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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Kontrastmittels für die MR-Spektroskopie, die Verwendung von ungesättigten Nitrobenzol-Derivaten zur Herstellung eines solchen Kontrastmittels und ein Nitrobenzolderivat.
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Die Magnetresonanztomographie, MR, ist ein bildgebendes Verfahren, dass vor allem in der medizinischen Diagnostik zur Darstellung von Struktur und Funktion der Gewebe und Organe im Körper eingesetzt wird. Es ist auch zur Darstellung von dynamischen Prozessen in Tiefengewebeschichten geeignet. In Verbindung mit der Hyperpolarisation können detektierbare Signale um ein Vielfaches verstärkt werden, wodurch sich die Möglichkeiten, Erkrankungen zu erkennen, erhöhen. Jüngste Entwicklungen haben gezeigt, dass hyperpolarisierte Metaboliten in vivo injiziert werden können und deren Metabolismus detektiert werden kann. Durch den unterschiedlichen Metabolismus zum Beispiel in Tumorzellen, ist es möglich, durch hyperpolarisierte bildgebende Verfahren gesundes von erkranktem Gewebe zu unterscheiden. Die wichtigsten Verfahren, um Metaboliten zu hyperpolarisieren, basieren derzeit auf Techniken wie der „dynamic nuclear polarization“ (DNP) und der para-Wasserstoff induzierten Polarisation (PHIP). Bei der DNP wird die zu untersuchende Probe üblicherweise in Gegenwart von radikalen auf etwa 1K abgekühlt, so dass die Elektronenspinnpolarisation nahezu 100% beträgt. Wird die Probe mit Mikrowellen bestrahlt kann die Elektronenpolarisation übertragen werden auf „non-zero“ nuklear Spins wie 1H, 13C und 15N, die in vielen Biomolekülen und Metaboliten vorliegen. Nach der Kernspinpolarisation wird die Probe schnell aufgetaut und kann in vitro oder in vivo in eine Probe als Kontrastmittel injiziert werden. Im Hinblick auf PHIP kann das para-Isomer von Wasserstoff auf nahezu 100% durch Abkühlen des Gases auf 25K in Gegenwart eines Katalysators, wie Eisenoxid oder Aktivkohle, angereichert werden. Der para-Wasserstoff wird dann verwendet, um das zu untersuchende Substrat, das eine ungesättigte Bindung aufweist, zu hyperpolarisieren. Dazu ist es erforderlich, die ungesättigte Verbindung mit para-Wasserstoff in Gegenwart eines Katalysators (homogen oder heterogen) umzusetzen.
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Ein mögliches Verfahren wurde kürzlich vorgestellt, in welchem ein Metabolit an eine ungesättigte Seitenkette, die hyperpolarisiert werden kann, angebunden wird. Die Polarisation wird einen von 0 verschiedenen Spins (über den Zyklus des Magnetfeldes oder Radiofrequenzimpulse) im Metaboliten übertragen und die Seitenkette wird mittels Hydrolyse abgespalten. Das Polarisationsverfahren kann mit einem Katalysator in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt werden. Nach Zugabe von hydrolisierenden Substanzen in Wasser wird der Metabolit von der Seitenkette abgespalten und in die wässrige Phase extrahiert, der wasserunlösliche Katalysator wird anschließend abgetrennt. Die erhaltenen Metaboliten können anschließend als Kontrastmittel in bildgebenden Verfahren verwendet werden.
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Insbesondere bei Experimenten, in denen die Hydrolyse durchgeführt wird, bildet sich eine große Menge Salz, da eine Base üblicherweise zum Abspalten der Gruppe eingesetzt wird, die wiederrum mit einer Säure neutralisiert wird. Das Salz kann insbesondere bei einer Injektion in vivo eine Reaktion des Organismus hervorrufen, wie erhöhten Herzschlag, und kann auch das metabolische Verhaltes des Organismus verändern. Weiterhin ist nachteilig, wenn die oben beschriebenen Hyperpolarisationstechniken angewendet werden, dass das potentielle Kontrastmittel zunächst generiert wird und, sobald es mit einer Probe in vitro oder in vivo injiziert wurde, das chemische Verfahren sofort startet. Wenn inaktivierte Hyperpolarisationsmittel mit der zu untersuchenden Probe vermischt oder die Hyperpolarisation in situ gestartet und anschließend biologisch aktiv wird, kann eine höhere Messgenauigkeit des Transportmechanismusses oder der chemischen Reaktion erzielt werden. Hinzu kommt, dass Extraktionsverfahren, um die Kontrastmittel von Verunreinigungen, wie Katalysatoren oder Radikalen, abzutrennen, zu einem Verlust an Probenmenge und Filtertechniken können zu einem Verlust an Polarisation führen können.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, molekulare Schutzgruppen, die eine ungesättigte Bindung enthalten, welche für die Hyperpolarisation verwendet werden können und die nach Transfer der Hyperpolarisation auf ein biologisch aktives Substrat durch Photolyse abgespalten werden können.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist sinngemäß ein Verfahren zur Herstellung eines Kontrastmittels für die MR-Spektroskopie, welches die Verfahrensschritte umfasst.
- A) Hydrieren einer Verbindung mit der allgemeinen Formel (I)
in der
R1, R2, R3 und R4 gleich oder verschieden sein können und für H, eine C1-C6-Alkylgruppe, Alkoxygruppe oder Ethergruppe und Halogen stehen können, R5 für einen hydrierbaren Rest ausgewählt aus
steht, worin X für das Substrat steht,
mit H2-Gas, das mit para-Wasserstoff (p-1H2) angereichert ist, hydriert wird;
- B) Übertragen der Polarisation auf den Rest X;
- C) Unterwerfen der aus der Hydrierung erhaltenen Verbindung einer Photolyse, in welcher das Substrat abgespalten wird;
- D) Injizieren des so erhaltenen Kontrastmittels in das zu untersuchende Objekt.
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Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, ein biologisch aktives Substrat, das in bildgebenden Verfahren zur Verstärkung der Signale eingesetzt wird, zu Hyperpolarisieren, ohne das sich durch chemische Reaktionen Abfallprodukte bilden, beispielsweise Salze, die insbesondere bei in vivo-Untersuchungen Störungen oder Nebenwirkungen beim Patienten hervorrufen können.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung mit der oben dargestellten Formel I zur Herstellung eines Kontrastmittels für die MR-Spektroskopie.
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Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Verfahrensschritte A, B, C und D in einer beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die in Schritt B erhaltene hyperpolarisierte Verbindung zunächst in das zu untersuchende Objekt injiziert bzw. in die zu untersuchende Probe und anschließend wird die Photolyse gemäß Schritt C durchgeführt.
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In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Hyperpolarisation der Verbindung mit der Formel I in situ in dem zu untersuchenden Objekt, d. h. die Hyperpolarisation und die Photolyse erfolgen innerhalb des zu untersuchenden Objektes.
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Erfindungsgemäß werden Verbindungen mit der Formel I als sogenannte Schutzgruppen für die zu untersuchenden Substrate verwendet. Substrate sind üblicherweise biologisch aktive Verbindungen, wie zum Beispiel Metabolite, Peptide, Poteine, oder pharmazeutisch aktive Wirkstoffe. Diese Substrate enthaltene eine oder mehrere funktionelle Gruppen aus der Gruppe der Amine, Amide, Thiole, Thiosäuren oder Alkohole, welche entsprechend geschützt werden. Konkrete Beispiele sind: Ethanol, Acetat, Pyruvat, Alanin, Cystein, Thioessigsäure, Laktat, Glutamine, Peptide mit dem RGD- oder NGR-Motiv
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Um die ungesättigte Schutzgruppe möglichst vollständig mit para-Wasserstoff zu Hydrieren und die Polarisation auch auf das zu untersuchende Substrat übertragen zu können, ist es vorteilhaft, wenn die ungesättigte Bindung so nah wie möglich an den zu polarisierenden Zielkern ist. Die erfindungsgemäß verwendete Schutzgruppe ist eine Verbindung mit der Formel I. Diese Schutzgruppe enthält eine Nitrobenzolgruppe, X stellt das nach dem Hyperpolarisationsschritt abzuspaltende Molekül dar und R1, R2, R3 und R4 können gleich oder verschieden sein, und sind chemische Reste, die die libophyllizität oder hydrophyllizität erhöhen oder die Löslichkeit, in Abhängigkeit vom vorliegenden Lösungsmittelsystem, erniedrigen können. Außerdem können diese Gruppen verwendet werden, um die Vorstufe an einen festen Träger zu binden. Die Immobilisierungsverfahren werden weiter unten beschrieben.
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1 zeigt Moleküle, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können. In einem ersten Verfahrensschritt wird die Hydrierung mit para-Wasserstoff durchgeführt, um hyperpolarisierte Moleküle zu erhalten. Für diesen Verfahrensschritt sind Wilkinson-Katalysatoren bevorzugt, da diese selektiv die ungesättigte Bindung hydrieren nicht aber die Nitro-gruppen. In einem nachfolgenden Schritt wird die Polarisation von den Protonen auf den Nukleus im zu untersuchenden Substrat transferiert. Das Transferieren der Polarisation kann durch zyklisches Verändern von anliegenden Magnetfelder oder unter Verwendung von Pulsen mit Radiofrequenz efolgen. Nach dem Polarisationstransfer wird die Schutzgruppe durch Photolyse abgespalten. Bei der Photolyse ist eine hohe Quantenausbeute bevorzugt, um schnell das zu untersuchende Substrat generieren zu können. Die photolytische Abspaltung wird mit einer Lichtquelle durchgeführt, welche die Probe batchweise oder in einem kontinuierlichen Reaktor bestrahlt.
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Wie in der beigefügten 2 wiedergegeben ist, gibt es drei unterschiedliche Verfahrensweisen, in welchen die mittels Photolyse abspaltbaren Gruppen verwendet werden können (s. 2). Eine Schematische Übersicht über das Verfahren mit Abtrennung von ungewollten Verbindungen ist in 3 dargestellt. In einem ersten Schritt wird die Target-Struktur hyperpolarisiert, nachfolgend wird diese in die zu untersuchende Probe injiziert und die Photolyse wird durchgeführt. In einer zweiten Alternative kann die Hyperpolarisation in situ durchgeführt werden in einem System, dass die zu untersuchende Probe enthält und das zu polarisierende geschützte Substrat. In einer dritten möglichen Ausführungsform wird die photoaktivierbare Substanz hyperpolarisiert, anschließend wird die Photolyse durchgeführt, d. h. das Substrat abgespalten und in die Probe injiziert.
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In einer weiteren möglichen Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung werden die Reaktionsprodukte aus den Verfahrensschritten A und/oder B vor dem injizieren in das zu untersuchende Objekt bzw. in die Probe aufgereinigt, d. h. Verunreinigungen wie radikale oder Katalysatoren aus dem Substrat werden abgetrennt.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Substrate auf einem geeinigten Träger immobilisiert. Geeignete Träger können beispielsweise eine feste Oberfläche, Nanopartikel oder Polymere sein. Die Immobilisation der Substrate kann mit den abspaltbaren Gruppen, also in Form der Verbindungen mit der Formel I erfolgen.
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Die abspaltbaren Gruppen sind nicht auf die beschriebenen Reste, die durch Photolyse eliminiert sein können, beschränkt, sondern können auch andere funktionelle Gruppen sein, beispielsweise können Ester mittels Hydrolyse gespalten werden, um das zu untersuchende hyperpolarisierte Molekül freizusetzen. Verbindungsgruppen werden benötigt, um die Gruppen an die Oberfläche anzubinden und um ihnen eine Flexibilität und auch ein ausreichendes Maß an Bewegungsfreiheit zu ermöglichen. Dadurch sind lange longitudinale Relaxationszeiten des zu untersuchenden hyperpolarisierten Kerns zu Verfügung stellt. Eine lange Relaxationszeit ist erwünscht, weil dieses ein längeres Aufrechterhalten der Polarisation ermöglicht. Das zu untersuchende Substrat wird zunächst hyperpolarisiert. In dem Falle von PHIP wird ein löslicher Katalysator in einem Lösungsmittel mit dem immobilisierten zu untersuchenden Substrat gelöst. Nach zur Verfügung stellen von para-Wasserstoff findet die Hydrierung statt. Anschließend wird die Polarisation zyklischer Magnetfeldveränderung oder Radiofrequenspulsen transferiert. Um das noch immobilisierte Substrat von Verunreinigungen, wie dem Katalysator, abzutrennen, wird das verunreinigte Lösungsmittel über einen Filter ausgewaschen mit nicht verunreinigtem Lösungsmittel. Nach diesem Reinigungsschritt werden die zu untersuchenden Substrate vom festen Träger abgetrennt und filtriert, so dass das reine Substrat erhalten wird und in die Probe indiziert wird.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung mit der allgemeinen Formel II
worin
R
1, R
2, R
3 und R
4 gleich oder verschieden sein können und für H, eine C
1-C
6-Alkylgruppe, Alkoxygruppe oder Ethergruppe und Halogen stehen können und X für das Substrat steht.
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Die Verbindung mit der allgemeinen Formel II eignet sich besonders gut als Abgangsgruppe bzw. Schutzgruppe an das Substrat X.
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Die Verbindung mit der Formel II ist neu und aus dem Stand der Technik nicht bekannt.
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Ein mögliches Verfahren zur Herstellung dieser erfindungsgemäßen Verbindung II ist im nachfolgenden Reaktionsmechanismus dargestellt.
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Ausgangsverbindungen zur Herstellung von Verbindungen mit der Formel II sind vorzugweise Vinylderivative, wie Vinylester, Vinylthioester oder Vinylamide. Beispiele für geeignete Verbindungen sind nachfolgend dargestellt:
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Diese Vinylverbindungen werden mit elementarem Brom bromiert unter Bildung der Dibromoverbindung. Anschließend wird die Dibromoverbindung mit einer schwachen Base umgesetzt, beispielsweise mit K
2CO
3 or Trimethylamin, unter Bildung einer monobromierten ungesättigten Verbindung:
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Anschließend wird durch Reaktion mit Mg in Diethylglycol ein sogenanntes Grignard-Reagens gebildet, dass nach Reaktion mit Trimethylborat in THF und nachfolgendem Ansäuern mit HCl in eine Organoborsäure überführt wird:
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Die Organoborsäure wird in einer Suzuki-KupplungsReaktion mit 1-Bromo-2-nitrobenzol und z. B. cis,cis,cis-Tetrakis[(diphenylphosphanyl)methyl]cyclopentan; Kaliumcarbonat; Bis(3-allyl-µ-chloropalladium(II)) in Toluol unter Bildung des erfindungsgemäßen Produktes umgesetzt:
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Alternativ wird die Bildung von Ethern und Thioethern angestrebt. Als Reaktanden weden Allylether oder Allylthioether genutzt.
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Die Ether werden mit Allylbromid und tert-Butyllithium umgesetzt, um eine ungesättigte Bromoverbindung zu erhalten. Diese kann wie oben beschrieben dann weiter zum Nitrobenzolderivat umgesetzt werden.
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Die Immobilisierung der Nitrobenzolverbindungen kann zum Beispiel erfolgen durch Knüpfen einer Etherverbindung mit einer Oberfläche. Hierfür sollte einer der beschriebenen Reste R
1-R
4 eine Alkoholgruppe oder ein Halogen darstellen. Diese können jeweils mit einer Halogen oder Alkoholgruppe, welche mit eine Oberfläche (z.B. Siliciumoxid, Aluminiumoxide, Polymere) verbunden sind mittels eine Williamsonschen Ethersynthese verknüpft werden. Als Beispiel sei hier eine Immobiliserung auf einer Silicaoberfläche gezeigt.
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Alternativ kann anstatt der Nitrobenzolgruppe eine Etherverbindung mit einem spaltbaren Ester gebildet werden, der sich mittels Hydrolyse nach dem Hydrierungsvorgang abspalten lässt.
