CN103463647B - 基于萘啶酰胺为识别位点的响应型核磁共振造影剂及其制备方法 - Google Patents
基于萘啶酰胺为识别位点的响应型核磁共振造影剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种核磁共振造影剂，一种基于萘啶酰胺为识别位点的响应型核磁共振造影剂及其制备方法，是通过磷酸根与稀土离子之间配位作用和类碱基互补氢键作用来调节造影剂的弛豫效能，实现了对在生命体中起重要作用的鸟嘌呤单磷酸（GMP）的目标靶向传感，表现出对GMP具有较好的选择性；从MCF-7(人乳腺癌细胞)细胞毒性试验中可看出，在造影剂浓度为0.4mM条件下孵育24小时，细胞存活率仍保持在95%以上，说明该造影剂细胞毒性极小；通过对小鼠腹腔注射采集不同时间点目标区域的成像强度表明，在注射后48小时内仍然能产生持续造影增强，由于该造影剂低毒性和适宜的体内滞留时间，所以在临床诊断中具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种核磁共振造影剂，具体地说，涉及一种基于萘啶酰胺为识别位点的响应型核磁共振造影剂及其制备方法。
背景技术
核磁共振成像（Nuclear Magnetic Resonance Imaging，简称NMRI），又称自旋成像（spin imaging），也称磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，简称MRI），由于其具有非进入性、高分辨解剖学成像、对生命体无毒无损伤等优点，已成为临床医学诊断中常规诊断技术。核磁共振成像是依据人体中水质子在外加磁场条件下由高能氢核弛豫到低能态核而产生影像，影像质量受人体内水质子密度和分布状况影响，诸多情形下无法获得清晰的磁共振影像解剖图，很难对疾病和损伤进行准确判断。造影剂可以改变其周围水质子的弛豫时间，增加检测目标部位与周围背景组织的磁共振对比度，改善NMRI的灵敏度和准确度。
目前广泛用于临床的钆造影剂中，DOTA大环类钆造影剂由于其高的动力学和热力学稳定性，低毒性而备受人关注。其中非离子型造影剂由于其较低的渗透压，不会造成血管的额外损伤而更受人们的青睐。这些性能优异的造影剂均能有效地增加周围水分子的弛豫速率，改善造影效果。但是不具备“smart”特征，即不能对生命体系中特定的物种或反应产生灵敏的信号响应。目前响应型核磁造影剂的合成和应用主要集中在与生命和环境相关的无机金属离子（如，Cu，Zn，Hg,Ca等）（Chem.Soc.Rev.,2010,39,51–60），对于与生命相关的生物小分子有特定响应的小分子核磁造影剂制备一直未能有效成行。原因是无法解决造影剂响应机制和识别机制之间的矛盾，即：核磁造影剂有效工作的条件是水环境，而该条件下进行识别生物分子的非共价相互作用会受到制约。核苷酸作为一类重要的生物小分子，在能量传递，基因表达等诸多生命过程中起着极其重要的作用。并且在许多生理过程异常，或机体发生病变时均伴随着某种核苷酸的异常表达。因此，实现体内核苷酸成像检测显得尤为重要，这将为由基因异常引起的内源性疾病的诊断和监测提供便利。目前光学成像技术受限于其有限的穿透能力还无法提供不透明组织的深层的解剖学信息，不能对病变部位进行准确的诊断。对核苷酸有特定响应的核磁造影剂的制备有望解决上述问题，并将会在医学诊断治疗领域有很好的应用前景。
发明内容
为了克服现有技术中存在的不足，本发明的目的是将对核酸碱基有识别功能的2-氨基-1,8-萘啶嫁接Gd-DOTA造影剂上，制备出对核苷酸具有选择性响应的非离子型核磁造影剂，该造影剂不但对GMP有选择性的响应，并且还应用于小鼠模型核磁共振成像。
为了实现上述发明目的,解决现有技术中所存在的问题，本发明采取的技术方案是：基于萘啶酰胺为识别位点的响应型核磁共振造影剂，是将N-(7-溴甲基-[1,8]萘啶)-2-乙酰氨从7位苄溴连接到Ln-DO3A骨架的一个仲胺氮原子上，萘啶8位氮原子与中心稀土离子Ln配位键合,具有如下分子结构式：
式中，所述中心稀土离子Ln选自Gd（Ⅲ）、Tb（Ⅲ）或Eu（Ⅲ）其中的一种。
基于萘啶酰胺为识别位点的响应型核磁共振造影剂的制备方法，包括以下步骤：
（a）、将1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸叔丁酯、N-(7-溴甲基-[1,8]萘啶)-2-乙酰氨溶于DMF与乙腈体积比为1:1的混合溶液中，随后加入碳酸铯投放到反应釜中，在氩气氛围中，温度控制在55～65度，搅拌20～28小时，所述1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸叔丁酯与所述N-(7-溴甲基-[1,8]萘啶)-2-乙酰氨的摩尔比为1:1-2,所述1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸叔丁酯与所述碳酸铯的摩尔比为1:1～2；
（b）、将步骤（a）获得的反应液进行过滤、洗涤、干燥，除掉DMF、乙腈后，再用乙酸乙酯重结晶，制得呈白色粉末状的第一中间化合物Bu-DO3A-NAND；
（c）、将步骤（b）获得的第一中间化合物Bu-DO3A-NAND溶于二氯甲烷中，然后缓慢滴加三氟乙酸溶液，室温均匀搅拌36～48小时，除去二氯甲烷后，溶于1～2mL甲醇中，加入0～5度乙醚，使沉淀完全，过滤，真空干燥制得呈淡黄色粉末状的第二中间化合物DO3A-NAND，所述三氟乙酸与所述二氯甲烷的体积比为1:1～2；
（d）、将步骤（c）获得的第二中间化合物DO3A-NAND溶于2～3mL甲醇与水体积比为1:1的混合溶液中，向其中加入Gd(NO3)3·6H2O，采用NaOH调节溶液pH值为5～6,室温均匀搅拌36～48小时，除去甲醇与水后，过反相色谱柱，制得目标化合物Gd-DO3A-NAND，所述第二中间化合物DO3A-NAND与所述Gd(NO3)3·6H2O的摩尔比为1:1～2。
（e）、重复制备方法步骤（a）、（b）及（c），将步骤（c）获得的第二中间化合物DO3A-NAND溶于2～3mL甲醇与水体积比为1:1的混合溶液中，向其中加入Eu(NO3)3·6H2O，采用NaOH调节溶液pH值为5～6,室温均匀搅拌36～48小时，除去甲醇与水后，过反相色谱柱，制得目标化合物Eu-DO3A-NAND，所述第二中间化合物DO3A-NAND与所述Eu(NO3)3·6H2O的摩尔比为1:1～2。
（f）、重复制备方法步骤（a）、（b）及（c），将步骤（c）获得的第二中间化合物DO3A-NAND溶于2～3mL甲醇与水体积比为1:1的混合溶液中，向其中加入Tb(NO3)3·6H2O，采用NaOH调节溶液pH值为5～6,室温均匀搅拌36～48小时，除去甲醇与水后，过反相色谱柱，制得目标化合物Tb-DO3A-NAND，所述第二中间化合物DO3A-NAND与所述Tb(NO3)3·6H2O的摩尔比为1:1～2。
本发明有益效果是：一种基于萘啶酰胺为识别位点的响应型核磁共振造影剂是通过磷酸根与稀土离子之间配位作用和类碱基互补氢键作用来调节造影剂的弛豫效能，实现了对在生命体中起重要作用的鸟嘌呤单磷酸（GMP）的目标靶向传感，表现出对GMP具有较好的选择性；从MCF-7(人乳腺癌细胞)细胞毒性试验中可看出，在造影剂浓度为0.4mM条件下孵育24小时，细胞存活率仍保持在95%以上，说明该造影剂细胞毒性极小；通过对小鼠腹腔注射采集不同时间点目标区域的成像强度表明，在注射后48小时内仍然能产生持续造影增强，由于该造影剂低毒性和适宜的体内滞留时间，所以在临床诊断中具有很好的应用前景。
附图说明
图1是造影剂分子晶体结构图。
图2是造影剂纵向弛豫速率（1/T1）对造影剂浓度变化图。
图3是造影剂对核苷酸选择性响应图。
图4是造影剂弛豫效能和强度随GMP浓度的变化图。
图5是造影剂对MCF-7细胞毒性试验图。
图6是造影剂对小鼠成像实验图。
图7是造影剂在小鼠体内滞留时间实验图。
图8是造影剂核磁滴定实验图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1（造影剂Gd-DO3A-NAND的制备）
将2.3mM N-(7-溴甲基-[1,8]萘啶-2-基)-乙酰氨和1.9mM1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸叔丁酯溶于体积比为1:1CH3CN/DMF溶液中，加入2.8mM碳酸铯，通氩气，60度加热搅拌24小时，冷至室温，过滤并用乙腈洗涤沉淀，合并滤液，用乙酸乙酯稀释后再用盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏得黄色油状物，黄色油状物用乙酸乙酯重结晶得到白色固体（Bu-DO3A-NAND）（0.7845g,57.8%）。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.20(s,1H)，8.49(d,2H)，8.09(t,2H),7.37(d,2H),3.90(s,2H),3.20(d,4H),2.92(s,2H),2.63(bs,9H),2.42(s,6H),1.78(bs,5H),1.47(s,9H),1.27(s,18)TOF-ESI-MS.Calcd for[M+H+]714.4554Found:m/z714.2565.Calcd for[M+2H+]357.7316.Found:m/z357.6277。取200mgBu-DO3A-NAND溶于二氯甲烷中，向其中加入由二氯甲烷（2mL）稀释的三氟乙酸1.5mL，溶液室温搅拌36小时后，减压蒸发除去溶剂，得淡黄色油状物，油状物溶于1ml甲醇中，加入零度的乙醚，使沉淀完全，过滤，用冷的乙醚洗涤，得到淡黄色固体DO3A-NAND(80mg,52.4%).1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.34(d,1H),8.24(d,1H),7.92(d,1H),7.42(d,1H),4.01(d,2H),3.87(bs,4H),3.67(m,4H),3.52(m,2H),3.32-3.01(m,16H),2.28(s,3H),TOF-ESI-MS.Calcd for[M+H+]:m/z546.2676.Found:m/z546.3442.[M+Na+]:m/z568.2495.Found:m/z568.3301。将10μM DO3A-NAND和12μM的Gd(NO3)3·6H2O溶于体积比为1:1的甲醇/水混合溶剂中，用1M的氢氧化钠溶液调溶液的pH为5.5，混合液在室温搅拌36小时，减压蒸发浓缩，过C18反相柱除去过量的Gd(NO3)3，得白色固体Gd-DO3A-NAND。并用ICP-OES测定其中Gd的含量19.9wt%。TOF-ESI-MS.Calcd for[M+Na+]:m/z723.1501.Found:m/z723.1194。
实施例2（造影剂Eu-DO3A-NAND的制备）
将2.0mM N-(7-溴甲基-[1,8]萘啶-2-基)-乙酰氨和1.9mM1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸叔丁酯溶于体积比为1:1CH3CN/DMF溶液中，加入2.5mM碳酸铯，通氩气，60度加热搅拌48小时，冷至室温，过滤并用乙腈洗涤沉淀，合并滤液，用乙酸乙酯稀释后再用盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏得黄色油状物，黄色油状物用乙酸乙酯重结晶得到白色固体（Bu-DO3A-NAND）（0.860g,63.5%）。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.20(s,1H)，8.49(d,2H)，8.09(t,2H),7.37(d,2H),3.90(s,2H),3.20(d,4H),2.92(s,2H),2.63(bs,9H),2.42(s,6H),1.78(bs,5H),1.47(s,9H),1.27(s,18)TOF-ESI-MS.Calcd for[M+H+]714.4554Found:m/z714.2565.Calcd for[M+2H+]357.7316.Found:m/z357.6277。取200mgBu-DO3A-NAND溶于二氯甲烷中，向其中加入由二氯甲烷（2mL）稀释的三氟乙酸1.5mL，溶液室温搅拌48小时后，减压蒸发除去溶剂，得淡黄色油状物，油状物溶于1ml甲醇中，加入零度的乙醚，使沉淀完全，过滤，用冷的乙醚洗涤，得到淡黄色固体DO3A-NAND(75mg,49.1%).1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.34(d,1H),8.24(d,1H),7.92(d,1H),7.42(d,1H),4.01(d,2H),3.87(bs,4H),3.67(m,4H),3.52(m,2H),3.32-3.01(m,16H),2.28(s,3H),TOF-ESI-MS.Calcd for[M+H+]:m/z546.2676.Found:m/z546.3442.[M+Na+]:m/z568.2495.Found:m/z568.3301。将10μM DO3A-NAND和12μM的Eu(NO3)3·6H2O溶于体积比为1:1的甲醇/水混合溶剂中，用1M的氢氧化钠溶液条溶液的pH为6.0，混合液在室温搅拌48小时，减压蒸发浓缩，过C18反相柱除去过量的Eu(NO3)3，得白色固体Eu-DO3A-NAND.并用ICP-OES测定其中Eu的含量20.1wt%。TOF-ESI-MS.Calcd for[Eu-ANAMD+Na+]:m/z718.1473.Found:m/z718.1461。
实施例3（造影剂Tb-DO3A-NAND的制备）
将2.2mM N-(7-溴甲基-[1,8]萘啶-2-基)-乙酰氨和2.0mM1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸叔丁酯溶于体积比为1:1CH3CN/DMF溶液中，加入2.2mM碳酸铯，通氩气，60度加热搅拌48小时，冷至室温，过滤并用乙腈洗涤沉淀，合并滤液，用乙酸乙酯稀释后再用盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏得黄色油状物，黄色油状物用乙酸乙酯重结晶得到白色固体（Bu-DO3A-NAND）（0.8845g,62.0%）。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.20(s,1H)，8.49(d,2H)，8.09(t,2H),7.37(d,2H),3.90(s,2H),3.20(d,4H),2.92(s,2H),2.63(bs,9H),2.42(s,6H),1.78(bs,5H),1.47(s,9H),1.27(s,18)TOF-ESI-MS.Calcd for[M+H+]714.4554Found:m/z714.2565.Calcd for[M+2H+]357.7316.Found:m/z357.6277。取400mgBu-DO3A-NAND溶于二氯甲烷中，向其中加入由二氯甲烷（4mL）稀释的三氟乙酸3mL，溶液室温搅拌48小时后，减压蒸发除去溶剂，得淡黄色油状物，油状物溶于2ml甲醇中，加入零度的乙醚，使沉淀完全，过滤，用冷的乙醚洗涤，得到淡黄色固体DO3A-NAND(205mg,67.04%).1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.34(d,1H),8.24(d,1H),7.92(d,1H),7.42(d,1H),4.01(d,2H),3.87(bs,4H),3.67(m,4H),3.52(m,2H),3.32-3.01(m,16H),2.28(s,3H),TOF-ESI-MS.Calcd for[M+H+]:m/z546.2676.Found:m/z546.3442.[M+Na+]:m/z568.2495.Found:m/z568.3301。将10μM DO3A-NAND和12μM倍的Tb(NO3)3·6H2O溶于体积比为1:1的甲醇/水混合溶剂中，用1M的氢氧化钠溶液条溶液的pH为5，混合液在室温搅拌48小时，加压蒸发浓缩，过C18反相柱除去过量的Tb(NO3)3，得白色固体Tb-DO3A-NAND.并用ICP-OES测定其中Tb的含量18.9wt%。TOF-ESI-MS.Calcd for[Tb-ANAMD+Na+]:m/z724.1514.Found:m/z724.0413。通过乙醇溶剂挥发得到Tb-DO3A-NAND的晶体，晶体结构分析图如图1所示。
实施例4（弛豫效能的测定）
采用逐级稀释法分别配置1mM,0.5mM,0.25mM,0.125MmGd-DO3A-NAND造影剂标准溶液，依次测定每个标准溶液的纵向弛豫时间T1，由1/T1对造影剂浓度作图，其直线斜率即为造影剂的弛豫效能r1=5.48mM-1·s-1.结果如图2所示。
实施例5（核苷酸的选择性响应测定）
称取造影剂分子Gd-DO3A-NAND30mg，配制成10mM的水的标准储备液，核苷酸ADP,ATP,AMP,CDP,CTP,CMP,GDP,GTP,GMP,UDP,UTP,UMP及磷酸钠，焦磷酸钠分别配成10mM储备液。取造影剂储备液10uL加入到1mL浓度为50mM、pH为7.4的HEPES缓冲溶液中，震荡摇匀测定其弛豫效能（r0），然后加入10uL的核苷酸或磷酸盐，在相同条件下测定弛豫效能(r)，计算其弛豫效能的相对变化值，结果如图3所示。GMP引起弛豫效能相对变化最大，表明造影剂对GMP产生较好的选择性响应。
实施例6（弛豫效能和强度随GMP浓度的变化）
称取造影剂分子30mg，配制成10mM的水的标准储备液（1），再配置10mM的GMP的储备液（2）。量取储备液（1）0.1mL加入到1mL浓度为50mM、pH为7.4的HEPES缓冲溶液中，震荡摇匀，加入计算量的储备液（2），配制成标准测试溶液。分别测定其弛豫效能和成像强度，测试结果如图4所示。随着GMP浓度的增加，造影剂的弛豫效能逐渐降低如曲线图所示，造影剂溶液的成像亮度随之降低如圆形幻影图a、b、c所示。其中，图a为Gd-DO3A-NAND磁共振成像图，图b为Gd-DO3A-NAND和0.4倍GMP混合溶液的磁共振成像图，图c为Gd-DO3A-NAND和1.0倍GMP混合溶液的磁共振成像图。
实施例7（造影剂对MCF-7细胞毒性试验）
调整细胞密度，每孔5万个细胞，37℃和5%CO2环境下孵育24小时。加入造影剂，其浓度梯度分别为0,20,50,150,250and400μM，设5个复孔，用细胞培养液在37℃和5%CO2环境下分别孵育6小时和24小时。弃去培养液，用PBS洗三遍，再向每个孔中加入MTT(0.5mL;5mg/mL)，继续培养4小时，洗去培养液，每孔中加入0.5mL DMSO，震荡10分钟，在酶联免疫检测仪OD570处测定各孔的吸光值(药物组)，同时设置空白孔（培养基）、阴性对照孔（细胞+培养基）和背景对照孔（药物+培养基）。利用OD570处吸光值计算细胞存活率=[(药物组吸光值-背景对照组吸光值)/(阴性对照吸光值-空白吸光值)]×100%，利用存活率对浓度作图，如图5所示。其中“control”对应为不加造影剂的细胞存活率，实验结果显示细胞存活率均在90%以上。
实施例8（小鼠成像实验）
取体重10g的小白鼠，麻醉后用1mL注射器通过背部皮下注射打入造影剂Gd-DO3A-NAND（0.3mL，10mM），在小动物核磁成像仪上扫描成像，然后在相同部位注入等量的GMP，在相同成像条件下成像，得截面图和矢状图，如图6所示。其中，图a、a＇分别是注射造影剂前小鼠成像截面图和矢状图，图b、b＇分别是注射造影剂后小鼠成像截面图和矢状图，图c、c＇分别是注射GMP后小鼠成像截面图和矢状图。
实施例9（造影剂小鼠体内滞留时间实验）
取20g重的小白鼠，通过腹腔注射0.5mL10mM实施例3的造影剂,分别在0、0.5、3、24和48小时测定相同部位的核磁成像强度，如图7所示，每一时间点在相同位置两个不同成像厚度成像。其中，图a、a＇是注射造影剂前小鼠两个不同成像厚度成像，图b、b＇是注射造影剂0.5小时小鼠两个不同成像厚度成像，图c、c＇是注射造影剂3小时小鼠两个不同成像厚度成像，图d、d＇是注射造影剂24小时小鼠两个不同成像厚度成像，图e、e＇是注射造影剂48小时小鼠两个不同成像厚度成像。
实施例10（Tb-DO3A-NAND磷光寿命测定）
在荧光寿命测定仪上激发波长为360nm，测定Tb-DO3A-NAND在普通水
表1
和氘代水中的荧光寿命，然后向其中分别加入等量的GMP,测定其荧光寿命。利用公式q=4(1/τH2O-1/τD2O)计算内层配为水的个数，如表1所示。
实施例11（Eu-DO3A-NAND核磁滴定实验）
取化合物Eu-DO3A-NAND溶于0.5mL体积比为4:1的氘代DMSO/D2O中，得5mM测试液（1），取GMP溶于0.5mL体积比为4:1的氘代DMSO/D2O，中得10mM测试液（2）。测定测试液（1）1HNMR光谱和31PNMR，然后加入等量的测试液（2），测定1HNMR光谱31PNMR,如图8所示。图中，a为GMP核磁曲线，b为GMP和Eu-DO3A-NAND混合液的核磁曲线，c为Eu-DO3A-NAND核磁曲线。实验结果显示氢核磁共振谱和磷核磁共振谱均产生了明显位移，说明造影剂与GMP之间发生相互作用。
Claims (2)
1.基于萘啶酰胺为识别位点的响应型核磁共振造影剂，其特征在于：将N-(7-溴甲基-[1,8]萘啶)-2-乙酰氨从7位苄溴连接到Ln-DO3A骨架的一个仲胺氮原子上，萘啶8位氮原子与中心稀土离子Ln配位键合,具有如下分子结构式：
式中，所述中心稀土离子Ln选自Gd（Ⅲ）、Tb（Ⅲ）或Eu（Ⅲ）其中的一种。
2.一种制备权利要求1所述基于萘啶酰胺为识别位点的响应型核磁共振造影剂的方法，其特征在于包括以下步骤：
（a）、 将1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸叔丁酯、N-(7-溴甲基-[1,8]萘啶)-2-乙酰氨溶于DMF与乙腈体积比为1:1的混合溶液中，随后将碳酸铯投放到反应釜中，在氩气氛围中，温度控制在55～65度，搅拌20～28小时，所述1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸叔丁酯与所述N-(7-溴甲基-[1,8]萘啶)-2-乙酰氨的摩尔比为1:1-2,所述 1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸叔丁酯与所述碳酸铯的摩尔比为1:1～2；
（b）、将步骤（a）获得的反应液进行过滤、洗涤、干燥，除掉DMF、乙腈后，再用乙酸乙酯重结晶，制得呈白色粉末状的第一中间化合物Bu-DO3A-NAND；
（c）、将步骤（b）获得的第一中间化合物Bu-DO3A-NAND溶于二氯甲烷中，然后缓慢滴加三氟乙酸溶液，室温均匀搅拌36～48小时，除去二氯甲烷后，溶于1～2mL甲醇中，加入0～5度乙醚，使沉淀完全，过滤，真空干燥制得呈淡黄色粉末状的第二中间化合物DO3A-NAND，所述三氟乙酸与所述二氯甲烷的体积比为1:1～2；
（d）、将步骤（c）获得的第二中间化合物DO3A-NAND溶于2～3mL甲醇与水体积比为1:1的混合溶液中，向其中加入Gd(NO3 ) 3 · 6H2 O，采用NaOH调节溶液pH值为5～6,室温均匀搅拌36～48小时，除去甲醇与水后，过反相色谱柱，制得目标化合物Gd-DO3A-NAND，所述第二中间化合物DO3A-NAND与所述Gd(NO3 ) 3 · 6H2 O的摩尔比为1:1 ～2；
或者，将步骤（c）获得的第二中间化合物DO3A-NAND溶于2～3mL甲醇与水体积比为1:1的混合溶液中，向其中加入Eu(NO3 ) 3 · 6H2 O，采用NaOH调节溶液pH值为5～6,室温均匀搅拌36～48小时，除去甲醇与水后，过反相色谱柱，制得目标化合物Eu-DO3A-NAND，所述第二中间化合物DO3A-NAND与所述Eu(NO3 ) 3 · 6H2 O的摩尔比为1:1～2；
或者，将步骤（c）获得的第二中间化合物DO3A-NAND溶于2～3mL甲醇与水体积比为1:1的混合溶液中，向其中加入Tb(NO3 ) 3 · 6H2 O，采用NaOH调节溶液pH值为5～6,室温均匀搅拌36～48小时，除去甲醇与水后，过反相色谱柱，制得目标化合物Tb-DO3A-NAND，所述第二中间化合物DO3A-NAND与所述Tb(NO3 ) 3 · 6H2 O的摩尔比为1:1～2。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150617 |