CN102614531B - 以二乙酰基苯或三乙酰基苯为连接体的多核非离子型磁共振成像造影剂 - Google Patents

以二乙酰基苯或三乙酰基苯为连接体的多核非离子型磁共振成像造影剂 Download PDF

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Abstract

以二乙酰基苯或三乙酰基苯为连接体的多核非离子型磁共振成像造影剂，涉及磁共振成像造影剂领域。解决现有技术中的造影剂采用柔性链连接基团而导致弛豫效率低和热力学稳定性差的问题。该造影剂是在是在刚性连接基团二乙酰基苯或三乙酰基苯上同时分别共价连接两个或三个DO3A基团，再与顺磁性金属离子Gd3+配合而得到的。本发明的两种造影剂与现在临床应用的大环类造影剂Gd-DOTA、Gd-HP-DO3A相比，提高了40％以上，(Gd-DO3A)2-DAB的弛豫效率达到5.4mM-1s-1，(Gd-DO3A)3-TAB的弛豫效率达到6.1mM-1s-1，且具有良好的稳定性，毒性小。

Description

以二乙酰基苯或三乙酰基苯为连接体的多核非离子型磁共振成像造影剂
技术领域
本发明涉及磁共振成像造影剂，具体涉及以二乙酰基苯或三乙酰基苯为连接体的多核非离子型磁共振成像造影剂。 
背景技术
近年来，磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)已经成为医疗诊断中一种广泛应用的诊断方法，随着新型磁成像技术，比如功能磁共振成像(Functional MRI)、灌注磁共振成像(Perfusion MRI)等的开发和临床应用，以及高磁场强度仪器的投入使用，对具有高弛豫效率，高水溶性，低渗透压，低毒性的优良造影剂的需求变得日益重要。造影剂在磁共振成像中的作用是改变顺磁离子周围组织的质子的弛豫时间，增大被检测的目标部位与周边背景组织的磁信号差异，提高所获图像的对比度和清晰度，以利于对疾病和损伤组织的的准确判断。 
目前用于临床的造影剂主要为含钆离子的小分子顺磁性螯合物，按照其结构特点可分为两类：链状类(DTPA类似物)，大环类(DOTA类似物)。其中大环类由于其自身所具有的高的热力学和动力学稳定性，低毒性而备受关注，例如，Gd-DOTA(Dotarem，多它灵)，Gd-HP-DO3A(ProHance，普络显思)，而Gd-DOTA稳定常数比链状Gd-DTPA高105，其弛豫效率(单位浓度的造影剂对水分子中氢原子的弛豫时间的改变)约为3.6±0.2s-1mM-1；其中非离子型造影剂更受人们青睐，因其较低的渗透压，不会对血管造成额外损伤，例如Gd-HP-DO3A(ProHance，普络显思)(630mOsm/kg)比Gd-DOTA(Dotarem，多它灵)(1350mOsm/kg)的渗透压低一倍多。 
影响造影剂弛豫效率的其它主要因素包括：与顺磁离子配位的内配层水分子数目(q)、配位水分子与溶剂水分子的交换速率(kex)、分子的旋转速率(旋转相关时间)(τR)等；配位水数目的提高往往导致造影剂稳定常数(KML)的下降，致使钆离子在体内环境中从配合物分子中解离出来，对人体产生毒性，这将严 重限制造影剂的应用，所以，为提高造影剂的弛豫效率，更具操作性的方法是增加造影剂分子的旋转相关时间。为达此目的，小分子造影剂通常被以共价或非共价形式连接到不同种类的大分子物质上，如脂质体、链状高分子聚合物、树枝形分子、纳米颗粒、蛋白质等，试图利用这些大分子较长的旋转相关时间来降低顺磁基团的旋转速度，研究表明，被连接成的大分子造影剂的弛豫效率并没有预测值高，发现小分子造影剂与大分子中间链接部分的柔性是导致整个大分子弛豫效率降低的主要原因，为此开发了多种方法来降低中间连接体的柔性，其中构建多核的造影剂分子，即将多个小分子造影剂连接为一个分子量较大的分子。随着整个分子的旋转相关时间的延长，多核造影剂的弛豫效率较单核小分子造影剂有所提高，但与理论预测的结果仍然有差距。与大分子造影剂类似，决定造影剂效率的实际上是顺磁离子的旋转速率(τlocal-r)而非整个分子总体的旋转速率(τglobe-r)，当连接基团为柔性较强的烷烃链时，无论是小分子造影剂与大分子进行连接还是小分子造影剂相互连接为多核分子，其顺磁离子自身的旋转均与分子整体的旋转有较大差异，例如，Andre E.Merbach小组合成的[BO{Gd(DO3A)(H2O)}2]造影剂(Water Exchange and Rotational Dynamics of the Dimeric Gadolinium(III)Complex [BO{Gd(DO3A)(H2O)}2]：AVariable-Temperature and-Pressure 17O NMR Study Inorg.Chem.1996，35，3375-3379)，两个螯合配体DO3A之间用柔性很强的烷基醚链( 
Figure BDA0000150893690000021
n＝2，4)链接，结果表明总的旋转速率(τglobe-r)虽比单核造影剂明显增大，但是顺磁离子的旋转速率(τlocal-r)仍是限制弛豫效率增高的主要原因。 
同时，很多构建二核或多核造影剂的设计和合成过程涉及到羧酸与胺基的缩合反应，此类缩合反应导致与顺磁离子螯合的配位基团由羧基变成酰胺(Gadolinium Complexation by a New DTPA-Amide Ligand.Amide Oxygen Coordination Inorg.Chem.1990，29，1488-1491)，这就造成造影剂分子中顺磁离子的配位能力降低，致使分子的热力学稳定性，并且配位水分子与溶剂水分子的交换速率(kex)随之下降。 
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中的造影剂采用柔性链的连接基团而导致弛豫效率低和热力学稳定性差的缺陷，而提供以二乙酰基苯或三乙酰基苯为连接体的多核非离子型磁共振成像造影剂。 
以二乙酰基苯为连接体的二核非离子型磁共振成像造影剂，该造影剂是在二乙酰基苯对位上同时共价连接两个DO3A(2，2′，2″-(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸)基团，每个DO3A基团再分别与一个顺磁离子Gd3+形成配合物，具有如下结构： 
Figure BDA0000150893690000031
以三乙酰基苯为连接体的三核非离子型磁共振成像造影剂，该造影剂是在三乙酰基苯上同时共价连接三个DO3A基团，每个DO3A再分别与一个顺磁离子Gd3+形成配合物，具有如下结构： 
Figure BDA0000150893690000032
发明原理：本发明以二乙酰基苯或三乙酰基苯为连接体的多核非离子型磁共振成像造剂，是在刚性连接基团二乙酰基苯或三乙酰基苯上同时分别共价连接两个或三个DO3A基团，再与顺磁性金属离子Gd3+配合而得到的；除了DO3A中大环的四个氮原子和环上的三个羧酸基参与顺磁离子的配位以外，二乙酰基苯或三乙酰基苯的乙酰羰基也参与配位，这个配位键的形成，既增强了顺磁离子与化合物配合的稳定性，又减少了DO3A螯合基团与连接中心之间的连接体柔性，使DO3A和顺磁离子的旋转与整个分子的旋转更加一致，在客观上延长了顺磁离子的旋转相关时间，使造影剂的弛豫效率提高。 
本发明的两种造影剂在水溶液中稳定存在，且有极好的水溶性，都可以按照常规方法使用，方便使用，并且利于贮存，将其作为注射液使用，将其静脉注射到诊断对象包括人体或其它哺乳动物体内，然后直接进行磁共振成像检测，即可得到效果增强的磁共振成像图；本发明中的两种造影剂的给药量因外界条件的不同而有所不同，例如，诊断仪器型号(磁场强弱)，诊断对象用药部位等，但是比现在临床应用的单核小分子钆类造影剂用药量偏低，由于其弛豫效率提高40％以上，一般来说，作为具有潜在临床应用的造影剂，诊断对象主要为人类或其他哺乳类动物，故用药量可以为每千克体重0.1～0.5毫摩尔。 
本发明的有益效果： 
1、本发明采用刚性连接体构建多核造影剂，其顺磁离子的旋转与整个分子的旋转较之使用柔性链更加同步，本发明的两种造影剂与现在临床应用的大环类造影剂Gd-DOTA、Gd-HP-DO3A相比，提高了40％以上，(Gd-DO3A)2-DAB的弛豫效率达到5.4mM-1s-1，(Gd-DO3A)3-TAB的弛豫效率达到6.1mM-1s-1。 
2、本发明的两种造影剂采用可以提供顺磁离子配位的基团为连接体，提高了造影剂的稳定性； 
3、本发明的两种造影剂采用大环类DO3A作为螯合钆离子的单体，以提高造影剂的热力学和动力学稳定性并且保证整个造影剂分子成中性不带电荷，即非离子性造影剂； 
4、本发明的两种造影剂毒性低，毒性实验结果表明： 
造影剂(Gd-DO3A)2-DAB用半数抑制浓度(IC50)来表征其毒性为：7.7毫摩尔/升，(Gd-DO3A)3-TAB用半数抑制浓度(IC50)来表征其毒性为：17.9毫摩尔/升。 
附图说明
图1本发明实施例1制备的造影剂(Gd-DO3A)2-DAB和实施例4制备的造影剂(Gd-DO3A)3-TAB的纵向弛豫速率1/T1随Gd3+浓度变化的线性关系图； 
图2为(Eu-DO3A)2-DAB和(Eu-DO3A)3-TAB的静态磷光谱图； 
图3中的(A)和(B)分别为(Eu-DO3A)2-DAB和(Eu-DO3A)3-TAB在普通水溶液和氘代水溶液中的磷光衰减曲线图； 
图4中的(A)和(B)分别为本发明实施例2和实施例5制备的造影剂(Gd-DO3A)2-DAB和(Gd-DO3A)3-TAB的紫外-可见吸收谱图； 
图5为本发明实施例2制备的(Gd-DO3A)2-DAB分别与Zn2+，Ca2+和Cu2+混合，连续观察混合物4个星期的紫外-可见吸收光谱； 
图6为本发明实施例5制备的(Gd-DO3A)3-TAB分别与Zn2+，Ca2+和Cu2+混合，连续观察混合物4个星期的紫外-可见吸收光谱； 
图7为本发明实施例3制备的造影剂(Gd-DO3A)2-DAB(左侧图)和本发明实施例6制备的(Gd-DO3A)3-TAB(右侧图)在不同浓度的体外成像图； 
图8本发明实施例3制备的造影剂(Gd-DO3A)2-DAB和实施例6制备的造影剂(Gd-DO3A)3-TAB的细胞存活率随Gd3+浓度变化的细胞毒性图； 
图9本发明实施例1造影剂(Gd-DO3A)2-DAB的质谱图； 
图10本发明实施例4造影剂(Gd-DO3A)3-TAB的质谱图。 
具体实施方式
以二乙酰基苯为连接体的二核非离子型磁共振成像造影剂((Gd-DO3A)2-DAB)，该造影剂是在二乙酰基苯上同时共价连接两个DO3A(2，2′，2″-(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸)；2，2′，2″-(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7-triyl)triacetic acid)基团，每个DO3A再分别与一个顺磁离子Gd3+形成配合物，具有如下结构： 
Figure BDA0000150893690000061
以二乙酰基苯为连接体的二核非离子型磁共振成像造影剂的制备方法，该方法由以下步骤实现： 
步骤一：1，1′-(1，4-亚苯基)二(2-溴乙酮)的合成 
氮气保护下，将二乙酰基苯加入冰乙酸中，缓慢加热至溶解，再降至室温，向体系中加入液溴的冰乙酸溶液，得到混合溶液，所述的二乙酰基苯与液溴的摩尔比为1∶2，将上述混合溶液置于室温中继续反应2～4小时后停止反应，将反应体系倒入到冰水中，过滤，干燥，得到反应粗产物，将上述粗产物用冰乙酸重结晶，得浅绿色固体1，1′-(1，4-亚苯基)二(2-溴乙酮)； 
步骤二：二(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸叔丁基酯)-二乙酰基苯(tBu-DO3A)2-DAB)的合成 
氮气保护下，将三-叔-丁基2，2′，2″-(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸酯.溴化氢盐酸盐(tBu-DO3A·HBr)和NaHCO3加入反应管中，加入干燥的乙腈溶解，搅拌，缓慢升温至75℃～82℃回流状态后继续反应20～40分钟，得到混合溶液，所述的NaHCO3与tBu-DO3A·HBr的摩尔比为5∶1，将步骤一得到的1，1′-(1，4-亚苯基)二(2-溴乙酮)加入到上述混合溶液中，tBu-DO3A·HBr与1，1′-(1，4-亚苯基)二(2-溴乙酮)的摩尔比为5∶3，回流过夜，停止反应后，冷却至室温，过滤除去无机盐，减压蒸馏除掉溶剂乙腈，得到反应产物，产物用硅胶柱分离，用二氯甲烷∶甲醇＝10∶1淋洗液冲洗，得橙色固体粉末； 
步骤三：除去叔丁基保护基团 
氮气保护下，将步骤二得到的橙色固体粉末溶解于三氟乙酸中，于0℃～25℃下搅拌30分钟～1小时，撤去冰水浴，在室温下反应24～48小时，停止反应后，减压蒸馏除掉溶剂三氟乙酸，再依次用甲醇，二氯甲烷共沸蒸馏，以除去剩余的三氟乙酸，得到油状物，将得到的油状物溶解于甲醇中，冷却至0℃～5℃，向体系中缓慢滴加乙醚，直至沉淀完全，于0℃～5℃继续搅拌10～30分钟，过滤，真空干燥得(DO3A)2-DAB褐色粉末状固体；
步骤四：与钆离子螯合 
将上述步骤三得到的(DO3A)2-DAB加入二次水溶解，滴加碱溶液至(DO3A)2-DAB水溶液pH值为7，将GdCl3溶液加入(DO3A)2-DAB水溶液中，于50℃～80℃下反应24～48小时,以保证钆离子螯合完全，二甲基酚橙检测无游离钆离子，即得到二（钆合(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸）)-二乙酰基苯（(Gd-DO3A)2-DAB），所述的(Gd-DO3A)2-DAB与GdCl3摩尔比为1：2，所述碱溶液为NaOH溶液。 
所述的以二乙酰基苯为连接体的二核非离子型磁共振成像造影剂合成路线如下： 
Figure DEST_PATH_GDA00002801355400011
以三乙酰基苯为连接体的三核非离子型磁共振成像造影剂（(Gd-DO3A)3-TAB），该造影剂是在三乙酰基苯上同时共价连接三个DO3A(2,2',2″-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸)；2,2',2″-(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triyl)triacetic acid）基团，每个DO3A再分别与一个顺磁离子Gd3+形成配合物，具有如下结构： 
Figure DEST_PATH_GDA00002801355400021
以三乙酰基苯为连接体的三核非离子型磁共振成像造影剂的制备方法，该方法由以下步骤实现： 
第一步：1,1',1''-(苯-1,3,5-三基)三(2-溴乙酮) 
氮气保护下，在圆底烧瓶中加入三乙酰基苯，再加入冰乙酸使其溶解，向体系中加入液溴，光照诱发反应，得到混合溶液，所述的三乙酰基苯与液溴的摩尔比为1：3，再置于室温下继续反应30～60分钟，停止反应，冷却至室温，得到反应产物，将反应产物用硅胶柱分离，洗脱液为二氯甲烷和正己烷的混合液，得到1,1',1''-(苯-1,3,5-三基)三(2-溴乙酮)； 
第二步：二(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸叔丁基酯）-三乙酰基苯（(tBu-DO3A)3-TAB）的合成 
氮气保护下，将三-叔-丁基2,2',2″-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸酯.溴化氢盐酸盐（tBu-DO3A·HBr）和NaHCO3加入圆底烧瓶中，加入干燥的乙腈溶解，升温至77～87℃，反应20～40分钟，得到混合溶液，所述的NaHCO3与tBu-DO3A·HBr的摩尔比为7：1，将步骤一中得到的1,1',1''-(苯-1,3,5-三基)三(2-溴乙酮)加入到上述混合溶液中，tBu-DO3A·HBr与1,1',1''-(苯-1,3,5-三基)三(2-溴乙酮)的摩尔比为3：1，反应回流过夜，停止反应，冷却至室温，过滤除去无机盐，减压蒸馏除去溶剂乙腈，得到反应产物，产物用硅胶柱分离，洗脱液为二氯甲烷和甲醇的混合液，减压蒸馏除去洗脱液，最终得(tBu-DO3A)3-TAB浅橙色固体粉末； 
第三步：除去叔丁基保护基团 
氮气保护下，将步骤二中得到的(tBu-DO3A)3-TAB溶解于三氟乙酸中，于0℃～10℃下搅拌1小时，撤去冰水浴，在室温下反应24～48小时，停止反应后，减压蒸馏除掉溶剂三氟乙酸，再依次用甲醇，二氯甲烷共沸蒸馏，以除去剩余的三氟乙酸，得到油状物，将得到的油状物溶解于甲醇中，冷却至0℃～5℃，向体系中缓慢滴加乙醚，直至沉淀完全，于0℃～5℃继续搅拌10～20分钟，过滤，真空干燥得(DO3A)3-TAB土色粉末状固体； 
第四步：与钆离子螯合 
将上述步骤三得到的(DO3A)3-TAB加入二次水溶解，滴加碱溶液至(DO3A)3-TAB水溶液pH值为7，将GdCl3溶液加入(DO3A)3-TAB水溶液中，于50℃～80℃下反应24～48小时,以保证钆离子螯合完全，二甲基酚橙检测无游离钆离子，即得到二（钆合(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸）)-三乙酰基苯（(Gd-DO3A)3-TAB），所述的(DO3A)3-TAB与GdCl3摩尔比为1：3，所述碱溶液为NaOH溶液。 
所述的以三乙酰基苯为连接体的三核非离子型磁共振成像造影剂合成路线如下： 
Figure DEST_PATH_GDA00002801355400031
实施例1 
第一步：1，1′-(1，4-亚苯基)二(2-溴乙酮)的合成(1，1′-(1，4-phenylene)bis(2-bromoethanone))的合成 
氮气保护下，在50毫升圆底烧瓶内加入1.5克二乙酰基苯，加入8毫升冰乙酸，在50℃下搅拌使其溶解，再降至室温，向体系中加入2.98克液溴的冰乙酸溶液4毫升，将上述混合溶液置于室温中继续反应2小时后停止反应，将反应体系倒入到冰水中，过滤，干燥，得到反应粗产物，将上述粗产物加入到20毫升冰乙酸重结晶，得浅绿色固体1，1′-(1，4-亚苯基)二(2-溴乙酮)2.35克； 
第二步：二(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸叔丁基酯)-二乙酰基苯(tBu-DO3A)2-DAB)的合成 
氮气保护下，将0.5克三-叔-丁基2，2′，2″-(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸酯.溴化氢盐酸盐(tBu-DO3A·HBr)，0.353克NaHCO3加入到25毫升反应管中，加入15毫升干燥的乙腈溶解，缓慢升温至82℃回流状态后继续反应30分钟，加入0.161克1，1′-(1，4-亚苯基)二(2-溴乙酮)到反应体系中，回流12小时。停止反应后，冷却至室温，过滤除去无机盐，减压蒸馏除掉溶剂乙腈，产物用硅胶柱分离，用二氯甲烷∶甲醇＝10∶1淋洗液冲洗，得橙色固体粉末0.287克； 
第三步：除去叔丁基保护基团 
氮气保护下，将上一步中得到的橙色粉末0.287克溶解于4毫升的三氟乙酸中，于0℃下搅拌1小时，撤去冰水浴，再于室温下反应24小时，停止反应后，减压蒸馏除掉溶剂三氟乙酸，加入30毫升甲醇溶解，再减压蒸馏除去甲醇，重复三次，接着加入30毫升二氯甲烷，减压蒸馏除去二氯甲烷，重复三次，得油状物，将得到的油状物溶解于少量的甲醇中，冷却至0℃，向体系中慢慢滴加乙醚，直至沉淀完全，于0℃继续搅拌10分钟，过滤，真空干燥得(DO3A)2-DAB褐色粉粉末状固体0.232克(含少量残留三氟乙酸)； 
第四步：与钆离子螯合 
称取0.04085克(DO3A)2-DAB加入5ml二次水溶解，滴加1M NaOH至 pH＝7.0，加入182微升0.3313毫摩尔每毫升GdCl3水溶液，于50℃下反应24h，以保证钆离子螯合完全，二甲基酚橙检测无游离钆离子，即得到二(钆合(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸))-二乙酰基苯((Gd-DO3A)2-DAB)。 
图1为本发明实施例1制备的造影剂(Gd-DO3A)2-DAB的纵向弛豫速率1/T1随Gd3+浓度变化的线性关系图，从图中可知，(Gd-DO3A)2-DAB的弛豫效率在20MHz，37℃条件下以钆离子浓度计算为5.4mM-1s-1，与现在临床应用的大环类造影剂Gd-DOTA(Dotarem，多它灵)，Gd-HP-DO3A(3.8mM-1s-1)(ProHance，普络显思)相比，提高了40％以上。 
图9为本发明实施例1制备的造影剂(Gd-DO3A)2-DAB的质谱图，从图中可知，(Gd-DO3A)2-DAB的实验精确质量为1160.5，与理论精确质量1160.2吻合，其它的离子峰1157.5，1158.5，1159.5，1161.5，1162.5，1163.5，1164.5，1165.5，1166.5，1167.5，为Gd3+的同位素离子峰。 
实施例2 
第一步：1，1′-(1，4-亚苯基)二(2-溴乙酮)的合成(1，1′-(1，4-phenylene)bis(2-bromoethanone))的合成 
氮气保护下，在50毫升圆底烧瓶内加入3.0克二乙酰基苯，加入16毫升冰乙酸，在50℃下搅拌使其溶解，再降至室温，向体系中加入5.96克液溴的冰乙酸溶液8毫升，将上述混合溶液置于室温中继续反应4小时后停止反应，将反应体系倒入到冰水中，过滤，干燥，得到反应粗产物，将上述粗产物加入到35毫升冰乙酸重结晶，得浅绿色固体1，1′-(1，4-亚苯基)二(2-溴乙酮)4.6克； 
第二步：二(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸叔丁基酯)-二乙酰基苯(tBu-DO3A)2-DAB)的合成 
氮气保护下，将1.5克三-叔-丁基2，2′，2″-(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸酯.溴化氢盐酸盐(tBu-DO3A·HBr)，1.06克NaHCO3加入到100毫升圆底烧瓶中，加入50毫升干燥的乙腈溶解，缓慢升温至75℃后继续反应20分钟，加入0.5克1，1′-(1，4-亚苯基)二(2-溴乙酮)到反应体系中，回流过夜24小时，停止反应后，冷却至室温，过滤除去无机盐，减压蒸馏除掉溶剂乙腈。产物用 硅胶柱分离，用二氯甲烷∶甲醇＝10∶1淋洗液冲洗，得橙色固体粉末0.96克； 
第三步：除去叔丁基保护基团 
氮气保护下，将上一步中得到的橙色粉末0.96克溶解于20毫升的三氟乙酸中，于25℃下搅拌0.5小时，撤去冰水浴，再于室温下反应48小时，停止反应后，减压蒸馏除掉溶剂三氟乙酸，加入30毫升甲醇溶解，再减压蒸馏除去甲醇，重复三次，接着加入30毫升二氯甲烷，减压蒸馏除去二氯甲烷，重复三次，得橙色油状物，将得到的油状物溶解于少量的甲醇中，冷却至5℃，向体系中慢慢滴加乙醚，直至沉淀完全，于0℃继续搅拌10分钟，过滤，真空干燥得(DO3A)2-DAB褐色粉末状固体0.7克(含少量残留三氟乙酸)； 
第四步：与钆离子螯合 
称取0.0817克(DO3A)2-DAB加入5ml二次水溶解，滴加1M NaOH至pH＝7.0，加入0.3313毫摩尔每毫升GdCl3水溶液364微升，于80℃下反应48h，以保证钆离子螯合完全，二甲基酚橙检测无游离钆离子，即得到二(钆合(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸))-二乙酰基苯((Gd-DO3A)2-DAB)。实施例2制备的造影剂(Gd-DO3A)2-DAB的弛豫效率在20MHz，37℃条件下以钆离子浓度计算为5.4mM-1s-1。 
实施例3 
第一步：1，1′-(1，4-亚苯基)二(2-溴乙酮)的合成(1，1′-(1，4-phenylene)bis(2-bromoethanone))的合成 
氮气保护下，在50毫升圆底烧瓶内加入3.0克二乙酰基苯，加入16毫升冰乙酸，在50℃下搅拌使其溶解，再降至室温，向体系中加入5.96克液溴的冰乙酸溶液8毫升，将上述混合溶液置于室温中继续反应4小时后停止反应，将反应体系倒入到冰水中，过滤，干燥，得到反应粗产物，将上述粗产物加入到50毫升冰乙酸重结晶，得浅绿色固体1，1′-(1，4-亚苯基)二(2-溴乙酮)3.7克； 
第二步：二(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸叔丁基酯)-二乙酰基苯(tBu-DO3A)2-DAB)的合成 
氮气保护下，将1.727克三-叔-丁基2，2′，2″-(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7- 三基)三乙酸酯.溴化氢盐酸盐(tBu-DO3A·HBr)，1.2克NaHCO3加入到100毫升圆底烧瓶中，加入12毫升干燥的乙腈溶解，缓慢升温至80℃回流状态后继续反应40分钟，加入0.5克1，1′-(1，4-亚苯基)二(2-溴乙酮)到反应体系中，回流过夜24小时，停止反应后，冷却至室温，过滤除去无机盐，减压蒸馏除掉溶剂乙腈，产物用硅胶柱分离，用二氯甲烷∶甲醇＝14∶1淋洗液冲洗，得橙色固体粉末1.07克； 
第三步：除去叔丁基保护基团 
氮气保护下，将上一步中得到的橙色粉末1.07克溶解于30毫升的三氟乙酸中，于0℃下搅拌1小时，撤去冰水浴，再于室温下反应48小时，停止反应后，减压蒸馏除掉溶剂三氟乙酸，加入30毫升甲醇溶解，再减压蒸馏除去甲醇，重复三次，接着加入30毫升二氯甲烷，减压蒸馏除去二氯甲烷，重复三次，得橙色油状物，将得到的油状物溶解于少量的甲醇中，冷却至0℃，向体系中慢慢滴加乙醚，直至沉淀完全，于0℃继续搅拌20分钟，过滤，真空干燥得(DO3A)2-DAB褐色粉末状固体0.87克(含少量残留三氟乙酸)； 
第四步：与钆离子螯合 
称取0.0817克(DO3A)2-DAB加入5ml二次水溶解，滴加1M NaOH至pH＝7.0，加入.03313毫摩尔每毫升GdCl3水溶液365微升，于77℃下反应36h，以保证钆离子螯合完全，二甲基酚橙检测无游离钆离子，即得到二(钆合(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸))-二乙酰基苯((Gd-DO3A)2-DAB)。实施例3制备的造影剂(Gd-DO3A)2-DAB的弛豫效率在20MHz，37℃条件下以钆离子浓度计算为5.4mM-1s-1。 
实施例4 
第一步：1，1′，1″-(苯-1，3，5-三基)三(2-溴乙酮)(1，1′，1″-(benzene-1，3，5-triyl)tris(2-bromoethanone))的合成 
氮气保护下，在25毫升反应管中，加入0.2048克三乙酰基苯，再加入5毫升冰乙酸使其溶解，向体系中加入0.48克液溴，60瓦白炽灯光照诱发反应，溶液有酒红色变成浅黄色，继续反应30分钟，停止反应，冷却至室温，旋转蒸 发除去挥发溶剂，将反应产物用硅胶柱分离，洗脱液为二氯甲烷∶正己烷＝6∶1的混合液，得到1，1′，1″-(苯-1，3，5-三基)三(2-溴乙酮)0.22克； 
第二步：二(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸叔丁基酯)-三乙酰基苯((tBu-DO3A)3-TAB)的合成 
氮气保护下，将0.51克三-叔-丁基2，2′，2″-(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸酯.溴化氢盐酸盐(tBu-DO3A·HBr)，1.43克NaHCO3加入到25毫升反应管中，加入5毫升干燥过的乙腈溶解，缓慢升温至回流，反应40分钟，将0.11克第一步中得到的1，1′，1″-(苯-1，3，5-三基)三(2-溴乙酮)加入到反应体系中，反应回流过夜20小时，停止反应，冷却至室温，过滤除去无机盐，减压蒸馏除去溶剂乙腈，产物用硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为10∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液，减压蒸馏除去洗脱液，最终得0.11克(tBu-DO3A)3-TAB浅橙色固体粉末； 
第三步：除去叔丁基保护基团 
氮气保护下，将上一步中得到的0.11克浅橙色固体粉末溶解于4毫升三氟乙酸中，于0℃下搅拌1小时。撤去冰水浴，室温下反应24小时，停止反应，减压蒸馏下除去溶剂三氟乙酸，再依次用甲醇(30毫升×3)，二氯甲烷(30毫升×3)共沸，以除去剩余的三氟乙酸，将得到的油状物溶解于少量的甲醇中，冷却至0℃，向体系中慢慢滴加冷的乙醚，直至沉淀完全，于0℃继续搅拌10分钟，过滤，真空干燥得0.072克(DO3A)3-TAB土色粉末状固体； 
第四步：与钆离子螯合 
称取0.0402克(DO3A)3-TAB加入5ml二次水溶解，滴加1M NaOH至pH＝7.0，加入0.3313毫摩尔每毫升的GdCl3水溶液182微升，于50℃下反应24h，以保证钆离子螯合完全，二甲基酚橙检测无游离钆离子，即得到二(钆合(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸))-三乙酰基苯((Gd-DO3A)3-TAB)。 
图1本发明制备的造影剂(Gd-DO3A)3-TAB的纵向弛豫速率1/T1随Gd3+浓度变化的线性关系图，从图中可知，(Gd-DO3A)3-TAB的弛豫效率在20MHz，37℃条件下以钆离子浓度计算为6.1mM-1s-1，与现在临床应用的大环类 造影剂Gd-DOTA(Dotarem，多它灵)，Gd-HP-DO3A(3.8mM-1s-1)(ProHance，普络显思)相比，提高了60％以上。 
图10为本发明实施例4制备的造影剂(Gd-DO3A)3-TAB的质谱图，从图中可知，(Gd-DO3A)3-TAB的实验精确质量为1701.3，与理论精确质量1701.5吻合，其它的离子峰1695.5，1696.5，1697.5，1698.5，1699.5，1700.5，1702.5，1703.5，1704.5，1705.5，1706.5，1707.5，1708.5，为Gd3+的同位素离子峰。 
实施例5 
第一步：1，1′，1″-(苯-1，3，5-三基)三(2-溴乙酮)(1，1′，1″-(benzene-1，3，5-triyl)tris(2-bromoethanone))的合成 
氮气保护下，在25毫升反应管中，加入0.4096克三乙酰基苯，再加入7毫升冰乙酸使其溶解，向体系中加入0.96克液溴，210瓦白炽灯光照诱发反应，溶液有酒红色变成浅黄色，继续反应40分钟，停止反应，冷却至室温，旋转蒸发除去挥发溶剂，将反应产物用硅胶柱分离，洗脱液为二氯甲烷∶正己烷＝6∶1的混合液，得到1，1′，1″-(苯-1，3，5-三基)三(2-溴乙酮)0.51克； 
第二步：二(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸叔丁基酯)-三乙酰基苯((tBu-DO3A)3-TAB)的合成 
氮气保护下，将0.8934克三-叔-丁基2，2′，2″-(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸酯.溴化氢盐酸盐(tBu-DO3A·HBr)，0.336克NaHCO3加入到50毫升圆底烧瓶中，加入5毫升干燥过的乙腈溶解，缓慢升温至回流，反应30分钟，将0.22克第一步中得到的1，1′，1″-(苯-1，3，5-三基)三(2-溴乙酮)加入到反应体系中，反应回流过夜14小时，停止反应，冷却至室温，过滤除去无机盐，减压蒸馏除去溶剂乙腈，产物用硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为10∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液，减压蒸馏除去洗脱液，最终得0.4克(tBu-DO3A)3-TAB浅橙色固体粉末； 
第三步：除去叔丁基保护基团 
氮气保护下，将上一步中得到的0.4克浅橙色固体粉末溶解于15毫升三氟乙酸中，于5℃下搅拌0.5小时，撤去冰水浴，室温下反应24小时。停止反应， 减压蒸馏下除去溶剂三氟乙酸，再依次用甲醇(30毫升×3)，二氯甲烷(30毫升×3)共沸，以除去剩余的三氟乙酸，将得到的油状物溶解于少量的甲醇中，冷却至0℃，向体系中慢慢滴加冷的乙醚，直至沉淀完全，于0℃继续搅拌10分钟，过滤，真空干燥得0.35克(DO3A)3-TAB土色粉末状固体； 
第四步：与钆离子螯合 
称取0.0804克(DO3A)3-TAB加入5ml二次水溶解，滴加1M NaOH至pH＝7.0，加入0.3313毫摩尔每毫升GdCl3水溶液364微升，于77℃下反应48小时，以保证钆离子螯合完全，二甲基酚橙检测无游离钆离子，即得到二(钆合(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸))-三乙酰基苯((Gd-DO3A)3-TAB)。实施例5制备的造影剂(DO3A)3-TAB的弛豫效率在20MHz，37℃条件下以钆离子浓度计算为6.1mM-1s-1。 
实施例6 
第一步：1，1′，1″-(苯-1，3，5-三基)三(2-溴乙酮)(1，1′，1″-(benzene-1，3，5-triyl)tris(2-bromoethanone))的合成 
氮气保护下，在25毫升反应管中，加入2.048克三乙酰基苯，再加入12毫升冰乙酸使其溶解，向体系中加入3.84克液溴，500瓦白炽灯光照诱发反应，溶液有酒红色变成浅黄色，继续反应60分钟，停止反应，冷却至室温，旋转蒸发除去挥发溶剂，将反应产物用硅胶柱分离，洗脱液为二氯甲烷∶正己烷＝6∶1的混合液，得到1，1′，1″-(苯-1，3，5-三基)三(2-溴乙酮)1.96克； 
第二步：二(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸叔丁基酯)-三乙酰基苯((tBu-DO3A)3-TAB)的合成 
氮气保护下，将0.8934克三-叔-丁基2，2′，2″-(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸酯.溴化氢盐酸盐(tBu-DO3A·HBr)，0.336克NaHCO3加入到50毫升圆底烧瓶中，加入5毫升干燥过的乙腈溶解，缓慢升温至90℃，反应40分钟，将1.1克第一步中得到的0.2321克1，1′，1″-(苯-1，3，5-三基)三(2-溴乙酮)加入到反应体系中，反应回流过夜22小时，停止反应，冷却至室温，过滤除去无机盐，减压蒸馏除去溶剂乙腈，产物用硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为10∶1的二 氯甲烷和甲醇的混合液，减压蒸馏除去洗脱液，最终得0.47克(tBu-DO3A)3-TAB浅橙色固体粉末； 
第三步：除去叔丁基保护基团 
氮气保护下，将上一步中得到的0.31克浅橙色固体粉末溶解于10毫升三氟乙酸中，于5℃下搅拌45分钟，撤去冰水浴，室温下反应36小时，停止反应，减压蒸馏下除去溶剂三氟乙酸，再依次用甲醇(30毫升×3)，二氯甲烷(30毫升×3)共沸，以除去剩余的三氟乙酸。将得到的油状物溶解于少量的甲醇中，冷却至0℃，向体系中慢慢滴加冷的乙醚，直至沉淀完全，于0℃继续搅拌15分钟，过滤，真空干燥得0.25克(DO3A)3-TAB土色粉末状固体； 
第四步：与钆离子螯合 
称取0.0404克(DO3A)3-TAB加入5ml二次水溶解，滴加1M NaOH至pH＝7.0，加入0.3313毫摩尔每毫升GdCl3水溶液182微升，于80℃下反应30小时，以保证钆离子螯合完全，二甲基酚橙检测无游离钆离子，即得到二(钆合(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸))-三乙酰基苯((Gd-DO3A)3-TAB)。实施例6制备的造影剂(DO3A)3-TAB的弛豫效率在20MHz，37℃条件下以钆离子浓度计算为6.1mM-1s-1。 
造影剂中与钆离子直接配位的内配层水分子数直接影响造影剂的弛豫效率，但同时，配位水分子数目的增加将引起造影剂热力学和动力学稳定性的下降，使得钆离子在体内环境下(含40多毫摩尔浓度的磷酸根离子及其它可与阳离子配位的配体分子)，从造影剂分子中解离，转而与其它离子结合。这个金属离子转移过程(transmetallation)，对人体有害，图2为(Eu-DO3A)2-DAB(实线)和(Eu-DO3A)3-TAB(虚线)的静态磷光谱图，相应的激发波长分别为309和310纳米，通过铕离子(Eu3+)取代的化合物(Eu-DO3A)2-DAB和(Eu-DO3A)3-TAB分别在普通水(H2O)溶液和氘代水(D2O)溶液中磷光寿命的变化，可知(Gd-DO3A)2-DAB和(Gd-DO3A)3-TAB中金属离子的配位水分子数目为1。 
图3中的(A)和(B)分别为(Eu-DO3A)2-DAB和(Eu-DO3A)3-TAB在普 通水溶液和氘代水溶液中的磷光衰减曲线图；从图3和表1可知，公式： 
qEu＝1.2(1/τ1um；H2O-1/τ1um；D2O-0.25)    (1) 
由公式(1)可以计算出与铕离子(Eu3+)配位的内配层水分子数。 
表1、(Eu-DO3A)2-DAB和(Eu-DO3A)3-TAB在普通水溶液和氘代水溶液中的磷光寿命及配位水分子数。 
Figure BDA0000150893690000181
图4中的(A)为本发明实施例2制备的造影剂(Gd-DO3A)2-DAB的紫外-可见吸收谱图，从图中可以看出，曲线1为(DO3A)2-DAB，曲线2为(Gd-DO3A)2-DAB，曲线3为(Gd-DO3A)2-DAB与10倍摩尔当量的DTPA的混合液，由图可知，失去钆离子的造影剂吸收谱向低波长移动，以10∶1的DTPA与(Gd-DO3A)2-DAB混合后，在室温下超过25天，其吸收谱(3)仍旧与钆离子存在的(Gd-DO3A)2-DAB吻合，表明DTPA不能夺取(Gd-DO3A)2-DAB中的钆离子。 
图4中的(B)为本发明实施例5制备的造影剂(Gd-DO3A)3-TAB的紫外-可见吸收谱图，从图中可以看出，曲线1为(DO3A)3-TAB，曲线2为(Gd-DO3A)3-TAB，曲线3为(Gd-DO3A)3-TAB与10倍摩尔当量的DTPA的混合液，由图可知，失去钆离子的造影剂吸收谱向低波长移动，以10∶1的DTPA与(Gd-DO3A)3-TAB混合后，在室温下超过25天，其吸收谱(3)仍旧与钆离子存在的(Gd-DO3A)3-TAB吻合，表明DTPA不能夺取(Gd-DO3A)3-TAB中的钆离子。 
足够的热力学稳定性是造影剂用于人体的先决条件之一，同样在人体内的动力学惰性-金属离子转移，也是决定其应用的重要因素，在我们得到的造影剂(Gd-DO3A)2-DAB中，乙酰基苯的羰基提供一个额外的配位点，提高了DO3A环对钆离子的络合能力，大大增强了造影剂的热力学稳定性，图5为本发明实 施例2制备的(Gd-DO3A)2-DAB分别与Zn2+，Ca2+和Cu2+混合，连续观察混合物4个星期的紫外-可见吸收光谱，其中的图a为(Gd-DO3A)2-DAB与Zn2+混合的紫外-可见吸收光谱，图a中的曲线1为(DO3A)2-DAB，曲线2为(Gd-DO3A)2-DAB，曲线3为(DO3A)2-DAB与Zn2+混合，曲线4为(Gd-DO3A)2-DAB与Zn2+混合； 
图b为(Gd-DO3A)2-DAB与Ca2+混合的紫外-可见吸收光谱，图b中的曲线1为(DO3A)2-DAB，曲线2为(Gd-DO3A)2-DAB，曲线3为(DO3A)2-DAB与Ca2+混合，曲线4为(Gd-DO3A)2-DAB与Ca2+混合；图c为(Gd-DO3A)2-DAB与Cu2+混合的紫外-可见吸收光谱，图c中的曲线1为(DO3A)2-DAB，曲线2为(Gd-DO3A)2-DAB，曲线3为(DO3A)2-DAB与Cu2+混合，曲线4为(Gd-DO3A)2-DAB与Cu2+混合； 
从图中可以看出，混合物的光谱仍然与(Gd-DO3A)2-DAB的特征谱重叠，显示没有钆离子从造影剂中解离，说明(Gd-DO3A)2-DAB具有良好的稳定性。 
图6为本发明实施例5制备的(Gd-DO3A)3-TAB分别与Zn2+，Ca2+和Cu2+混合，连续观察混合物4个星期的紫外-可见吸收光谱，其中的图a为(Gd-DO3A)3-TAB与Zn2+混合的紫外-可见吸收光谱，图a中的曲线1为(DO3A)3-TAB，曲线2为(Gd-DO3A)3-TAB与Zn2+混合，曲线3为(DO3A)3-TAB与Zn2+混合，曲线4为(Gd-DO3A)3-TAB；其中的图b为(Gd-DO3A)3-TAB与Ca2+混合的紫外-可见吸收光谱，图b中的曲线1为(DO3A)3-TAB，曲线2为(Gd-DO3A)3-TAB与Ca2+混合，曲线3为(DO3A)3-TAB与Ca2+混合，曲线4为(Gd-DO3A)3-TAB；其中的图c为(Gd-DO3A)3-TAB与Cu2+混合的紫外-可见吸收光谱，图c中的曲线1为(DO3A)3-TAB，曲线2为(Gd-DO3A)3-TAB与Cu2+混合，曲线3为(DO3A)3-TAB与Cu2+混合，曲线4为(Gd-DO3A)3-TAB； 
从图中可以看出，混合物的光谱仍然与(Gd-DO3A)3-TAB的特征谱重叠，显示没有钆离子从造影剂中解离，说明(Gd-DO3A)3-TAB具有良好的稳定性。 
图7为本发明实施例3制备的造影剂(Gd-DO3A)2-DAB(左侧图)和本发明实施例6制备的(Gd-DO3A)3-TAB(右侧图)在不同浓度的体外成像图，从图中可以看出，(Gd-DO3A)2-DAB和(Gd-DO3A)3-TAB对图像对比度的提高明显高 于纯水，具有良好的造影效果，而(Gd-DO3A)3-TAB的提高效果高于(Gd-DO3A)2-DAB，这是由于(Gd-DO3A)3-TAB的弛豫效率明显高于(Gd-DO3A)2-DAB的弛豫效率。 
实施例7造影剂(Gd-DO3A)2-DAB对人子宫颈癌细胞株(HeLa)细胞的毒性实验 
1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入200ul，铺板使待测细胞调密度至3000个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)； 
2.于5％CO2，37℃环境下孵育，直至细胞单层铺满96孔平底板孔底，贴壁，加入实施例3所制备的造影剂(Gd-DO3A)2-DAB，所述的造影剂浓度梯度范围为0.0003毫摩尔/升至24.0毫摩尔/升，每孔100ul，设5个复孔，用5％胎牛血清的培养液培养； 
3.继续于5％CO2，37℃的环境下孵育24小时，倒置显微镜下观察； 
4.弃去培养液，用PBS冲洗3遍，再加入含0.5％MTT的培养液100ul，继续培养4h； 
5.终止培养，吸去孔内培养液； 
6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值；同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。 
实施例8造影剂(Gd-DO3A)3-TAB对人子宫颈癌细胞株(HeLa)细胞的毒性实验 
1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入200ul，铺板使待测细胞调密度至3000个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)； 
2.于5％CO2，37℃环境下孵育，直至细胞单层铺满96孔平底板孔底，贴壁，加入实施例6所制备的造影剂(Gd-DO3A)3-TAB，所述的造影剂浓度梯度范围为0.0003毫摩尔/升至24毫摩尔/升，每孔100ul，设5个复孔，用5％胎牛血清的培养液培养； 
3.继续于5％CO2，37℃的环境下孵育24小时，倒置显微镜下观察； 
4.弃去培养液，用PBS冲洗3遍，再加入含0.5％MTT的培养液100ul，继续培养4h； 
5.终止培养，吸去孔内培养液； 
6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值；同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。 
图8为本发明实施例3制备的造影剂(Gd-DO3A)2-DAB和实施例6制备的造影剂(Gd-DO3A)3-TAB的细胞存活率随Gd3+浓度变化的细胞毒性图。黑色柱形图代表Gd-DTPA，斜纹柱形图代表(Gd-DO3A)2-DAB，浅色柱形图代表(Gd-DO3A)3-TAB，(Gd-DO3A)2-DAB和(Gd-DO3A)3-TAB的24小时半数细胞致死浓度(IC50，衡量药物诱导凋亡的参数，即诱导能力越强，该数值越低，也可以反向说明靶细胞对药物的耐受程度越低)由此实验得出，造影剂(Gd-DO3A)2-DAB用半数抑制浓度(IC50)来表征其毒性为：7.7毫摩尔/升，(Gd-DO3A)3-TAB用半数抑制浓度(IC50)来表征其毒性为：17.9毫摩尔/升。 

Claims (2)

1.以二乙酰基苯为连接体的二核非离子型磁共振成像造影剂，其特征在于，该造影剂是在二乙酰基苯对位上同时共价连接两个DO3A基团，每个DO3A基团再分别与一个顺磁离子Gd3+形成配合物，具有如下结构：
Figure FDA0000150893680000011
2.以三乙酰基苯为连接体的三核非离子型磁共振成像造影剂，其特征在于，该造影剂是在三乙酰基苯上同时共价连接三个DO3A基团，每个DO3A再分别与一个顺磁离子Gd3+形成配合物，具有如下结构：
CN 201210099645 2012-04-06 2012-04-06 以二乙酰基苯或三乙酰基苯为连接体的多核非离子型磁共振成像造影剂 Active CN102614531B (zh)

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