CN102552941B - 以2，5-二甲基吡嗪为连接体的二核磁共振成像造影剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
以2，5-二甲基吡嗪为连接体的二核磁共振成像造影剂及其制备方法，涉及磁共振成像造影剂领域。解决现有技术中的造影剂采用柔性链连接基团而导致弛豫效率低和热力学稳定性差的问题。该造影剂是在刚性连接基团2，5-二甲基吡嗪上同时共价连接两个DO3A基团，再与顺磁性金属离子Gd3+螯合而得到的，本发明还提供了以2，5-二甲基吡嗪为连接体的二核磁共振成像造影剂的制备方法。本发明造影剂(Gd-DO3A)2-BMP的弛豫效率可达到5.5mM-1s-1，且具有良好的稳定性，毒性小。
Description
技术领域
本发明涉及磁共振成像造影剂，具体涉及以2，5-二甲基吡嗪为连接体的二核磁共振成像造影剂及其制备方法。
背景技术
近年来，磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)已经成为医疗诊断中一种常规诊断方法，随着新型磁成像技术，比如功能磁共振成像(FunctionalMRI)、灌注磁共振成像(Perfusion MRI)等的开发和临床应用，以及高磁场强度仪器的投入使用，对具有高磁弛豫效率，高水溶性，低渗透压，低毒性的优良造影剂的需求变得日益重要。造影剂在磁共振成像中的作用是改变顺磁离子周围的水分子中氢原子的弛豫时间，增大被检测的目标部位与周边背景组织的磁信号差异，提高所获图像的对比度和清晰度，以利于对疾病和损伤的准确判断。
目前用于临床的造影剂主要为含钆离子的小分子配合物，按照其结构特点可分为两类：链状类(DTPA类似物)，大环类(DOTA类似物)。其中大环类由于其自身所具有的高的动力学和热力学稳定性，低毒性而备受关注，例如，Gd-DOTA(Dotarem，多它灵)，Gd-HP-DO3A(ProHance，普络显思)，而Gd-DOTA稳定常数比链状Gd-DTPA高105，其弛豫效率(单位浓度的造影剂对水分子中氢原子的弛豫时间的改变)约为3.6±0.2s-1mM-1；其中非离子型造影剂更受人们青睐，因其较低的渗透压，不会对血管造成额外损伤，例如Gd-HP-DO3A(ProHance，普络显思)(630mOsm/kg)比Gd-DOTA(Dotarem，多它灵)(1350mOsm/kg)的渗透压低一倍多。
影响造影剂弛豫效率的其它主要因素包括：与顺磁离子配位的内配层水分子数目(q)、配位水分子与溶剂水分子的交换速率(kex)、分子的旋转速率(旋转相关时间)(τR)等；配位水数目的提高往往导致造影剂稳定常数(KML)的下降，使得钆离子在体内环境中从配合物分子中解离出来，对人体产生毒性，这将严重限制造影剂的应用，所以，为提高造影剂的弛豫效率，更具操作性的方法是减慢造影剂分子的旋转速率。为达此目的，小分子造影剂被连接(共价或非共价形式)到不同种类的大分子物质上，如脂质体、高分子聚合物、树枝形分子、纳米颗粒、蛋白质等，试图利用这些大分子较长的旋转相关时间来降低顺磁基团的旋转速度，然而此类造影剂的缺点就是在人体中代谢缓慢，滞留时间长，可能造成慢性中毒等副作用，因而限制了此类造影剂的应用；另一提高分子旋转相关时间的方法是构建多核的造影剂分子，即将多个小分子造影剂连接为一个分子量较大的分子。随着整个分子的旋转相关时间的延长，多核造影剂的弛豫效率较单核小分子造影剂有所提高，但与理论预测的结果仍然有差距。研究表明，决定造影剂效率的实际上是顺磁离子的旋转速率(τlocal-r)而非整个分子总体的旋转速率(τglobe-r)，当连接基团为柔性较强的烷烃链时，无论是小分子造影剂与大分子进行连接还是小分子造影剂相互连接为多核分子，其顺磁离子自身的旋转均与分子整体的旋转有较大差异，例如，Andre E.Merbach小组合成的[BO{Gd(DO3A)(H2O)}2]造影剂(Water Exchange and Rotational Dynamics of theDimeric Gadolinium(III)Complex [BO{Gd(DO3A)(H2O)}2]：AVariable-Temperature and-Pressure 17O NMR Study Inorg.Chem.1996，35，3375-3379)，两个螯合配体DO3A之间用柔性很强的烷基醚链(
n＝2，4)链接，结果表明总的旋转速率(τglobe-r)虽比单核造影剂明显增大，但是顺磁离子的旋转速率(τlocal-r)仍是限制弛豫效率增高的主要原因。
同时，很多构建二核或多核造影剂的设计和合成过程涉及到羧酸与胺基的缩合反应，此类缩合反应需要消耗掉原本用于顺磁离子螯合的配位基团羧基而生成酰胺(Gadolinium Complexation by a New DTPA-Amide Ligand.AmideOxygen Coordination Inorg.Chem.1990，29，1488-1491)，这就造成造影剂分子中顺磁离子的配位能力降低，致使分子的热力学稳定性，配位水分子与溶剂水分子的交换速率(kex)随之下降。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中的造影剂采用柔性链的连接基团而导致弛豫效率低和热力学稳定性差的问题，而提供以2，5-二甲基吡嗪为连接体的二核磁共振成像造影剂及其制备方法。
以2，5-二甲基吡嗪为连接体的二核磁共振成像造影剂，该造影剂是在2，5-二甲基吡嗪上同时共价连接两个DO3A基团，每个DO3A基团再分别与一个顺磁离子Gd3+螯合形成配合物，具有如下结构：
以2，5-二甲基吡嗪为连接体的二核磁共振成像造影剂的制备方法，该方法由以下步骤实现：
第一步：2，5-二(溴甲基)吡嗪的合成
氮气保护下，在圆底烧瓶中加入2，5-二甲基吡嗪和N-溴代丁二酰亚胺，再加入四氯化碳溶解，加热至80℃～90℃，反应30～45分钟，得到混合溶液，所述的N-溴代丁二酰亚胺与2，5-二甲基吡嗪的摩尔比为2∶1，在混合溶液中加入过氧化苯甲酰，所述的过氧化苯甲酰的加入量为2，5-二甲基吡嗪质量的12％，回流过夜，得到反应产物，将反应产物用硅胶柱分离，得到二溴代的混合物；
第二步：二(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸叔丁基酯)-二甲基吡嗪((tBu-DO3A)2-BMP)的合成
氮气保护下，将三-叔-丁基2，2′，2″-(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸酯.溴化氢盐酸盐(tBu-DO3A·HBr)和NaHCO3加入圆底烧瓶中，加入干燥的乙腈溶解，得到混合溶液，将步骤一中得到的二溴代的混合物加入到上述混合溶液中，反应回流过夜，得到反应产物，产物用硅胶柱分离，最终得(tBu-DO3A)2-BMP浅橙色固体粉末；
第三步：除去叔丁基保护基团
氮气保护下，将步骤二中得到的(tBu-DO3A)2-BMP溶解于三氟乙酸中，于0℃～10℃下搅拌，再于室温下反应24～48小时，停止反应后，减压蒸馏除掉溶剂三氟乙酸，得到油状物，将得到的油状物溶解于甲醇中，冷却至0℃～5℃，向体系中缓慢滴加乙醚，直至沉淀完全，过滤，真空干燥得(DO3A)2-BMP茶色粉末状固体；
第四步：与钆离子螯合
将GdCl3溶液加入步骤三得到的(DO3A)2-BMP水溶液中，于50℃～80℃下反应24小时～48小时，即得到二(钆合(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸))-二甲基吡嗪((Gd-DO3A)2-BMP)，所述的(DO3A)2-BMP与GdCl3摩尔比为1∶2。
所述的步骤二中的反应温度为77℃～90℃；
所述的步骤二中NaHCO3和tBu-DO3A·HBr摩尔比为5∶1；
所述的步骤四中水溶液的PH值为6-7.5。
发明原理：本发明以2，5-二甲基吡嗪为连接体的二核磁共振成像造影剂，是在刚性连接基团2，5-二甲基吡嗪上同时共价连接两个DO3A基团，再与顺磁性金属离子Gd3+配合而得到的；除了DO3A中大环的四个氮原子和环上的三个羧酸基参与顺磁离子的配位以外，2，5-二甲基吡嗪上的氮原子也参与配位，这个配位键的形成，既增强了顺磁离子与化合物配合的稳定性，又使得连接2，5-二甲基吡嗪和DO3A的C-C键和C-N键不再自由旋转，C-C键和C-N键的自由旋转受限，使DO3A和顺磁离子的旋转与2，5-二甲基吡嗪更加一致，在客观上延长了顺磁离子的旋转相关时间，使造影剂的弛豫效率提高。
本发明的造影剂在水溶液中稳定存在，且有极好的水溶性，都可以按照常规方法使用，方便使用，并且利于贮存，将其作为注射液使用，将其静脉注射到诊断对象包括人体或其它哺乳动物体内，然后直接进行磁共振成像检测，即可得到效果增强的磁共振成像图；本发明中的造影剂的给药量因外界条件的不同而有所不同，例如，诊断仪器型号(磁场强弱)，诊断对象用药部位等，但是比现在临床应用的单核小分子钆类造影剂用药量偏低，由于其弛豫效率提高50％以上，一般来说，作为具有潜在临床应用的造影剂，诊断对象主要为人类或其他哺乳类动物，故用药量可以为每千克体重0.1～0.5毫摩尔。
本发明的有益效果：
1、本发明采用刚性连接体构建二核造影剂，其顺磁离子的旋转与整个分子的旋转较之使用柔性链更加同步，本发明的造影剂与现在临床应用的大环类造影剂Gd-DOTA、Gd-HP-DO3A相比，提高了50％以上，(Gd-DO3A)2-BMP的弛豫效率可达到5.5mM-1s-1。
2、本发明的造影剂采用可以提供顺磁离子配位的基团为连接体，提高了造影剂的稳定性；
3、本发明的造影剂采用大环类DO3A作为螯合钆离子的单体，以提高造影剂的热力学和动力学稳定性并且保证整个造影剂分子成中性不带电荷，即非离子性造影剂；
4、本发明的造影剂毒性低，毒性实验结果表明：造影剂(Gd-DO3A)2-BMP用半数抑制浓度(IC50)来表征其毒性大小为：6.8毫摩尔/升。
附图说明
图1本发明实施例1制备的造影剂(Gd-DO3A)2-BMP的质谱图；
图2本发明实施例1制备的造影剂(Gd-DO3A)2-BMP的纵向弛豫速率1/T1随Gd3+浓度变化的线性关系图；
图3为(Tb-DO3A)2-BMP的静态磷光谱图；
图4为(Tb-DO3A)2-BMP在普通水溶液和氘代水溶液中的磷光衰减曲线图；
图5为本发明实施例2制备的造影剂(Gd-DO3A)2-BMP的紫外-可见吸收谱图；
图6本发明实施例3造影剂(Gd-DO3A)2-BMP的细胞存活率随Gd3+浓度变化的细胞毒性图。
具体实施方式
以2，5-二甲基吡嗪为连接体的二核磁共振成像造影剂，该造影剂是在2，5-二甲基吡嗪上同时共价连接两个DO3A(2，2′，2″-(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸)；2，2′，2″-(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7-triyl)triaceticacid)基团，每个DO3A再分别与一个顺磁离子Gd3+形成配合物，具有如下结构：
以2，5-二甲基吡嗪为连接体的二核磁共振成像造影剂的制备方法，该方法由以下步骤实现：
步骤一：2，5-二(溴甲基)吡嗪的合成
氮气保护下，在圆底烧瓶中加入2，5-二甲基吡嗪和N-溴代丁二酰亚胺，再加入四氯化碳溶解，加热至80℃～90℃回流，反应30～45分钟，得到混合溶液，所述的N-溴代丁二酰亚胺与2，5-二甲基吡嗪的摩尔比为2∶1，在混合溶液中加入2，5-二甲基吡嗪质量的5％的过氧化苯甲酰，继续反应回流4小时，再加入2，5-二甲基吡嗪质量的4％的过氧化苯甲酰，回流反应4小时，最后加入2，5-二甲基吡嗪质量的3％的过氧化苯甲酰，回流过夜，停止反应，冷却至室温，过滤除去体系中的固体，减压蒸馏下除去溶剂四氯化碳，得到反应产物，将反应产物用硅胶柱分离，洗脱液为二氯甲烷和正己烷的混合液，得到二溴代的混合物；所述的二溴代的混合物包括2，5-二(溴甲基)吡嗪和2-(二溴甲基)-5-甲基吡嗪；
步骤二：二(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸叔丁基酯)-二甲基吡嗪((tBu-DO3A)2-BMP)的合成
氮气保护下，将三-叔-丁基2，2′，2″-(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸酯.溴化氢盐酸盐(tBu-DO3A·HBr)和NaHCO3加入圆底烧瓶中，加入干燥的乙腈溶解，升温至77℃～90℃，反应20～40分钟，得到混合溶液，将步骤一中得到的二溴代的混合物分5-9次加入到上述混合溶液中，反应回流过夜，停止反应，冷却至室温，过滤除去无机盐，减压蒸馏除去溶剂乙腈，得到反应产物，产物用硅胶柱分离，洗脱液为二氯甲烷和甲醇的混合液，减压蒸馏除去洗脱液，最终得(tBu-DO3A)2-BMP浅橙色固体粉末；所述的NaHCO3和tBu-DO3A·HBr的摩尔比为5∶1；所述的二溴代的混合物加入量是根据薄层色谱分析(TLC)，以确定原料tBu-DO3A·HBr反应完全为最佳投入量；
步骤三：除去叔丁基保护基团
氮气保护下，将步骤二中得到的(tBu-DO3A)2-BMP溶解于三氟乙酸中，于0℃～10℃下搅拌30分钟-1小时，再于室温下反应24～48小时，停止反应后，减压蒸馏除掉溶剂三氟乙酸，再依次用甲醇，二氯甲烷共沸蒸馏，以除去剩余的三氟乙酸，得到油状物，将得到的油状物溶解于甲醇中，冷却至0℃～5℃，向体系中缓慢滴加乙醚，直至沉淀完全，于0℃～5℃继续搅拌10～20分钟，过滤，真空干燥得(DO3A)2-BMP茶色粉末状固体；
步骤四：与钆离子螯合
将上述步骤三得到的(DO3A)2-BMP加入二次水溶解，滴加碱溶液至(DO3A)2-BMP水溶液PH值为6-7.5，将GdCl3溶液加入(DO3A)2-BMP水溶液中，于50℃～80℃下反应24～48小时，以保证钆离子螯合完全，二甲基酚橙检测无游离钆离子，即得到二(钆合(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸))-二甲基吡嗪((Gd-DO3A)2-BMP)，所述的(DO3A)2-BMP与GdCl3摩尔比为1∶2，所述碱溶液为NaOH溶液。
所述的以2，5-二甲基吡嗪为连接体的二核磁共振成像造影剂合成路线如下：
实施例1、(Gd-DO3A)2-BMP的合成
步骤一：2，5-二(溴甲基)吡嗪的合成
氮气保护下，在250毫升圆底烧瓶中，加入1.08克2，5-二甲基吡嗪，3.55克N-溴代丁二酰亚胺，100毫升四氯化碳，搅拌，加热至90℃回流，反应45分钟，得到混合溶液，在混合溶液中加入54毫克过氧化苯甲酰，继续反应回流4小时，再加入43毫克过氧化苯甲酰，回流反应4小时，最后加入32毫克过氧化苯甲酰，回流过夜，停止反应，冷却至室温，过滤除去体系中的固体，减压蒸馏下除去溶剂四氯化碳，产物用硅胶柱分离，洗脱液为体积比5∶1的二氯甲烷和正己烷，得到二溴代的混合物2，5-二(溴甲基)吡嗪1.1克；
步骤二：(tBu-DO3A)2-BMP的合成
氮气保护下，将2.1克tBu-DO3A·HBr，1.43克NaHCO3加入到50毫升圆底烧瓶中，加入20毫升干燥过的乙腈溶解，缓慢升温至90℃，反应20分钟，将0.915克(二溴代混合物的加入量是根据在反应过程中，TLC点板跟踪，直至原料tBu-DO3A·HBr反应完全而加入的)第一步中得到的二溴代的混合物分7次加入到反应体系中，反应回流过夜，停止反应，冷却至室温，过滤除去无机盐，减压蒸馏除去溶剂乙腈，产物用硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为70∶5的二氯甲烷和甲醇的混合液，减压蒸馏除去洗脱液，最终得1.14克(tBu-DO3A)2-BMP浅橙色固体粉末；
步骤三：除去叔丁基保护基团
氮气保护下，将上一步中得到的1.14克浅橙色固体粉末溶解于15毫升三氟乙酸中，于0℃下搅拌1小时，撤去冰水浴，室温下反应48小时，停止反应，减压蒸馏下除去溶剂三氟乙酸，加入30毫升甲醇溶解，再减压蒸馏除去甲醇，重复三次；接着加入30毫升二氯甲烷，减压蒸馏除去二氯甲烷，重复三次，，得到油状物，将得到的油状物溶解于少量的甲醇中，冷却至5℃，向体系中慢慢滴加冷的乙醚，直至沉淀完全，于5℃继续搅拌10分钟，过滤，真空干燥得0.9克(DO3A)2-BMP茶色粉末状固体；
步骤四：与钆离子螯合
称取(DO3A)2-BMP(0.0387g，0.03mmol)加入5ml二次水溶解，滴加1MNaOH至pH＝6.5，加入GdCl3水溶液(182uL，0.06mmol)，于50℃下反应24h，即得到二(钆合(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸))-二甲基吡嗪((Gd-DO3A)2-BMP)。
图1本发明实施例1制备的造影剂(Gd-DO3A)2-BMP的质谱图，其质谱(ES-)离子峰的理论值为1105.2，从图1可以看出，离子峰为1105.5，与理论值完全吻合，谱图1中的1099.3，1100.3，1101.6，1103.2，1107.6，1109.2是(Gd-DO3A)2-BMP的同位素离子峰。
图2本发明实施例1制备的造影剂(Gd-DO3A)2-BMP的纵向弛豫速率1/T1随Gd3+浓度变化的线性关系图，从图中可知，(Gd-DO3A)2-BMP的弛豫效率在20MHz，32℃条件下以钆离子浓度计算为5.5mM-1s-1，与现在临床应用的大环类造影剂Gd-DOTA(Dotarem，多它灵)，Gd-HP-DO3A(ProHance，普络显思)相比，提高了50％以上。
实施例2、(Gd-DO3A)2-BMP的合成
步骤一：2，5-二(溴甲基)吡嗪的合成
氮气保护下，在100毫升圆底烧瓶中，加入0.5克2，5-二甲基吡嗪，1.77克N-溴代丁二酰亚胺，50毫升四氯化碳，搅拌，加热至80℃，反应30分钟，得到混合溶液，在混合溶液中加入25毫克过氧化苯甲酰，继续反应回流4小时，再加入20毫克过氧化苯甲酰，回流反应4小时，最后加入15毫克过氧化苯甲酰，回流过夜，停止反应，冷却至室温，过滤除去体系中的固体，减压蒸馏下除去溶剂四氯化碳，产物用硅胶柱分离，洗脱液为体积比5∶1的二氯甲烷和正己烷，得到二溴代的混合物0.7克；
步骤二：(tBu-DO3A)2-BMP的合成
氮气保护下，将1.1克tBu-DO3A·HBr，0.8克NaHCO3加入到50毫升圆底烧瓶中，加入10毫升干燥过的乙腈溶解，缓慢升温至77℃，反应30分钟，得到混合溶液，将0.7克(二溴代混合物的加入量是根据在反应过程中，TLC点板跟踪，直至原料tBu-DO3A·HBr反应完全而加入的)第一步中得到的二溴代的混合物分5次加入到上述混合溶液中，反应回流过夜，停止反应，冷却至室温，过滤除去无机盐，减压蒸馏除去溶剂乙腈，产物用硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为70∶5的二氯甲烷和甲醇的混合液，减压蒸馏除去洗脱液，最终得0.65克(tBu-DO3A)2-BMP浅橙色固体粉末；
步骤三：除去叔丁基保护基团
氮气保护下，将上一步中得到的0.65克浅橙色固体粉末溶解于8毫升三氟乙酸中，于5℃下搅拌0.5小时，室温下反应24小时，停止反应，减压蒸馏下除去溶剂三氟乙酸，加入30毫升甲醇溶解，再减压蒸馏除去甲醇，重复三次；接着加入30毫升二氯甲烷，减压蒸馏除去二氯甲烷，重复三次，得到油状物，将得到的油状物溶解于少量的甲醇中，冷却至0℃，向体系中慢慢滴加冷的乙醚，直至沉淀完全。于0℃继续搅拌20分钟，过滤，真空干燥得0.5克(DO3A)2-BMP茶色粉末状固体；
步骤四：与钆离子螯合
称取(DO3A)2-BMP(0.0387g，0.03mmol)加入5ml二次水溶解，滴加1MNaOH至pH＝6.5，加入GdCl3水溶液(182uL，0.06mmol)，于77℃下反应48小时，即得到二(钆合(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸))-二甲基吡嗪((Gd-DO3A)2-BMP)。实施例2制备的造影剂(Gd-DO3A)2-BMP的弛豫效率在20MHz，32℃条件下以钆离子浓度计算为5.5mM-1s-1。
造影剂中与钆离子直接配位的内配层水分子数直接影响造影剂的弛豫效率，但同时，配位水分子数目的增加将引起造影剂热力学和动力学稳定性的下降，使得钆离子在体内环境下(含40多毫摩尔浓度的磷酸根离子及其它可与阳离子配位的配体分子)，从造影剂分子中解离，转而与其它离子结合。这个金属离子转移过程(transmetallation)，对人体有害，图3为(Tb-DO3A)2-BMP的静态磷光谱图，相应的激发波长分别为290纳米，通过铽离子(Tb3+)取代的化合物(Tb-DO3A)2-BMP在普通水(H2O)溶液和氘代水(D2O)溶液中磷光寿命的变化，可知实施例2制备的造影剂(Gd-DO3A)2-BMP中金属离子的配位水分子数目为1。
图4为(Tb-DO3A)2-BMP在普通水溶液和氘代水溶液中的磷光衰减曲线图；从图4和表1可知，公式：
qTb＝5(1/τ1um，H2O-1/τ1um，D2O-0.06) (1)
由公式(1)可以计算出与铽离子(Tb3+)配位的内配层水分子数。
表1、(Tb-DO3A)2-BMP在普通水溶液和氘代水溶液中的磷光寿命及配位水分子数。
图5为本发明实施例2制备的造影剂(Gd-DO3A)2-BMP的紫外-可见吸收谱图，从图中可以看出，图为(DO3A)2-BMP(◆，实线)和(Gd-DO3A)2-BMP(●)的紫外-可见吸收谱，由图可知，失去钆离子的造影剂吸收谱向低波长移动，以100∶1的DTPA与(Gd-DO3A)2-BMP混合后，在室温下超过56天，其吸收谱(▲)仍旧与钆离子存在的(Gd-DO3A)2-BMP吻合，表明DTPA不能夺取(Gd-DO3A)2-BMP中的钆离子；图中下面的虚线为DTPA和DTPA-Gd的吸收谱。
如前所述，足够的热力学稳定性是造影剂用于人体的先决条件之一，在我们得到的造影剂(Gd-DO3A)2-BMP中，吡嗪环上的氮原子为钆离子提供一个额外的配位点，提高了DO3A环对钆离子的络合能力，大大增强了造影剂的热力学稳定性，我们将(Gd-DO3A)2-BMP与DTPA以1∶1、1∶10和1∶100的比例混合，连续观察混合物的紫外-可见吸收光谱超过八个星期，混合物的光谱仍然与(Gd-DO3A)2-BMP的特征谱重叠，显示没有钆离子从造影剂中解离，100倍的DTPA在室温下经过八个星期仍旧不能夺取(Gd-DO3A)2-BMP中的钆离子，说明(DO3A)2-BMP对钆离子的亲和性比DTPA更高，其热力学稳定性足以满足人体内应用的需要。
实施例3、(Gd-DO3A)2-BMP的合成
步骤一：2，5-二(溴甲基)吡嗪的合成
氮气保护下，在250毫升圆底烧瓶中，加入1.08克2，5-二甲基吡嗪，3.55克N-溴代丁二酰亚胺，100毫升四氯化碳，搅拌，加热至87℃，反应45分钟，得到混合溶液，在混合溶液中加入54毫克过氧化苯甲酰，继续反应回流4小时，再加入43毫克过氧化苯甲酰，回流反应4小时，最后加入32毫克过氧化苯甲酰，回流过夜，停止反应，冷却至室温，过滤除去体系中的固体，减压蒸馏下除去溶剂四氯化碳，得到反应产物，产物用硅胶柱分离，洗脱液为体积比5∶1的二氯甲烷和正己烷，得到二溴代的混合物1.1克；
步骤二：(tBu-DO3A)2-BMP的合成
氮气保护下，将2.1克tBu-DO3A·HBr，1.43克NaHCO3加入到50毫升圆底烧瓶中，加入20毫升干燥过的乙腈溶解，缓慢升温至90℃，反应40分钟，得到混合溶液，将1.1克(二溴代混合物的加入量是根据在反应过程中，TLC点板跟踪，直至原料tBu-DO3A·HBr反应完全而加入的)第一步中得到的二溴代的混合物分9次加入到上述混合溶液中，反应回流过夜，停止反应，冷却至室温，过滤除去无机盐，减压蒸馏除去溶剂乙腈，产物用硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为70∶5的二氯甲烷和甲醇的混合液，减压蒸馏除去洗脱液，最终得1.14克(tBu-DO3A)2-BMP浅橙色固体粉末；
步骤三：除去叔丁基保护基团
氮气保护下，将上一步中得到的1.14克浅橙色固体粉末溶解于15毫升三氟乙酸中，于10℃下搅拌45分钟，室温下反应36小时，停止反应，减压蒸馏下除去溶剂三氟乙酸，加入30毫升甲醇溶解，再减压蒸馏除去甲醇，重复三次；接着加入30毫升二氯甲烷，减压蒸馏除去二氯甲烷，重复三次，得到油状物，将得到的油状物溶解于少量的甲醇中，冷却至0℃，向体系中慢慢滴加冷的乙醚，直至沉淀完全，于0℃继续搅拌15分钟，过滤，真空干燥得0.9克(DO3A)2-BMP茶色粉末状固体；
步骤四：与钆离子螯合
称取(DO3A)2-BMP(0.0387g，0.03mmol)加入5ml二次水溶解，滴加1MNaOH至pH＝6.5，加入GdCl3水溶液(182uL，0.06mmol)，于80℃下反应30小时，即得到二(钆合(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸))-二甲基吡嗪((Gd-DO3A)2-BMP)。实施例3制备的造影剂(Gd-DO3A)2-BMP的弛豫效率在20MHz，32℃条件下以钆离子浓度计算为5.5mM-1s-1。
实施例4 造影剂(Gd-DO3A)2-BMP对人子宫颈癌细胞株(HeLa)细胞的毒性实验
1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入200ul，铺板使待测细胞调密度至3000个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)；
2.于5％CO2，37℃环境下孵育，直至细胞单层铺满96孔平底板孔底，贴壁，加入实施例3所制备的造影剂(Gd-DO3A)2-BMP，所述的造影剂浓度梯度范围为0.05毫摩尔/升至12毫摩尔/升，每孔100ul，设5个复孔，用5％胎牛血清的培养液培养；
3.继续于5％CO2，37℃的环境下孵育24小时，倒置显微镜下观察；
4.弃去培养液，用PBS冲洗3遍，再加入含0.5％MTT的培养液100ul，继续培养4h；
5.终止培养，吸去孔内培养液；
6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值；同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。
图6为实施例3制备的造影剂(Gd-DO3A)2-BMP的细胞存活率随Gd3+浓度变化的细胞毒性图，图中柱形图代表(Gd-DO3A)2-BMP，用IC50(半数细胞致死浓度)值的大小来衡量两种造影剂的毒性大小，IC50是用来衡量药物诱导凋亡的参数，即诱导能力越强，该数值越低，也可以反向说明靶细胞对药物的耐受程度越低，由此实验可以得出，(Gd-DO3A)2-BMP的24小时半数细胞致死浓度IC50值为6.8毫摩尔/升。
Claims (5)
1.以2，5-二甲基吡嗪为连接体的二核磁共振成像造影剂，其特征在于，该造影剂是在2，5-二甲基吡嗪上同时共价连接两个DO3A基团，每个DO3A基团再分别与一个顺磁离子Gd3+螯合形成配合物，具有如下结构：
2.根据权利要求1所述的以2，5-二甲基吡嗪为连接体的二核磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于，该方法由以下步骤实现：
第一步：2,5-二(溴甲基)吡嗪的合成
氮气保护下，在圆底烧瓶中加入2,5-二甲基吡嗪和N-溴代丁二酰亚胺，再加入四氯化碳溶解，加热至80℃～90℃，反应30～45分钟，得到混合溶液，所述的N-溴代丁二酰亚胺与2,5-二甲基吡嗪的摩尔比为2：1，在混合溶液中加入过氧化苯甲酰，所述的过氧化苯甲酰的加入量为2,5-二甲基吡嗪质量的12%，回流过夜，得到反应产物，将反应产物用硅胶柱分离，得到二溴代的混合物；
第二步：(tBu-DO3A)2-BMP的合成
氮气保护下，将tBu-DO3A·HBr和NaHCO3加入圆底烧瓶中，加入干燥的乙腈溶解，得到混合溶液，将步骤一中得到的二溴代的混合物加入到上述混合溶液中，反应回流过夜，得到反应产物，产物用硅胶柱分离，最终得(tBu-DO3A)2-BMP浅橙色固体粉末；
第三步：除去叔丁基保护基团
氮气保护下，将步骤二中得到的(tBu-DO3A)2-BMP溶解于三氟乙酸中，于0℃～10℃下搅拌，再于室温下反应24～48小时，停止反应后，减压蒸馏除掉溶剂三氟乙酸，得到油状物，将得到的油状物溶解于甲醇中，冷却至0℃～5℃，向体系中缓慢滴加乙醚，直至沉淀完全，过滤，真空干燥得(DO3A)2-BMP茶色粉末状固体；
第四步：与钆离子螯合
将上述步骤三得到的(DO3A)2-BMP加入二次水溶解，将GdCl3溶液加入(DO3A)2-BMP水溶液中，于50℃～80℃下反应24小时～48小时,即得到(Gd-DO3A)2-BMP，所述的(DO3A)2-BMP与GdCl3摩尔比为1：2。
3.根据权利要求2所述的以2，5-二甲基吡嗪为连接体的二核磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤二中的反应温度为77℃～90℃。
4.根据权利要求2所述的以2，5-二甲基吡嗪为连接体的二核磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤二中NaHCO3和tBu-DO3A·HBr的摩尔比为5：1。
5.根据权利要求2所述的以2，5-二甲基吡嗪为连接体的二核磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤四中水溶液的pH值为6-7.5。
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