技术制备超极化分子的方法，其包括获得作为中间体化合物的式(III)的仲氢化酯。
根据本发明式(III)的仲氢化中间体的适合的实例例如包括通过将分子仲氢加入到乙酸乙烯基酯前体获得的乙酸乙酯，其13C-NMR特征提供在图2中，通过将分子仲氢加入到炔丙基-丙酮酸酯前体获得的烯丙基丙酮酸酯，其1H-NMR特征提供在图10中，而13C光谱提供在图11中。
根据本发明的方法，用分子仲氢氢化不饱和的酯可以方便地在水性介质、或有机溶剂、或适合的有机溶剂混合物中进行。
在本发明的一个实施方案中，根据本领域已知的氢化过程，包括使不饱和的酯与分子仲氢化反应的所述方法的步骤a)在水溶剂中且在水溶性氢化催化剂的存在下进行。
在这个意义上，如本文可互换地使用的表述“水性溶剂”或“水性介质”，我们指的是水，优选无菌水，其可以任选地为适当缓冲的，例如在约中性pH值下，例如包括6至8且优选约7下，使用合适的缓冲液比如例如磷酸盐缓冲液(H3PO4/H2PO4)。
适于在水性溶剂中使用的催化剂的实例包括式[Rh(二膦)二烯)]+[阴离子]-的铑(I)复合物，其中所述二膦为螯合膦，优选(1,4-双(R1R2)乙烷)、(1,4-双(R1R2)丁烷)，其中R1和R2彼此相同或不同，包括磺化的基团，比如例如DPPETS(1,2-双[双(间-钠磺化苯基(m-sodiosulphonatophenyl))膦基]乙烷)(1,2-双(二苯基膦基)乙烷)、DPPBTS(四磺化的1,4-双(二苯基膦基)丁烷，其中R1＝R2)、DAPBTS(四磺化的双(二茴香基膦基(dianisylphpsphino))丁烷)、手性磺化的二膦比如例如磺化的CHIRAPHOS(2,3-双[双(间-钠磺化苯基)膦基]丁烷)、和磺化的BINAP(2,2-双[双(间-钠磺化苯基)膦基]-1,1-联萘(binaftile))。二烯优选地选自1,5-环辛二烯和降冰片二烯，阴离子可以为任何阴离子，但优选地为四氟硼酸酯或三氟甲基磺酸酯。
优选的为氢化催化剂，其中所述膦基为二苯基膦基丁烷，[Rh(NBD)phos][BF4](其中NBD为降冰片二烯，且phos为1,4-双[(苯基-3-丙烷磺酸酯)膦]丁烷二钠盐)是特别优选的。
根据一个实际的实施方案，根据本发明的不饱和的底物的氢化反应合适地通过使用超极化剂(hyperpolarizer)进行，其中在高压(通常高于6bar且优选地至少8bar)下将氢引入反应器室中，造成含底物和催化剂的溶液雾化，并且其使氢溶解度最佳化。氢化反应优选地在包括30℃至90℃，且更优选60℃至90℃的温度下进行。
对本领域技术人员显然的是氢化反应在如上所述水性介质中进行，氢化催化剂和不饱和的底物分子应当溶于该介质中。
在这个意义上，少量的短链醇比如例如甲醇或乙醇，或可选地任何水溶性有机溶剂比如优选丙酮，都可以以总溶剂量的至少高于10％、优选地10％至30％且更优选10％至20％的量加入到水性介质中，同时提高催化剂功效和底物和氢气在水性介质中的溶解度。
可选地，短链醇比如优选甲醇或乙醇，且更优选甲醇，可以合适地用作氢化反应溶剂。在该情况下，优选的氢化催化剂为[Rh(COD)dppb][BF4]，其中COD为环-1,5-辛二烯，dppb为1,4-双(二苯基膦基)丁烷)。
当用仲氢氢化不饱和的酯时，通过使用已知的方式，经由标量耦合(或核极化效应(nuclear Overhauser effect))将极化由加入的极化的H转移到[1-13C]-羧化物碳原子的13C信号。
在这个意义上，为了有利地使用仲氢化化合物作为有效的13C MRI造影剂，需要将通过从所加入的仲氢极化转移得到的超极化碳原子的“反相”信号全部转化成“同相”信号，用于成像获取。该步骤可以使用合适的脉冲序列进行，例如在上述引用的参考文献GoldmanM.et al(C.R.Phisique 2005,6,575)教导的，或通过将合适的场循环方法施用于仲氢化产物。后者包括将氢化样品快速引入(非绝热地)到磁屏幕(场强＝0.1μT)，然后慢慢地除去(绝热地)所述屏幕以使样品进入相当于地球磁场的场值(50μT)(在这方面，参见例如C.R.Phisique 2004,5,315)。
根据一个优选的实施方案，本发明的方法的步骤b)是通过将适合的场循环方法应用于该方法的步骤a)得到的仲氢化酯，使得促进从质子核(源自仲氢加入到不饱和的酯)极化转移到感兴趣的非质子核，即羧化物分子的[1-13C]-碳原子，以得到相应[1-13C]-超极化羧化物分子。
一般地说，值得注意的是从仲氢极化转移到感兴趣的异核主要通过标量耦合(或j偶联)驱动，并且接近不饱和的杂原子典型地充当来自标量耦合仲氢质子的极化转移的接受者(如所示的，例如在图2中)。在这个意义上，异核极化的强度取决于参与所形成的自旋系统的所有j耦合。因此，例如，对于13C化合物，已经计算(Barkemeyer J.；Haake,M.；BargonJ.J.Am.Chem.Soc.1995,117,2927-2928)当所有核之间的J耦合保持定义的比例时，可以达到形成具有仲氢质子的AA’X自旋系统的从仲氢质子(用A和A’表示)向杂原子(用X表示)的最大极化转移。特别地，两个质子和杂原子的标量耦合之差为JAX-JA’X，并且产物上两个质子之间的标量耦合为JAA’，当比例值|JAX-JA′X|/JAA’为时，极化转移最大。由于JAA’常数在5至15Hz范围内，则异核J耦合(质子-碳耦合)之间的最佳差值范围为15-45Hz。当距离转移极化的杂原子两个或三个(键)的距离处加入两个仲氢质子时，可以获得这种高标量耦合值，并且随距加入的仲氢质子的距离增加而逐渐降低。
根据所有前述内容，本领域技术人员从来不会预期通过极化转移位于距感兴趣的13C碳原子超过两个或三个键距离的仲氢质子，可以观察到令人满意的异核极化，用于MR诊断应用和代谢MR评估。更不用说将会预期可以观察到异核13C极化基本上等于或相当于用位于距13C碳原子最佳距离(上述鉴定的)而不是位于距所加入的仲氢质子4-5个键距离的异核得到的极化。
然而，我们出人意料地观察到在施用磁场周期之后，可以通过极化转移仲氢化乙烯基酯(具有所推荐的距所牵涉的13C异核3个键距离)的极化的H质子核和相应仲氢化炔丙基酯(具有距感兴趣的异核增加的(4-5个键)距离)的极化的H质子核，例如如图3所示，比较从应用场循环之后的仲氢化乙烯基和炔丙基酯得到的羧基13C信号的强度，可以获得[1-13C]-羧化物碳原子的13C信号的基本上相同的超极化。
相反地，如图2所示，在不存在诱导极化转移之后(即，在应用场循环之前)，唯一可检测的13C信号是连接加入乙烯基残基的仲氢原子且因此受其影响的乙基的脂肪族相邻碳原子的信号，而对于位于更远距离且因此基本上不受影响的羧基13C碳原子没有观察到任何可检测信号。
这些意想不到的结果使有可能制备如下酯类：其适于超极化至羧基[1-13C]-碳原子，且从而由其不饱和的烯丙基或炔丙基前体获得适合的诊断感兴趣的含[1-13C]-超极化羧化物分子，由此甚至在不存在其直接不饱和的前体以及适合的乙烯基酯下能够通过使用PHIP技术获得具有令人满意的极化度的[1-13C]-超极化羧化物化合物。
就在其制备之后，将例如在本发明方法的步骤b)得到的[1-13C]-超极化酯定量转化为期望的[1-13C]-超极化羧化物化合物或相应[1-13C]-超极化羧酸，然后将其收集在水溶液中，备用于体内应用。
根据本发明的一个优选的实施方案，所述定量转化是通过水解除去氢化酯部分进行的，得到感兴趣的游离羧化物或相应羧酸。
在这个意义上，本文使用的表述“定量转化”指化学转化(优选地水解)量为20％或更多，优选地50％或更多，更优选地75％或更多，且甚至更优选地至少90％，特别优选地至少95％的酯前体转化成相应的游离羧化物。
如本文使用的术语“水解”指其中水与起始化合物反应产生一种或多种结果化合物的化学反应；其典型地包括起始化合物上的键(酯键)断裂，且任选地将氢阳离子和/或氢氧化物阴离子加入到起始化合物的结构，得到结果化合物。一般而言，水解反应可以在酸性(pH<7)、碱性(pH>7)或甚至中性(pH＝7)下进行，然而碱性条件，例如对应于优选地包括7至14、更优选地8至14且最优选地10至14的pH溶液被认为对于本发明的方法特别优选，如本文如下更详细地描述的。
与所有上述一致，本发明方法的步骤c)包括将该方法的步骤b)得到的[1-13C]-超极化酯水解成相应水溶性含[1-13C]-超极化羧化物的化合物，然后收集在水溶液中。
更特别地，根据一个优选的方案，本发明方法的步骤c)是通过将该方法步骤b)得到的[1-13C]-超极化酯加入到水溶液中，该水溶液具有适量碱(例如NaOH、或NaHCO3、或Na2CO3)、以及具有碱性水性反应的有机或无机化合物(例如，三羟甲基氨基甲烷，也称为氨基丁三醇或磷酸三钠)，例如图示在图1的方案a)和b)中。
对于本发明的范围特别优选的是使用水性NaOH。
例如，在NaOH 0.1-1M的存在下，水解具有10-100mM浓度的该方法步骤b)得到的超极化酯的水溶液，所述NaOH在约20至100℃，优选地40至80℃且最优选60至80℃的温度范围下加入到水溶液中，从而得到[1-13C]-超极化羧化物化合物的水溶液。
在这个意义上，必须考虑到，对于体内MR应用，需要得到的超极化产物的水溶液的生物相容性。因此，在步骤a)至c)之后，根据本发明的上述方法包括在上述水性介质中进行前体酯分子的13C极化，优选地包括另外的步骤d)，包括从步骤c)得到的[1-13C]-超极化羧化物化合物的水溶液除去氢化催化剂和任选的有机共溶剂，从而得到适用于体内应用的含[1-13C]-超极化羧化物分子的水溶液。
该最后一项任务能够例如通过快速蒸发超极化产物的水溶液实现，例如通过将该溶液喷雾到连接真空泵的小室或烧瓶中。然后，例如通过在含有小于1ml的阳离子交换树脂的微柱上洗脱由除去任何任选的有机溶剂或共溶剂、同时保留带正电荷的氢化催化剂得到的(超极化分子)的水溶液，可以方便地进行潜在有毒的Rh(I)复合物的除去。
为了完成所有上述纯化步骤，根据一个特别优选的实施方案，本发明方法的步骤a)，包括使不饱和的酯与分子仲氢反应，是在有机溶剂或适合的有机溶剂混合物中，和在溶于有机介质且不溶于水性溶剂的氢化催化剂存在下进行的。
适于本发明目的的有机溶剂为水不混溶性的，并且优选地包括有机氯化溶剂，比如例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、醚比如例如乙醚、二异丙醚和丁醚、及脂肪族烃比如例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷和环己烷、乙酸乙酯等。
其中，优选的是氯化溶剂，其中特别优选氯仿和二氯甲烷以及其适合的混合物，任选地上述溶剂与最低量的短链醇的混合物，所述短链醇比如典型地乙醇或优选甲醇或可选地丙酮。就此而言，如本文使用的最低量，我们指少于30％、优选10％至30％范围且更优选10至20％范围的总溶剂量的量，导致最后回收的含超极化羧化物分子的水溶液中的残基不可检测。另一方面，例如由于使用较高量的水混溶性溶剂得到的任选的痕量物(traces)可以从所收集的期望超极化分子的水溶液合适地除去，例如通过其快速蒸发或喷雾干燥，如前所述的。
适于本发明使用的催化剂的实例包括式[Rh(二膦)二烯)]+[阴离子]-的铑复合物，其中所述二膦优选地选自DPPB(1,4-双(二苯基膦基)丁烷)、DPPE(1,2-双(二苯基膦基)乙烷)及其衍生物，包括例如手性膦比如DINAP(2,2’-双(二苯基膦基)-1,1’-联萘(binaftyl))、CHIRAPHOS(2,3-二苯基膦基丁烷)、DIOP(1,4-双(二苯基膦基)-1,4-双脱氧-2,3-O-异亚丙基-L-苏糖醇(treitol))和DIPAMP(1,2-双[(2-甲氧基苯基)(苯基膦基)]乙烷)；所述二烯优选地选自1,5-环辛二烯和降冰片二烯，并且所述阴离子可以为任何阴离子，但是优选地为四氟硼酸根或三氟甲基磺酸根。
其中，优选的是其中膦基为二苯基膦基丁烷的催化剂，而[双(二苯基膦基丁烷)(1,5-环辛二烯)]Rh(I)是特别优选的。
实际上，不饱和的底物的氢化是例如通过将包括底物和催化剂的有机溶液喷雾到反应室中进行的，该反应室之前用压力为优选地包括6至10、更优选地8至10的压力下的仲氢且最优选地用约10atm的仲氢加压。氢化反应优选地在40至90℃，更优选地70至90℃的温度下进行。
恰在用仲氢氢化不饱和的酯时，极化由所加入极化的H转移到[1-13C]-羧化物碳原子的13C信号。
就此而言，根据一个优选的方案，根据本发明方法的步骤b)的极化转移是通过将适合的场循环过程应用于仲氢化酯进行的，所述仲氢化酯例如如上所述讨论的方法的步骤a)得到的，促进从所加入的质子核进行期望的极化转移至羧化物分子(即氢化酯)的[1-13C]-碳原子，从而得到相应[1-13C]-超极化酯的有机溶液。
然后，根据所提出方法的步骤c)进行氢化酯部分的水解除去，得到期望的水溶性的[1-13C]-超极化羧化物化合物或相应[1-13C]-超极化羧酸，然后将其呈水溶液收集，备用于体内应用。
根据一个优选的实施方案，本发明方法的步骤c)是通过用适合的水性溶液简单稀释如该方法的步骤b)所述优选地得到的超极化酯的有机溶液进行的，所述水性溶液促进[1-13C]-超极化酯水解成相应水溶性的[1-13C]-超极化羧化物化合物或相应羧酸，例如如图示在图1，方案c)中。
基于前述，根据一个特别优选的实施方案，本发明的方法包括，例如从溶于有机溶剂但不溶于或几乎水不溶于水的式(II)的不饱和的酯(例如如上所述)获得在有机介质中的水不溶性或几乎水不溶性[1-13C]-超极化酯；通过如下步骤将其定量转化成相应水溶性的[1-13C]-超极化羧化物化合物：用适合的水性溶液稀释该有机溶液(超极化酯的有机溶液)进行氢化酯部分的水解除去，然后通过相转移萃取将得到的[1-13C]-超极化羧化物化合物收集在水相中，呈无杂质水性溶液，备用于体内应用。
根据本发明，且除非另有说明，否则对于根据本发明的式(II)的不饱和的酯或[1-13C]-超极化酯，本文可互换地使用的“水溶性差的”或“几乎水不溶性的”指具有最小水溶解度，优选地小于总化合物量的20％、更优选地小于5％且甚至最优选地小于1％的化合物。
另一方面且除非另有说明，否则本文可互换地使用的术语“水溶液”或“适合的水溶液”或“适当的水溶液”指无菌水或盐溶液，任选地在任何生理学容许的且适用于体内诊断应用的情况下合适地缓冲的，或者而且如上定义的水溶液，进一步包括合适量的适合选择的试剂，该试剂能够促进氢化酯快速且选择性转化成相应水溶性[1-13C]-超极化羧化物化合物，并且因此产生如此适用于体内诊断应用的其生理学可接受的水溶液，而不需要进一步纯化。根据本发明能够促进仲氢化底物水解成相应羧化物化合物的水溶液的适合的实例包括最低量的碱，例如NaOH或NaHCO3或Na2CO3，以及与碱水反应的有机或无机化合物(例如，三甲醇氨基甲烷，也称为氨基丁三醇或磷酸三钠)或相应氘化分子。对于本发明的范围特别优选的是NaOH或相应氘化分子的水溶液。
然而，由所有前述显然的是，当用于促进根据本发明方法的步骤c)的酯水解的试剂本身不是生理学可接受的时，比如NaOH的情形，必须基于反应本身的化学计量精确地确定其在加入的水溶液中的量，以便其完全用于仲氢化酯转化反应成水溶性和生理学相容的(在生理学pH条件下)游离羧化物，或超过必须适合地中和的量(例如，通过加入适合量的酸与碱产生生理学可接受的盐)，从而得到期望羧化物化合物的生理学可接受的水溶液，其如此备用于体内应用，而不需要任何进一步的纯化和/或随后制备。
因此，含[1-13C]-超极化羧化物分子(或羧酸)的水溶液是直接从根据本发明的上述优选方法的步骤c)收集的，其为无杂质的且如此可用于体内MRI诊断显影，而不需要进一步纯化。
在这方面，在从试验测试水解之后收集的含[1-13C]-超极化羧化物分子的水溶液中观察到没有任何可检测痕量的杂质或有机溶剂，所述试验测试中超极化酯是在有机溶剂中得到的，但是包括甲醇或丙酮作为有机共溶剂。实际上，在从使用MeOH作为氢化共溶剂的实施例3(参见图7c)和实施例5(参见图9)的试验获得水溶液中，没有发现这些共溶剂的残余物(至少在可检测的水平上)。
因此，根据一个特别优选的实施方案，本发明涉及用于制备诊断感兴趣的含[1-13C]-超极化羧化物分子的仲氢诱导极化方法，其包括：
a)获得在与水不混溶的有机溶剂(或溶剂混合物)中感兴趣的含任选地[1-13C]-富集的羧化物分子的适合的不饱和的烯基或炔基酯，所述有机溶剂可以任选地包括最低量的短链醇或丙酮，并且使得到的酯与分子仲氢在可溶于有机溶剂但不溶于水的催化剂的存在下反应，得到相应仲氢化酯；
b)将合适的场循环过程应用于得到的仲氢化酯，得到相应[1-13C]-超极化酯的有机溶液，
c)用促进超极化酯水解成相应水溶性的含[1-13C]-超极化羧化物分子或相应羧酸的适合的水溶液稀释该[1-13C]-超极化酯的有机溶液，然后将其例如通过相转移萃取到水相中，并直接收集呈无杂质水溶液，如此备用于体内应用。
有趣地是，根据本发明方法得到的作为如此备用于体内应用的水溶液的[1-13C]-超极化羧化物化合物具有至少5％的极化度，使得在体内成像方面提供了足够的灵敏度。优选地，得到的极化为至少10％，更优选地至少15％。另一方面，根据本发明得到的超极化分子的无杂质水溶液稳定临床可接受的一段时间；特别优选地，该极化的至少10％保持在注射时，注射通常恰在制备超极化羧化物之后进行，更优选地保持至少约30％极化，最优选地保持至少约80％极化。
就此而言，显然本文的极化方法应当在时间框架内进行，其中在进行前体的化学转化(例如水解)之后不久，超极化羧化物分子保持显著地极化。因此，给予这样的活性底物和随后MR测量优选地尽可能快速进行。这是指人类或非人类动物体样品应当有效地接近于其中进行极化的区域。
根据本发明的水溶液优选地包括浓度范围在0.002至1.0M之间且优选地在0.01至0.5M之间的感兴趣的超极化分子。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，发现得到的超极化分子的无杂质水溶液(例如根据步骤d)得到的或更优选地如上所述从该方法的步骤c)直接收集的)有利地如此用于(即，无需进一步纯化和/或随后配制)人类或动物体器官、体液、部位或组织的体外、离体且特别是体内MR诊断造影，以及用于个体、人类或动物、患者中诊断感兴趣的生理参数的诊断评价。
甚至优选地，发现它们有利地用于涉及通过使用MR成像技术评价个体患者中诊断感兴趣的代谢特性的新兴领域。特别地，感兴趣的超极化羧化物的代谢转化的评估可以提供个体患者中代谢过程的评价和/或关于(健康或病理性的)患者组织或器官的代谢状态的信息。
因此，在一个另外的实施方案中，本发明涉及MR造影剂，其特征在于其包括[1-13C]-超极化羧化物化合物的无杂质水溶液或优选地由其组成，所述无杂质水溶液是根据步骤d)收集的，或更优选地从根据本发明的一个特别优选的实施方案的方法的步骤c)直接收集的。
在一个特别优选的实施方案中，所述[1-13C]-超极化羧化物化合物为[1-13C]-超极化乳酸化物。
在一个可选的同样优选的实施方案中，所述[1-13C]-超极化羧化物化合物为[1-13C]-超极化乙酸化物。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的[1-13C]-超极化羧化物化合物为[1-13C]-超极化丙酮酸化物。
而且，本发明涉及仲氢诱导极化方法，其除了允许得到如上所述感兴趣的[1-13C]-超极化羧化物分子的无杂质水溶液的a)至c)或a)至d)的制备步骤之外，进一步包括将收集的水溶液应用于个体患者的MR诊断造影或用于诊断感兴趣的生物参数或代谢特性的体内、或体外、离体MR评估。
更特别地，根据一个进一步的实施方案，本发明涉及一种仲氢诱导极化方法，其包括：
i)收集根据步骤d)或更优选地直接来自根据本发明方法的步骤c)的感兴趣的[1-13C]-超极化分子的水溶液，所述方法还进一步包括：
ii)将收集的感兴趣的[1-13C]-超极化羧化物分子的水溶液给予个体患者，或使所述水溶液接触个体患者的身体器官、体液或组织的离体样品；
iii)将给予的个体患者(或离体样品)暴露于允许激发所述羧化物分子的超极化13C-标记的碳原子的辐射频率；
iv)记录所述给予的羧化物分子和/或其任何适合的代谢物或分解产物的激发核产生的信号强度，和
v)获得个体患者身体器官、部位或组织的图像，或由记录的信号强度值适当地评估感兴趣的生物参数或代谢特性。
就此而言，上述方法的步骤包括将给予的患者或离体样品暴露于适合的激发辐射，记录激发核产生的信号强度，并获得个体患者身体器官、部位或组织的图像，或可以根据相关领域的技术人员已知的常规技术和操作步骤合适地进行由所记录的信号强度值适当地评估感兴趣的生物参数或代谢特性。
而且，本发明涉及用于个体患者中身体器官、部位、体液或组织的体内诊断MR成像或用于诊断感兴趣的生物参数或代谢特性的体内或体外、离体MR评估的方法，其包括：
i)收集来自步骤d)或更优选地直接地来自之前公开的所述方法的步骤c)的根据本发明的方法感兴趣的[1-13C]-超极化羧化物分子的水溶液；
ii)向个体患者给予所述收集的水溶液，或使所述水溶液接触个体患者的身体器官、体液或组织的离体样品；
iii)将给予的患者或接触的离体样品暴露于允许激发所述羧化物分子的超极化13C-标记的碳原子的辐射频率；
iv)记录所述给予的羧化物分子和/或其任何适合的代谢物或分解产物的激发核产生的信号强度，和
v)获得个体患者身体器官、部位或组织的图像，或由记录的信号强度值适当地评估感兴趣的生物参数或代谢特性。
上述方法可以可选地包括将用合适量的[1-13C]-超极化羧化物分子的水溶液预处理的患者暴露于激发13C-超极化羧化物分子的辐射频率，并记录受激13C-核产生的信号强度，或者仍然可选地，其包括在合适的时间，由个体患者得到的MRI信号集合获得信号强度值(并且，依次评估诊断感兴趣的生物参数或代谢特性)，所述患者用有效量的[1-13C]-超极化羧化物分子的水溶液合适地处理且适当地暴露于允许激发该羧化物分子的超极化13C-信号的辐射频率，然后以数字形式储存在断层扫描控制存储器或本地或远程数字资料存储装置中。
在这方面，除非另有说明，如本文使用的“个体患者”或“患者”指人类或动物患者，并且优选进行MR诊断评估的人类。
另一方面，如本文可互换地使用的“有效量”或“合适量”，我们指根据本发明方法收集的且优选地直接地从优选方法方案的步骤c)收集的超极化分子水溶液的任何量，所述量足以满足其预期诊断目的(即，例如，为了获得所述给予的羧化物分子和/或其任何适合的代谢物或分解产物的激发核产生的信号强度)。
为此目的，通过使用本发明的方法得到的[1-13C]-超极化羧化物(或羧酸)的无杂质水溶液可以如此给予血管系统或直接给予器官或肌肉组织或通过皮下或皮肤下途径给予，视情况而定。然后，根据本发明的方法，将样品暴露于具有选择激发所述超极化13C-羧基信号中核自旋跃迁的频率辐射的均匀磁场(也称为“主磁场”)。所述羧化物和因此相应羧化物分子的13C-信号的超极化导致负责磁共振信号的那些核的激发和基态核自旋状态之间的数量差异的增加。因为MR信号强度与该数量差异成比例，所以最终检测的MR信号导致幅度信号更大。诱导的MR信号的幅度也取决于其它几个因素，比如磁场强度、样品温度、同位素性质和成像核的化学环境等。
本发明将通过下述实施例进一步阐述，其意味着是示例性的而不以任何方式限制本发明的范围。
试验部分
所有13C-NMR光谱都得自600MHz Bruker光谱仪，在14.1T和298K下操作。
实施例
使用的所有化学品和试剂都是市售可获得的，或者可以根据本领域众所周知的方法制备。
实施例1：从乙烯酯中制备[1-13C]-超极化乙酸化物：在水性介质中进行[1-13C]-超极化
乙酸乙烯酯的仲氢化
使用水溶性催化剂[Rh(NBD)phos][BF4](NBD＝降冰片二烯，phos＝1,4-双[(苯基-3-丙烷磺酸酯)膦]丁烷二钠盐)(2.5mM氘化水溶液)(该催化剂可以例如根据在Magn.Reson.Mat.Phys.Biol.Med.22,123-34(2009)中报道的方法制备，在水中进行乙酸乙烯酯(购自Sigma-Aldrich；参考代码V1505)的仲氢化。在NMR管中进行仲氢化反应，该NMR管配备有Young阀，装有0.3ml的催化剂、0.03mmol的底物(3μl，最终浓度约100mM)、0.05ml的甲醇和8bar的仲氢(在77K下富集，50％富集)。
[1-13C]-超极化乙酯的制备
在90℃下温热该溶液之后，将NMR管强力振摇10″，然后立即获得13C光谱。在图2中，可以观察到仅在脂肪族13C信号上超极化。然后，重复如上所述的试验，其中在振摇NMR管之后，应用场循环。实际上，将该NMR管放入μ-金属磁场屏蔽中，然后在约5″内从该屏蔽慢慢地取出。然后，用600MHz Bruker光谱仪立即获得(得到的溶液的)13C-NMR光谱。图3a报道了所记录的13C-NMR光谱，其显示形成的[1-13C]-超极化乙酯在176ppm下的超极化13C-羧化物共振。
[1-13C]-超极化乙酸化物的制备
为了得到相应的[1-13C]-超极化乙酸化物，用第二个量的乙酸乙烯酯重复如上所述的仲氢化反应。然后，在场循环过程之后立即加入0.05ml的NaOD 6M水解得到的[1-13C]-超极化酯，之后获得13C-NMR光谱。图3b)报道了得到的乙酸盐(呈钠盐)的13C-NMR光谱，其中乙酸盐的13C-超极化信号在181ppm可检测。有意义的是，得到的极化信号强度与图3a)中所示的对母体乙酸乙酯所观察的极化信号强度恰好相当。
实施例2：从炔丙基酯中制备[1-13C]-超极化乙酸化物：在水性介质中进行[1-13C]-超极化
乙酸炔丙酯的合成
使用Dean-Stark装置，在催化量的p-TsOH(0.32g,1.7mmol)下，在C6H6(120cm3)中加热回流乙酸(2.00g,34.1mmol)和炔丙醇(2.29g,40.9mmol)4小时。使该反应冷却至室温，并用饱和的NaHCO3(2×100mL)洗涤，然后用水(2×100mL)洗涤。收集有机层并干燥(用无水Na2SO4)，过滤并浓缩，得到呈无味可流动黄色油状物的粗产物(1.67g，50％)，使用其而无需进一步纯化。
[1-13C]-超极化乙酸化物的制备
得到的炔丙基酯的仲氢反应在氢醇介质中进行，如之前在实施例1中对于乙酸化物分子所述的和如图示在图1的方案b)中的(其中R为CH3)。在应用场循环(如之前在实施例1中所述的进行)之后，分别在水解(如之前在实施例1中所述的进行)之前(图3c)和之后(图3d)得到与用乙烯酯所观察的相当的羧化物碳原子的13C-极化。
实施例3：从炔丙基酯中制备[1-13C]-超极化丙酮酸化物：在水性介质和甲醇/CDCl3中进行[1-13C]-超极化
丙酮酸炔丙基酯的合成
使用Dean-Stark装置，在催化量的p-TsOH(0.32g,1.7mmol)下，在C6H6(120cm3)中加热回流丙酮酸(3.00g,34.1mmol)和炔丙醇(2.29g,40.9mmol)4小时。使该反应冷却至室温，并用饱和的NaHCO3(2×100mL)洗涤，然后用水(2×100mL)洗涤。收集有机层并干燥(无水Na2SO4)，过滤并浓缩，得到呈无味可流动黄色油状物的粗产物(2.08g，49％)，其无需进一步纯化。
[1-13C]-超极化丙酮酸化物的制备
在水性介质中制备[1-13C]-超极化烯丙基酯
在氢醇氢化介质(15％的甲醇水溶液)中，使用水溶性催化剂[Rh(NBD)phos][BF4](2.5mM氘化水溶液)进行丙酮酸炔丙基酯的仲氢化。
在NMR管中进行仲氢化反应，该NMR管配备有Young阀，装有0.3ml的催化剂、0.03mmol的底物(3μl，浓度约70mM)、0.05ml的甲醇和8bar的仲氢(在77K下富集，50％富集)。
在90℃下温热该溶液之后，将NMR管强力振摇10″，然后放入μ-金属磁场屏蔽中，并且在约5″内从该屏蔽连续慢慢地取出。然后，在600MHz Bruker光谱仪中立即获得13C-NMR光谱。得到如图1方案b中图示的[1-13C]-超极化丙酮酸烯丙基酯，其中R＝CH3-CO。
在应用场循环之后立即获得的13C光谱(图4所示)中，羰基位点的三个信号明显可见，归属于丙酮酸烯丙基酯(160ppm：图4的结构a))、水合形式(172ppm：结构b))和半缩醛(171ppm：结构c))。半缩醛应归于15％的甲醇水溶液的存在，加入其以促进底物在水中的溶出和改善催化剂效率，促进了半缩醛的形成。
在甲醇中制备[1-13C]-超极化烯丙基酯
然后，在作为反应溶剂的甲醇中，使用市售催化剂[Rh(COD)dppb][BF4](COD＝环-1,5-辛二烯、dppb＝1,4-双(二苯基膦基)丁烷)进行仲氢反应。在配备Young阀的NMR管中进行仲氢化反应，该NMR管装有2mg的催化剂和0.4ml的甲醇-d3。通过氢化配位的COD活化催化剂，然后加入3μl的底物，并且用8bar的仲氢(在77K下富集，50％富集)对NMR管加压。
在室温下温热该溶液之后，将NMR管强力振摇10″，如实施例1所述应用磁场循环，然后获得13C光谱。如从图6所示记录的光谱可以看出的，大部分极化的产品是丙酮酸酯的缩醛形式，具有图5的结构。
在甲醇/CDCl3中[1-13C]-超极化烯丙基酯的制备
然后，在有机介质中进行炔丙基-丙酮酸酯的仲氢化反应，所述有机介质能够受益于[1-13C]-超极化丙酮酸酯的相转移萃取，允许除去氢化催化剂和减少最终水性混合物中任选的醇(或水混溶性)共溶剂的量至基本上不可检测值，从而得到期望的[1-13C]-超极化丙酮酸酯的基本上无杂质水溶液。
更特别地，在甲醇/CDCl3混合物(75μl甲醇和500μl CDCl3)中，用市售[双(二苯基膦基丁烷)(1,5-环辛二烯)]Rh(I)作为氢化催化剂进行炔丙基-丙酮酸酯的仲氢化反应。在配备Young阀的NMR管中进行仲氢化反应，所述NMR管装有2mg的催化剂和0.05ml的甲醇-d3。通过氢化配位的二烯活化该催化剂，然后加入CDCl3和底物(在25μl的甲醇中的3μl炔丙基酯)，并用8bar的仲氢(para-H2)对管加压。在90℃下温热该溶液之后，将NMR管强力振摇10″，得到缩醛形式(由于溶液中的甲醇)的图10(1H-NMR光谱)和11(13C-NMR光谱)的仲氢化中间体。然后，用第二个量的丙酮酸炔丙基酯重复如上所述实验，其中在90℃下温热该溶液并振摇该NMR管10″之后，如实施例1所述应用磁场循环，得到[1-13C]-超极化酯。然后，通过向维持在约90℃的反应混合物中加入0.5ml的NaOD 1M进行超极化酯的碱性水解。优选地，通过快速注射NaOD水溶液到有机相进行加入，从而得到期望的两种有机相和水相的快速混合。
然后，通过加入0.5ml的DCl使得到的碱性溶液恢复酸性pH(pH 4)。之后，收集水相，并在约168ppm立即记录无杂质的丙酮酸化物的13C极化信号的13C光谱(图7，光谱c))。
为了在体内应用中可以使用所收集的超极化丙酮酸化物的水溶液，必须适当地缓冲该水溶液至生理学pH(pH～7)。然而，例如通过加入DCl将超极化丙酮酸化物(在加入NaOD(1M)之后得到的)的碱性溶液优选首先酸化至酸性pH，如上所述，以使α-去质子化的丙酮酸化物及其相应水合形式(任选地在碱性(pH>8)水解条件下形成)恢复丙酮酸化物分子的甲基。然后，例如用磷酸盐缓冲液0.1M将该酸性溶液适当地缓冲至pH～7，从而得到超极化丙酮酸化物的无杂质且生理学可接受的溶液，备用于体内应用。
实施例4：[1-13C]超极化TFA-甘氨酸乙酯的制备：在MeOH和丙酮中进行[1-13C]-超极化
a)底物分子的合成
i)2-(2,2,2-三氟乙酰氨基)乙酸(如Tetrahedron,2003,59,9019-9029中所述制备)。
在0℃下，向2g(25.5mmol)的甘氨酸在6mL的30％w/w甲醇钠的甲醇溶液中的搅拌悬浮液中加入10mL(51.10mmol)的三氟乙酸乙酯。然后，使温度慢慢地升高至室温，并搅拌该溶液4小时。然后，蒸发甲醇，将残余物分配在HCl 1M水溶液和乙醚之间。用乙醚(2×100mL)萃取有机相，并用盐水(3×100mL)洗涤合并的有机层，经Na2SO4干燥，并在减压下蒸发溶剂。得到白色固体(3.61g，79％)，使用其而无需进一步纯化。
NMR表征：1H NMR(丙酮-d6 400MHz)d 8.90(1H,bs,NH),4.06(2H,d,J＝5.86Hz,CH2)
13C NMR(丙酮-d6,100MHz)d 169.7[C,COOH],158.0[C,q,2JC-F＝36.8Hz,COCF3],117.0[C,q,JC-F＝285.3Hz,COCF3]41.4[CH2].
19F NMR(丙酮-d6 376MHz)d-76.44
ii)2-(2,2,2-三氟乙酰氨基)乙酸乙烯酯(TFA-Gly-OVinyl)(如例如在Org.Process Research and Development,2009,13,706-709中所公开的制备。
在氩气氛下，向从步骤i)得到的中间体化合物(1.30g，7.60mmol)在15mL的乙酸乙烯酯中的搅拌悬浮液中，加入Pd(OAc)2(0,02g,0.08mmol)和KOH(0.04g,0.76mmol)。在室温下，搅拌该溶液过夜。然后，用水淬灭该混合物，并加入乙醚。用乙醚(2×50mL)萃取水相，用盐水(3×50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并蒸发溶剂。然后，使用乙醚/石油醚(40/60)作为洗脱液在硅胶上纯化粗反应物，得到呈浅黄色固体的期望产物(0.37g，25％)。
NMR表征：
1H-NMR(丙酮-d6 400MHz)d 9.00(1H,s,NH),7.26(1H,ddJcis＝6.16Hz,Jtrans＝13.76Hz CH),4.93(1H,Jtrans＝13.76Hz,CH2),4.68(1H,d,Jcis＝6.16Hz,CH2),4.25(2H,d,J＝4.25,CH2)
13C-NMR(丙酮-d6,100MHz)d 166.6[C,COOVinyl],158.3[C,2JC-F＝36.7Hz,COCF3],141.8[CH],116.9[C,JC-F＝285.2Hz,COCF3],99.0[CHCH2],41.5[NHCH2]
19F NMR(丙酮-d6 376MHz EK 492)d-76.5
b)在丙酮和甲醇中三氟-乙酰甘氨酸乙烯基-酯的仲氢化
根据下述反应方案，在丙酮或甲醇中进行如上所述得到的三氟-乙酰基乙烯基-甘氨酸1的氢化反应：
使用两种溶剂、市售氢化催化剂[Rh(COD)dppb]，并且在两种情形下按照如实施例3所述在甲醇中制备[1-13C]-超极化烯丙基酯已经使用的方法。在应用场循环之后，在两种溶剂中都观察到13C极化的羰基信号(167ppm)，例如在从甲醇中进行的氢化反应记录的图8的13C-NMR光谱中观察到的。
实施例5：从炔丙基酯中制备[1-13C]-超极化甘氨酸：在甲醇/CDCl3混合物中进行[1-13C]-超极化
a)丙-2-炔基2-(2,2,2-三氟乙酰氨基)乙酸酯(TFA-Gly-OPropargyl)的制备(根据例如J.Org.Chem,2009,74,3406-3413制备)
在氩气氛下，将0.2mL(3.51mmol)的炔丙醇和0.02g(0.18mmol)的DMAP((二甲基氨基)吡啶)加入到化合物1在无水二氯甲烷中的搅拌溶液中。温度降低至0℃，并加入2.63g(2.63mmol)的DCC(二环己基碳二亚胺)。慢慢地升高温度直至室温，并搅拌该溶液3小时。过滤出形成的白色沉淀，并在减压下蒸发二氯甲烷。使用乙醚/石油醚(50:50)作为洗脱液在硅胶上纯化粗物质，得到0.25g(68％)呈白色固体的期望产物。
NMR表征：
1H-NMR(丙酮-d6 400MHz,EK 473)d 8.89(1H,bs,NH),4.79(2H,d,J4＝2.36Hz,COOCH2),4.17(2H,d,J＝5.88,NHCH2),3.05(1H,t,J4＝2.36Hz,CH)
13C-NMR(丙酮-d6,100MHz,EK 473)d 168.4[C,COO-炔丙基],158.3[C,2JC-F＝36.7Hz,COCF3],116.9[C,q,JC-F＝285.2Hz,COCF3],78.2[C,CCH],76.8[CH,CCH],53.3[CH2,COOCH2],41.5[CH2,NHCH2]
19F NMR(丙酮-d6 376MHz EK 492)d-76.4
b)[1-13C]-超极化甘氨酸的无杂质水溶液的制备
反应方案：
使用与实施例3中所述在甲醇/CDCl3中制备[1-13C]-超极化烯丙基酯的相同方法，用200μl的甲醇-d3代替75μl，在甲醇/CDCl3混合物(200μl/500μl)中，使用商用催化剂[Rh(COD)dppb]对得到的TFA-Gly-OPropargyl 1实施仲氢化。在应用场循环之后，通过加入1mlNaOD 2M进行[1-13C]-超极化TFA-Gly-OAllyl酯的水解，以除去氢化酯部分(即，烯丙基醇)和保护基TFA(三氟乙酸)。然后，记录直接收集的水相的13C-NMR光谱，显示在图9中。在记录的光谱中在181ppm下观察到13C极化信号，对应于[1-13C]-超极化游离甘氨酸(无杂质)。有趣地是，尽管在[1-13C]-超极化甘氨酸的氢化酯水解和相转移萃取之后直接收集的水相中记录，但是所记录的光谱没有任何可检测的杂质，包括作为氢化共溶剂使用的甲醇的任何仪器可检测的残余物。
实施例6：在水性介质中制备[1-13C]超极化乳酸化物
a)底物分子2-乙酰氧基-丙酸乙烯酯(乳酸乙烯酯)的制备
在氮气氛下，向2-乙酰氧基-丙酸(3.0g,23mmol)在66mL的乙酸乙烯酯中的搅拌悬浮液中加入Pd(OAc)2(0,076g,0.34mmol)和KOH(0.200g,3.5mmol)。在室温搅拌该液体48小时。然后，将该混合物用水淬灭，过滤催化剂，并加入乙醚。用乙醚(3×40mL)萃取水相，用盐水(3×50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并蒸发溶剂。然后，使用乙醚/石油醚(1/4)作为洗脱液在硅胶上纯化粗物质，得到呈浅黄色油状物的期望产物(0.579g，16％)。
1H-NMR(CDCl3 400MHz)7.2(1H,dd,CH2),5.1(1H,q,CH)4.95(1H,d CH),4.65(1H,dCH2),2.12(3H,s,CH3),1.5(3H,d,CH3).
13C-NMR(CDCl3,100MHz)d 171[C,COOVinyl],168[C,COOCH3],141[CH],100[CHCH2],67[CH],20[CH3],17[CH3]
b)[1-13C]-超极化乳酸乙酯的制备
反应方案：
根据实施例1中制备乙酸化物的[1-13C]-超极化乙酯所报道的相同方法，使用0.05ml的丙酮代替甲醇，用水溶性催化剂[Rh(NBD)phos][BF4]在水中进行2-乙酰氧基-丙酸乙烯酯(1)的仲氢化。
在应用磁场循环之后，观察2-乙酰氧基-丙酸乙酯(3)的13C极化的羰基信号(173ppm)(图12上面光谱)。
c)[1-13C]-超极化乳酸化物的制备
为了得到相应[1-13C]-超极化乳酸化物，用第二个量的乙烯基酯(1)重复如上所述仲氢化反应，并通过在场循环过程之后立即加入0.05ml的NaOD 12M水解得到的[1-13C]-超极化酯。然后，通过加入0.05ml的DCl 12M酸化得到的溶液，并立即获得13C-NMR光谱。图12(下面部分)报道了得到的乳酸化物的13C-NMR光谱，其中在177.5ppm可检测到乳酸化物的13C-超极化信号。

Claims (23)

1.一种用于制备含[1-13C]-超极化羧化物分子的仲氢诱导极化方法，所述含[1-13C]-超极化羧化物分子为式(I)或其生理学可接受的盐，
R-C*(O)-OH (I)
其中
C*表示进行13C超极化的羧化物碳原子；
R为C1-C5直链或支链烷基链，其任选地插入一个或多个下述基团或被一个或多个下述基团取代：羰基(-CO-)、羟基(-OH)、式-NHR1的基团、卤素原子和卤代-烷基、或碳环脂肪族或芳族环，所述碳环脂肪族或芳族环又任选地被一个或多个羟基取代；
R1为H或氨基保护基，选自三氟乙酰基、乙酰基、苯甲酰基、苄酯基、叔丁基碳酸酯基，
所述方法包括用分子仲氢氢化所述含羧化物分子的不饱和的C2-C4烯基或炔基酯，所述烯基或炔基的残基选自式-CH2-CH＝CH2的烯丙基和式-CH2-C≡CH的炔丙基。
2.根据权利要求1的方法，其中R选自直链或支链的C1-C5烷基、甲基羰基、羟乙基、和式R2-CH(NHR1)-的氨基烷基，其中R1为H且R2为H或C1-C4直链或支链烷基链，其任选地被羟基、苯基、或羟苯基环取代。
3.根据权利要求2的方法，其中R为甲基。
4.根据权利要求2的方法，其中R为甲基羰基。
5.根据权利要求2的方法，其中R为式R2-CH(NHR1)-的氨基烷基残基，其中R1和R2为如权利要求2中定义的。
6.根据权利要求2的方法，其中R为式CH3CH(OH)-的羟乙基残基。
7.根据前述权利要求1-6中任一项的方法，其包括步骤：
a)获得感兴趣的含羧化物分子的不饱和的烯基或炔基酯，并使所述不饱和的酯与分子仲氢反应，得到相应仲氢化酯；
b)诱导所加入极化的氢极化转移至所述仲氢化酯的所述[1-13C]-羧化物碳原子，以得到相应[1-13C]-超极化酯；
c)除去氢化的酯部分，并收集含[1-13C]-超极化羧化物的分子或相应[1-13C]-超极化羧酸的水溶液。
8.根据权利要求7的方法，其中所述步骤a)包括在水性溶剂中且在水溶性氢化催化剂的存在下，使所述不饱和的酯与分子仲氢反应，所述水性溶剂任选包含10％至30％的量的水溶性有机溶剂，所述水溶性有机溶剂选自短链醇或丙酮。
9.根据权利要求8的方法，其中所述氢化催化剂选自式[Rh(二膦)二烯)]+[阴离子]-的铑复合物，其中所述二膦为选自(1,4-双(R1R2)乙烷)和(1,4-双(R1R2)丁烷)的螯合膦。
10.根据权利要求9的方法，其中R1和R2彼此相同或不同，为选自DPPETS、DPPBTS和DAPBTS的磺化基团、选自磺化的CHIRAPHOS和磺化的BINAP的手性磺化的二膦；所述二烯选自1,5-环辛二烯和降冰片二烯，并且所述阴离子可以为任何阴离子。
11.根据权利要求7的方法，其中所述步骤a)包括在有机溶剂或合适的有机溶剂混合物中，且在溶于有机溶剂且不溶于水性溶剂的氢化催化剂的存在下，使所述不饱和的酯与分子仲氢反应。
12.根据权利要求11的方法，其中所述氢化催化剂选自式[Rh(二膦)二烯)]+[阴离子]-的铑复合物，其中所述二膦选自1,4-双(二苯膦基)丁烷、1,2-双(二苯膦基)乙烷、及其衍生物，所述衍生物包括：手性膦2,2’-双(二苯膦基)-1,1’-联萘(binaftyl)、2,3-二苯膦基丁烷、1,4-双(二苯膦基)-1,4-双脱氧-2,3-O-异亚丙基-L-苏糖醇(treitol)和1,2-双[(2-甲氧基苯基)(苯膦基)]乙烷；所述二烯选自1,5-环辛二烯和降冰片二烯，并且所述阴离子为任何阴离子。
13.根据权利要求11或12中任一项的方法，其中所述有机溶剂为选自下述的有机氯化溶剂：氯仿、二氯甲烷、四氯化碳及其混合物、及含有10％至30％的短链醇或丙酮的这些溶剂的混合物，并且所述氢化催化剂为[Rh(COD)dppb][BF4]，其中COD为环-1,5-辛二烯且dppb为1,4-双(二苯膦基)丁烷)。
14.根据权利要求7的方法，其中步骤b)是通过将场循环步骤应用于所述方法的步骤a)得到的仲氢化酯，得到相应[1-13C]-超极化酯。
15.根据权利要求14的方法，其中所述方法的步骤c)包括水解步骤b)中得到的[1-13C]-超极化酯。
16.根据权利要求15中的方法，其中步骤c)是通过如下进行的：将步骤b)中得到的[1-13C]-超极化酯的有机溶液用水溶液稀释，该水溶液促进该酯水解成相应水溶性的含[1-13C]超极化羧化物的分子或相应羧酸，然后通过相转移萃取收集感兴趣的[1-13C]-超极化化合物的无杂质水溶液，其备用于体内应用。
17.根据权利要求8或9中任一项的方法，其中所述方法的步骤c)是通过如下进行的：向步骤b)中得到的[1-13C]-超极化酯的水溶液中加入促进其水解的碱，得到感兴趣的含[1-13C]-超极化羧化物的分子的水溶液。
18.根据权利要求17的方法，进一步包括步骤d)：包括从所述得到的水溶液中除去氢化催化剂和任选的有机溶剂，得到感兴趣的含[1-13C]-超极化羧化物的分子的水溶液，备用于体内应用。
19.式(II)的不饱和的烯基或炔基酯作为适合的可氢化底物前体在利用PHIP技术制备用于MR应用的诊断感兴趣的含[1-13C]-超极化羧化物分子中的用途，
R-C*(O)-O-R’ (II)
其中：
C*表示天然13C富集的，或任选地经过13C超极化的13C标记的羧化物碳原子；
R’为不饱和的C2-C4烯基或炔基，选自式-CH2-CH＝CH2的烯丙基和式-CH2-C≡CH的炔丙基；
R为C1-C5直链或支链烷基链，其任选地插入一个或多个下述基团或被一个或多个下述基团取代：羰基(-CO-)、羟基(-OH)、式-NHR1的基团、卤素原子、卤代-烷基、和碳环脂肪族环或芳族环，所述碳环脂肪族环或芳族环任选地被一个或多个羟基取代；
R1为H，或选自三氟乙酰基、乙酰基、苯甲酰基、苄酯基、叔丁基碳酸酯基的氨基保护基。
20.根据前述权利要求1的方法，其中所述感兴趣的含羧化物分子的不饱和的烯基或炔基酯为炔丙基酯。
21.根据权利要求19的用途，其中，式(II)中R’为炔丙基残基。
22.根据权利要求1的方法，其中所关注的含[1-13C]-超极化羧化物的分子是丙酮酸化物。
23.根据权利要求1的方法，其中所关注的含[1-13C]-超极化羧化物的分子是乳酸化物。
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