CN104740655A - 一类具有高水合常数的核磁共振成像造影剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类具有高水合常数的核磁共振成像造影剂及其制备方法。所述的具有高水合常数的核磁共振成像造影剂是一类含有氮氧基团的钆(Ⅲ)配合物。用所述的钆(Ⅲ)配合物制备的核磁共振成像造影剂具有高的水合常数，较好的稳定性和高弛豫率。

Description

一类具有高水合常数的核磁共振成像造影剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一类具有高水合常数的核磁共振成像造影剂及其制备方法。

背景技术

氢核是人体成像的首选核种：人体各种组织中含有大量的水和碳氢化合物，所以氢核的核磁共振灵敏度高、信号强，这是人们首选氢核作为人体成像元素的原因。核磁共振(NMR)信号强度与样品中的氢核密度有关。人体中各种组织间含水比例不同，即含氢核数的多少不同，因此NMR信号强度有差异。利用这种差异作为特征量，把各种组织分开，这就是氢核密度的核磁共振图像。人体不同组织之间、正常组织与该组织中的病变组织之间的氢核密度、弛豫时间T₁、T₂三个参数的差异，是MRI用于临床诊断最主要的物理基础。

当施加一射频脉冲信号时，氢核能态发生变化，射频过后，氢核返回初始能态，共振产生的电磁波便发射出来。原子核振动的微小差别可以被精确地检测到，经过进一步的计算机处理，即可能获得反映组织化学结构组成的三维图像，从中我们可以获得包括组织中水分差异以及水分子运动的信息。这样，病理变化就能被记录下来。

人体2/3的重量为水，如此高的比例正是磁共振成像技术(MRI)能被广泛应用于医学诊断的基础。人体内器官和组织中的水分并不相同，很多疾病的病理过程会导致水分形态的变化，即可由磁共振图像反应出来。

MRI所获得的图像非常清晰精细，大大提高了医生的诊断效率，避免了剖胸或剖腹探查诊断的手术。由于MRI不使用对人体有害的X射线和易引起过敏反应的造影剂，因此对人体的损害非常小。MRI可对人体各部位多角度、多平面成像，其分辨力高，能更客观更具体地显示人体内的解剖组织及相邻关系，对病灶能更好地进行定位定性。对全身各系统疾病的诊断，尤其是早期肿瘤的诊断有很大的价值。

随着MRI在临床的广泛应用，人们对其寄予了更高的期望。其中，比较突出的一点是要求它能进一步提高对软组织的分辨率，使一些较小的病变得以显示，使一部分疑难病变得以定性。因此，可以提高MRI影像对比度的临床诊断试剂——MRI造影剂被引入临床。在目前的临床MRI中，超过30～40％的诊断需要使用造影剂。这些造影剂本身并不产生信号，但能通过改变体内局部组织中水质子的弛豫速率而提高正常与患病部位的成像对比度或显示体内器官的功能状态和血液流动，有助于早期发现病变、区别肿瘤和水肿等。对MRI造影剂的基本要求有：(1)高弛豫性能；(2)在动物体内低毒、稳定；(3)选择性分布；(4)水溶性好；(5)检查后易排出体外。

钆类造影剂是最早出现的造影剂，在当前临床使用的商业化造影剂中，钆(III)配合物应用最广泛。钆(III)是顺磁性最强的离子，与一些碳氢有机大分子螯合而稳定存在。为了获得更高的弛豫率，按照SBM理论的指导，水合常数q，配位水分子停留时间τ_M，电子弛豫时间τ_s以及旋转相关时间τ_R需要进一步优化。

水合常数显著地影响内层水质子的弛豫，它可以通过X射线结构分析、紫外-可见光谱和荧光寿命分析以及电子顺磁共振波谱等方法测算。当前商用的造影剂无论是以DTPA还是以DOTA为框架，q值均为1。因此，研究者希望可以发现在第一配位层有两个及以上的配位水分子来增进弛豫率，于是自然而然地想到六配位或者七配位配体。但是很快人们就发现这种配合物在水中很不稳定，与其配位的水分子会被一些小配体所取代而导致弛豫消失。同时钆(III)的游离也可能导致病人的重金属中毒。为此，形成高稳定性的钆配合物是制备高水合常数钆造影剂的关键点也是难点。

发明内容

本发明目的在于制备一类具有高水合常数(q)且稳定性良好的小分子核磁共振成像造影剂。为了达到上述目的，本发明制备的造影剂配体含有两个叔胺氮氧基团和四个羧基或是酰胺基团。上述结构如下：

以及：

本发明涉及的一类具有高水合常数的核磁共振成像造影剂的制备过程包含以下步骤：

(1)、按照European Journal of Inorganic Chemistry,2003,2003(4):737-743.的方法制备EDTAO₂，结构如下：

(2)、二胺四乙酸叔丁酯的制备，将丙二胺溶于溶剂，加入溴乙酸叔丁酯和碳酸钾，搅拌，40℃反应3天，得到粗产物，不经过进一步提纯。结构如下：

(3)、将(2)产物溶解在三氟乙酸中，无水无氧室温搅拌1天，得到粗产物；除去溶剂干燥后，用乙醚洗涤产物，得到产物二胺四乙酸；结构如下：

(4)、将(3)产物溶于乙酸和水的混合溶剂中，加入过氧化氢溶液，搅拌，室温反应3天，得到粗产物，除去溶剂，除水干燥后，用水/乙醇体系进行重结晶，得到含有叔胺氧化基团的化合物，结构如下：

(5)、将(4)或(1)得到的产物溶解在水和乙酸的混合溶液中，加入当量比是1:1～1:1.4的六水合氯化钆，pH保持3～5，75℃搅拌反应3天。除去溶剂，干燥后，用水\丙酮或是水\乙醇体系进行重结晶，到含有氮氧及叔胺氧化基团的钆配合物；结构如下：

(6)、乙二胺四乙酸酐的制备，将乙二胺四乙酸溶于吡啶中，加入乙酸酐，65℃搅拌反应3天，所得粗产物分别用乙酸酐、乙醚洗涤，得到乙二胺四乙酸酐，结构如下：

(7)、将(6)所得酸酐溶于DMF中，加入甲胺盐酸盐，在氮气气氛下50℃搅拌反应24小时，除去溶剂后所得粗产物用丙酮洗涤，并用水/丙酮体系重结晶，得到含有二酰胺二羧酸结构的化合物，结构如下：

(8)、将(7)所得产物溶于乙酸和水的混合溶剂中，加入过氧化氢溶液，搅拌，室温反应3天，得到粗产物，除去溶剂，除水干燥后，用水/乙醇体系进行重结晶，得到含有叔胺氧化基团的化合物，结构如下：

(9)、将(8)得到的产物溶解在水和乙酸的混合溶液中，加入当量比是1:1～1:1.4的六水合氯化钆，pH保持3～5，75℃搅拌反应3天。除去溶剂，干燥后，用水/乙醇体系进行重结晶，到含有氮氧及叔胺氧化基团的钆配合物，结构如下：

(10)、乙二胺四乙酸甲酯的制备，将乙二胺四乙酸溶于过量甲醇中，加入浓盐酸，在60℃下回流反应过夜，除去溶剂后用乙醚/饱和碳酸氢钠溶液进行洗涤萃取，得到乙二胺四乙酸甲酯，结构如下：

(11)、将(10)所得产物溶于甲醇中，逐滴加入甲胺的甲醇溶液，室温下搅拌反应1小时后，在60℃下回流反应3小时，除去溶剂后用丙酮洗涤得到产物，结构如下：

(12)、将(11)所得产物溶于乙酸和水的混合溶剂中，加入过氧化氢溶液，搅拌，室温反应3天，得到粗产物，除去溶剂，除水干燥后，用水/乙醇体系进行重结晶，得到含有叔胺氧化基团的化合物，结构如下：

(13)、将(12)得到的产物溶解在水和乙酸的混合溶液中，加入当量比是1:1～1:1.4的六水合氯化钆，pH保持3～5，75℃搅拌反应3天。除去溶剂，干燥后，用水/乙醇体系进行重结晶，到含有氮氧及叔胺氧化基团的钆配合物，结构如下：

(14)、造影剂分子水合常数q的测定：与铕配合的配体分子的荧光衰减曲线由BioTek Synergy^TM HT多功能酶标仪测得，将配体分子与金属铕配位后，定量溶解在氘水与水比例不同的混合溶剂中，得到分子荧光衰减曲线后经拟合计算得到不同溶剂条件下分子的荧光寿命(τ)，由分子荧光寿命的倒数对氘水在溶剂中含量作图，直线拟合利用外推法得到分子在纯氘水中的荧光寿命的倒数通过公式：

${{q=1.05[\mathrm{\τ}}_{H_{2}O}}^{-1}-{{\mathrm{\τ}}_{D_{2}O}}^{-1}]$

计算得出分子水合常数q。

通过水合常数q的测定测得的EDTAO₂与Eu的配合物的水合常数为3.27，说明了所合成造影剂分子具有较高的水合常数。

(15)、核磁共振成像及弛豫率测试：成像效果及弛豫率用西门子Trio 1.5T磁共振成像设备进行测定，先将钆配合物按浓度梯度稀释，盛放在1.5ml的离心管中，在1.5T场强下采用反转恢复法进行核磁共振成像，通过图像的亮度可以计算出每个浓度溶液的纵向弛豫时间(T1)，再通过公式：

c·r₁+1/T_W＝1/T₁

计算出每个浓度下T₁(其中c为钆含量，T_W为水分子的纵向弛豫时间)，最后通过计算机拟合得到造影剂的弛豫率r₁。其中钆含量利用全谱直读等离子体发射光谱(ICP-AES)进行测定。

通过核磁共振成像实验测得的r₁＝8.9mM^-1s^-1，r₁＝10.1mM^-1s^-1等，为商用Gd-DTPA(马根维显r₁＝4.9mM^-1s^-1)的1.81,1.96倍等。这种含有叔胺氮氧基团的钆配合物具有较高的弛豫率，且合成和提纯方法较为简洁，为以后的实验生产奠定了基础。

附图说明

图1为按照实施例1得到的核磁共振成像造影剂纵向弛豫时间(T₁)的倒数随钆浓度的变化图。

图2为按照实施例2得到的核磁共振成像造影剂纵向弛豫时间(T₁)的倒数随钆浓度的变化图。

图3为按照实施例3得到的核磁共振成像造影剂纵向弛豫时间(T₁)的倒数随钆浓度的变化图。

图4为按照实施例4得到的核磁共振成像造影剂纵向弛豫时间(T₁)的倒数随钆浓度的变化图。

图5为按照实施例5得到的核磁共振成像造影剂纵向弛豫时间(T₁)的倒数随钆浓度的变化图。

图6为按照实施例2得到的氘水与水比例不同的混合溶剂中的分子荧光衰减曲线。

图7为按照实施例2得到的分子荧光寿命的倒数对氘水在溶剂中含量的图，直线拟合图形。

具体实施方法

实施例1

(1)、间苯二甲胺四乙酸叔丁酯的制备。2.5g间苯二甲胺溶于40ml乙腈中，置于200ml圆底烧瓶中，称取25g碳酸钾，用研钵磨细，加入圆底烧瓶，补加40ml乙腈，40℃搅拌。称取15.6g溴乙酸叔丁酯，成滴缓慢滴入体系，滴加完毕后补加20ml乙腈，40℃反应3天。旋转蒸发溶剂，得到粗产物7.8g，比较纯净，故不进行进一步提纯。

(2)、间苯二甲胺四乙酸的制备。将得到的间苯二甲胺四乙酸叔丁酯粗产物2.2g置入50ml schlenk瓶中，抽真空置换氮气3次后，用注射器加入20ml三氟乙酸，室温，无水无氧条件下反应1天，脱去叔丁酯基团。除去溶剂后用无水乙醚洗涤，得到白色固体2.0g，即间苯二甲胺四乙酸。

(3)、氮氧化间苯二甲胺四乙酸的制备。将2.0g间苯二甲胺四乙酸溶于50ml乙酸和10ml水的混合溶剂中，置入250ml圆底烧瓶，再加入30wt％的过氧化氢水溶液50ml，在室温下反应3天，真空减压除去溶剂后得到浅黄色固体1.1g。再将其溶于10ml水中，加热至60℃，搅拌滴加丙酮至溶液稍有浑浊，冷却至室温后置入冰箱，有白色固体析出，得到340mg纯净产物。

(4)、钆配合物的制备。将340mg氮氧化间苯二甲胺四乙酸溶于20ml水和5ml乙酸混合溶剂中，在100ml三口烧瓶中加热至75℃，另将347mg六水和氯化钆溶于4ml水中，极缓慢滴加进入体系，滴加完毕后，在75℃条件下搅拌反应3天，真空减压除去溶剂后，得到的固体粗产物再次溶于10ml水中，过滤除去不溶部分，加热至75℃，滴加丙酮或乙醇至溶液稍有浑浊，冷却至室温后置入冰箱，有灰白色固体析出466mg，即为氮氧化间苯二甲胺四乙酸钆配合物。

(5)、核磁共振成像及弛豫率测试：成像效果及弛豫率用西门子Trio 1.5T磁共振成像设备进行测定，先将钆配合物按浓度梯度稀释，盛放在1.5ml的离心管中，在1.5T场强下采用反转恢复法进行核磁共振成像，通过图像的亮度可以计算出每个浓度溶液的纵向弛豫时间(T1)，再通过公式：

c·r₁+1/T_W＝1/T₁

计算出每个浓度下T₁(其中c为钆含量，T_W为水分子的纵向弛豫时间)，最后通过计算你和得到造影剂的弛豫率r₁＝10.1mM^-1s^-1。

实施例2

(3)、乙二胺四乙酸的氧化。5.8g乙二胺四乙酸二钠溶解于50ml乙酸中，置于200ml圆底烧瓶中，然后加入50ml 30wt％过氧化氢水溶液，在室温条件下搅拌，反应3天后真空减压除去溶剂，得到的浅黄色固体用水/乙醇(1:1)体系重结晶，得到白色固体5.2g。

(4)、将氮氧化乙二胺四乙酸210mg溶解于10ml水和2ml乙酸的混合溶剂中，75℃下搅拌。另将214.6mg六水合氯化钆溶于4ml水中，缓慢滴入反应体系，滴加完毕后，75℃反应3天，真空减压除去溶剂，得到的粗产物再用5ml水溶解，将不溶解的部分除去，80℃下滴加乙醇，至溶液稍有浑浊，体系冷却至室温并置入冰箱，有灰白色固体析出。得到152mg产物。

(5)、造影剂分子水合常数q的测定：将氮氧化乙二胺四乙酸578mg与653mg的六水合氯化铕在10ml水和1ml乙酸，75℃下反应3天得到配合物。分别配置氘水和水比例为8：2，6：4，5：5，4：6，2：8，0：1配合物浓度为5mM的溶液，分别由BioTekSynergy^TM HT多功能酶标仪测得其荧光衰减曲线，得到分子荧光衰减曲线后经拟合计算得到不同溶剂条件下分子的荧光寿命，由分子荧光寿命的倒数对氘水在溶剂中含量作图，直线拟合利用外推法得到分子在纯氘水中的荧光寿命的倒数通过公式：

${{q=1.05[\mathrm{\τ}}_{H_{2}O}}^{-1}-{{\mathrm{\τ}}_{D_{2}O}}^{-1}]$

计算得出分子水合常数q。

通过水合常数q的测定测得的EDTAO₂的铕配合物的水合常数为3.27。

(6)、核磁共振成像及弛豫率测试：成像效果及弛豫率用西门子Trio 1.5T磁共振成像设备进行测定，先将钆配合物按浓度梯度稀释，盛放在1.5ml的离心管中，在1.5T场强下采用反转恢复法进行核磁共振成像，通过图像的亮度可以计算出每个浓度溶液的纵向弛豫时间(T1)，再通过公式：

c·r₁+1/T_W＝1/T₁

计算出每个浓度下T₁(其中c为钆含量，T_W为水分子的纵向弛豫时间)，最后通过计算你和得到造影剂的弛豫率r₁＝8.9mM^-1s^-1。

实施例3

(1)、用1,3-丙二胺替代间苯二甲胺：其余同实施例1。测得r₁＝9.8mM^-1s^-1

实施例4

(1)、用1,4-二氨基丁烷替代间苯二甲胺：其余同实施例1。测得r₁＝8.5mM^-1s^-1。

实施例5

乙二胺四乙酸酐的制备。将5g乙二胺四乙酸溶于8mL吡啶中，搅拌分散后加入9.6mL乙酸酐，在65℃下搅拌回流反应24小时，反应结束后加入适量丙酮析出沉淀物，并分别用乙酸酐、乙醚洗涤沉淀物，得到4.6g白色固体产物。

乙二胺二乙酸二乙酰甲胺的制备。将2.56g上步产物与1.35g甲胺盐酸盐置于50mL的schlenk瓶中，抽真空换氮气三次后，用注射器加入20mL的DMF，在50℃下反应24小时，加压蒸馏除去溶剂后，用丙酮洗涤粗产物，并用水/丙酮体系重结晶，得到1.5g白色固体产物。

氮氧化乙二胺二乙酸二甲酰胺的制备。将1g上步产物溶于10mL乙酸和10mL水的混合溶剂中，加入30wt％的过氧化氢水溶液20mL，室温下搅拌反应3天，抽真空除去溶剂后，用水/乙醇体系进行重结晶，得到350mg的白色固体产物。

钆配合物的制备。将350mg的上步产物溶于8mL水和2mL乙酸的混合溶剂中，在100ml三口烧瓶中加热至75℃，另将369mg六水和氯化钆溶于4ml水中，极缓慢滴加进入体系，滴加完毕后，在75℃条件下搅拌反应3天，反应结束后，用2M的氢氧化钠水溶液调剂体系的pH至9左右，滤去不溶物后，抽真空除去溶剂并用水/乙醇体系进行重结晶，得到白色固体产物。

(5)、核磁共振成像及弛豫率测试：成像效果及弛豫率用西门子Trio 1.5T磁共振成像设备进行测定，先将钆配合物按浓度梯度稀释，盛放在1.5ml的离心管中，在1.5T场强下采用反转恢复法进行核磁共振成像，通过图像的亮度可以计算出每个浓度溶液的纵向弛豫时间(T1)，再通过公式：

c·r₁+1/T_W＝1/T₁

计算出每个浓度下T₁(其中c为钆含量，T_W为水分子的纵向弛豫时间)，最后通过计算你和得到造影剂的弛豫率r₁＝7.3mM^-1s^-1。

实施例6

乙二胺四乙酸甲酯的制备。将7.56g乙二胺四乙酸溶于130mL甲醇中，加入4mL浓盐酸，在60℃下回流反应过夜，旋蒸除去溶剂后，用乙醚/饱和碳酸氢钠水溶液进行洗涤萃取，收集有机层并用碳酸钾干燥，除去溶剂后得到7.4g无色油状产物。

乙二胺四乙酰甲胺的制备。将2.5g上步产物溶于20mL甲醇中，逐滴加入甲胺甲醇溶液14mL，在室温下搅拌1小时后，在60℃下回流反应3小时，旋蒸除去溶剂用丙酮洗涤粗产物，得到2.3g白色固体产物。

氮氧化乙二胺四乙酰甲胺的制备。将1.8g上步产物溶于20mL乙酸和20mL水的混合溶剂中，加入30wt％的过氧化氢水溶液40mL，室温下搅拌反应3天，抽真空除去溶剂后，用水/乙醇体系进行重结晶，得到1g的白色固体产物。

钆配合物的制备。将500mg的上步产物溶于10mL水和2mL乙酸的混合溶剂中，在100ml三口烧瓶中加热至75℃，另将592mg六水和氯化钆溶于5ml水中，极缓慢滴加进入体系，滴加完毕后，在75℃条件下搅拌反应3天，反应结束后，用2M的氢氧化钠水溶液调剂体系的pH至9左右，滤去不溶物后，抽真空除去溶剂并用水/乙醇体系进行重结晶，得到白色固体产物。

(5)核磁共振成像及弛豫率测试：成像效果及弛豫率用西门子Trio 1.5T磁共振成像设备进行测定，先将钆配合物按浓度梯度稀释，盛放在1.5ml的离心管中，在1.5T场强下采用反转恢复法进行核磁共振成像，通过图像的亮度可以计算出每个浓度溶液的纵向弛豫时间(T₁)，再通过公式：

c·r₁+1/T_W＝1/T₁

计算出每个浓度下T₁(其中c为钆含量，T_W为水分子的纵向弛豫时间)，最后通过计算你和得到造影剂的弛豫率。

Claims (3)

1.一类具有高水合常数的造影剂结构如下：

以及：

2.根据权利要求1所述的高水合常数的核磁共振成像造影剂，其特征在于，分子中含有两个及以上的氧化叔胺基团，其中的氧原子参与与钆(Ⅲ)离子的配位，从而形成一类具有高水合常数的钆(Ⅲ)配合物。

3.根据权利要求1或2所述造影剂的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)、二胺四乙酸叔丁酯的制备，将二胺溶于溶剂，加入溴乙酸叔丁酯和碳酸钾，搅拌，40℃反应3天，得到粗产物，不经过进一步提纯；结构如下：

(2)、将二胺四乙酸叔丁酯溶解在三氟乙酸中，无水无氧室温搅拌1天，得到粗产物；除去溶剂干燥后，用乙醚洗涤产物，得到二胺四乙酸；结构如下：

(3)、将二胺四乙酸溶于乙酸和水的混合溶剂中，加入过氧化氢溶液，搅拌，室温反应3天，得到粗产物，除去溶剂，除水干燥后，用水/乙醇体系进行重结晶，得到含有氧化叔胺基团的化合物，结构如下：

(4)、将(3)得到的产物溶解在水和乙酸的混合溶液中，加入当量比是1:1～1:1.4的六水合氯化钆，pH保持3～5，75℃搅拌反应3天；除去溶剂，干燥后，用水\丙酮或是水\乙醇体系进行重结晶，得到含有羧酸及氧化叔胺基团配体的钆配合物；结构如下：

(5)、乙二胺四乙酸酐的制备，将乙二胺四乙酸溶于吡啶中，加入乙酸酐，65℃搅拌反应3天，所得粗产物分别用乙酸酐、乙醚洗涤，得到乙二胺四乙酸酐，结构如下：

(6)、将(5)所得酸酐溶于DMF中，加入甲胺盐酸盐，在氮气气氛下50℃搅拌反应24小时，除去溶剂后所得粗产物用丙酮洗涤，并用水/丙酮体系重结晶，得到含有二酰胺二羧酸结构的化合物，结构如下：

(7)、将(6)所得产物溶于乙酸和水的混合溶剂中，加入过氧化氢溶液，搅拌，室温反应3天，得到粗产物，除去溶剂，除水干燥后，用水/乙醇体系进行重结晶，得到含有氧化叔胺基团的化合物，结构如下：

(7)、将(6)得到的产物溶解在水和乙酸的混合溶液中，加入当量比是1:1～1:1.4的六水合氯化钆，pH保持3～5，75℃搅拌反应3天；除去溶剂，干燥后，用水/乙醇体系进行重结晶，到含有羧酸、酰胺及氧化叔胺基团配体的钆配合物，结构如下：

(8)、乙二胺四乙酸四甲酯的制备，将乙二胺四乙酸溶于过量甲醇中，加入浓盐酸，在60℃下回流反应过夜，除去溶剂后用乙醚/饱和碳酸氢钠溶液进行洗涤萃取，得到乙二胺四乙酸甲酯，结构如下：

(9)、将(8)所得产物溶于甲醇中，逐滴加入甲胺的甲醇溶液，室温下搅拌反应1小时后，在60℃下回流反应3小时，除去溶剂后用丙酮洗涤得到产物，结构如下：

(10)、将(9)所得产物溶于乙酸和水的混合溶剂中，加入过氧化氢溶液，搅拌，室温反应3天，得到粗产物，除去溶剂，除水干燥后，用水/乙醇体系进行重结晶，得到含有氧化叔胺基团的化合物，结构如下：

(11)、将(10)得到的产物溶解在水和乙酸的混合溶液中，加入当量比是1:1～1:1.4的六水合氯化钆，pH保持3～5，75℃搅拌反应3天。除去溶剂，干燥后，用水/乙醇体系进行重结晶，到含有酰胺及氧化叔胺基团配体的钆配合物，结构如下：