CN102170914B - 制备超极化分子的水溶液的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备超极化分子的水溶液的一步方法，其中在单个步骤中，借助于快速的相转移萃取，从粗溶液分离所述超极化分子，并分离进无杂质的水溶液中，所述溶液即可用于人或动物体的器官、区域或组织的MRI诊断成像。

Description

制备超极化分子的水溶液的方法

技术领域

本发明涉及磁共振成像(MRI)领域。更具体地，本发明涉及制备准备用于体内MRI诊断成像的超极化分子的水溶液的方法，其在MRI造影剂的制备中的应用，和在其中将所述水溶液直接用于生成人或非人动物身体器官、区域或组织的诊断MR图像的研究方法。

背景技术

磁共振成像是体外和体内医学和生物学研究的非常确定的有力工具。该技术的主要缺点是，由于作为MRI的基础的NMR光谱学的固有低灵敏度。实际上，NMR信号的强度依赖于成像核的核自旋状态群体之间的差异。根据众所周知的Boltzman方程(ΔN＝γhB₀/(2πkT))，该差异是温度和施加的磁场的函数，且在热平衡时，它是10^-5的量级，即非常低。

最近已经提出，使用超极化分子作为所述缺点的可能的解决方案，且在近年来，许多努力致力于开发可行的且有效的MR-超极化方法。

在这方面，最简单的直接的是所谓的“蛮力”方法，其包括将目标分子保持在高磁场强度(高达20T)和低温度(接近绝对零度)给定的时间段。该方法具有普遍适用性，但是它要求应用适当的“弛豫开关”，所述“弛豫开关”允许快速促进建立核极化所需的核跃迁，并必须在试验后立即被除去或以其它方式“关闭”。但是，由于适合这种目的的“弛豫开关”尚未被发现，该方案目前不可利用。

第二种方法是所谓的“光泵浦/自旋交换”，其可以应用于稀有气体诸如¹²⁹Xe和³He。在该情况下，使用循环地极化的激光束照射选择的气体和碱性金属蒸汽的气态混合物。由于这些核的长弛豫时间，这允许为Xe和He提供可以维持长时间的高的极化度。

使用这样得到的超极化的气体进行的呼吸系统的MRI研究是已知的。在这方面，参见，例如，J.ThoracicImag.2004，第19卷，第250-258页；Phys.Med.Biol.2004，第49卷，第105-R153页。

但是，如前所述，该技术不具有普遍适用性，而是仅限于稀有气体的极化。

根据称作动态核极化或DNP的技术，通过采用目标核和成对的顺磁物质的不成对电子之间的“欧沃豪斯”效应，也可以增加核自旋水平之间的群体差异。该技术已经用于例如超极化一些具有生物学兴趣的分子，包括脲、丙酮酸盐及其代谢衍生物，它们目前用于使用MRI进行的代谢特性的研究(参见，例如，Europ.Radiol.2006，第16卷，第57-67页，Magn.Res.inMed.，第58卷，2007，第65-69页；Appl.Magn.Res.2008，第34卷，第533-544页)。

尽管该技术可以应用于(至少原则上)任意类型的分子，对允许在低温度辐照电子的有力的低温恒温器和合适的“硬件”的需求，实际上构成对它的更普遍应用的限制。

其它困难也可能源自对这样的有效方法的需求，所述方法允许在超极化后快速分解底物，并在体内施用超极化的底物之前分离高毒性的顺磁基团。

还已经提出了(例如，在US6,574,495中)借助于称作仲氢(Para-hydrogen)诱导的极化(PHIP)的方法通过在不饱和底物上添加仲氢得到的超极化分子的替代用途。

该方法的主要优点依赖于，它允许得到与通过Boltzmann热力学测得的那些相比深度改变的核自旋水平的群体，而不必使用极端低温和复杂的分解操作，诸如在DNP方法中使用的那些。这样，它可以视作DNP超极化技术的更简单且更廉价的替代技术。

如所述的，PHIP方法依赖于用在对位异构体(paraisomer)中富集氢气催化氢化不饱和底物或MR试剂前体。

氢分子实际上以2种异构的自旋形式存在，即正氢(o-H₂)和仲氢(p-H₂)。邻位异构体(orthoisomer)(它在2个质子的交换方面是对称的)是三重简并的(三重态)，而对位异构体(它是反对称的)是单态。此外，邻位异构体具有等于1的自旋(S＝1)，且是NMR活跃的，而对位异构体具有等于0的自旋(S＝0)，且是NMR静息的。

在室温，平衡混合物(其中存在2种形式，或者称作正常氢)含有75％的邻位异构体和25％的对位异构体，但是仲态是热力学上有利的，且由于H₂分子的相对高的旋转温度，通过使它保持在低温，可以在对位异构体中富集平衡混合物。

例如，在77K(液态N₂温度)，2种形式以52％(对位)∶48％(邻位)比例存在，且在20K，所述混合物由99.8％的对位异构体形成。

在正常条件下，2种异构体之间的平衡速率非常低，因为它包括被选择规则所禁止的单态-三态转换。但是，在合适的催化剂(例如选自诸如Fe₃O₄、Fe₂O₃等氧化铁和活性炭)存在下，可以快速地得到互变(例如，在几个小时内)。然后可以在室温维持这样得到的对位富集，条件是，完全除去转变催化剂和任何其它的顺磁杂质。以此方式，可能在室温获得非平衡混合物，即富含对位异构体(也称作仲氢)的氢混合物，其保持稳定数小时。

尽管是NMR静息的，当仲氢被添加到不饱和分子上时，AX旋转系统的形成会破坏它的对称，允许观察到超极化，或者换而言之，在仲氢化(para-hydrogenated)的化合物的NMR波谱中与超极化的质子核相对应的显著增强的信号。典型地，在¹HNMR波谱中，以MR信号的增强的方式测得的灵敏度增加可以是高达因子10⁵(参见，例如，Sensitivityenhancementutilizingparahydrogen，C.R.Bowers，EncyclopediaofNMR第9卷，2002，第750-770页)。

尽管如此，技术人员会知道，对于体内MRI目的，异核(非质子)超极化比质子的超极化(即使如此高)更有用。这是因为，在体内条件下，仲氢化的造影剂的质子信号会与组织水的内源¹H信号重叠。相反，非质子核的内源信号的几乎完全缺失导致背景噪音的实际缺失，因而允许以高信噪比登记图像，这时反衬度仅通过超极化分子到达的区域和缺失它们的区域之间的信号强度的差异给出。

其它益处是由于非质子核特有的更长的T₁值(这限制由于弛豫导致的极化损失)和与它们有关的化学位移范围的宽度(当包括在不同的分子中时)，或者换而言之，由于下述事实，即与给定的异核有关的化学位移的值在进入不同的分子中是不同的，其中这使得一次观察不同的分子成为可能。

因此，主要兴趣针对可行的且有效的极化非质子核、尤其是具有核自旋＝1/2的核(例如，¹³C、¹⁵N和²⁹Si)的MR方法，以及包含非质子超极化核的造影剂和尤其是¹³C富集的超极化物质。

令人感兴趣地，PHIP超极化方法允许以更简单且更廉价的方式(特别是当与DNP技术相对比时)提供¹³C和¹⁵N超极化分子。

关于反衬度，为了得到有效地用于体内MRI医学成像中的¹³C超极化分子，必须满足下述要求：

i)底物分子必须是可容易地氢化的；

ii)底物分子必须在离添加到含有仲氢的分子上的质子3个键的距离内含有¹³C碳原子；

iii)为了限制弛豫速率，底物分子的分子量应当低，且优选地低于500Da；

iv)超极化产物必须是水溶性的且生理上可耐受的；

v)必须使用仲氢化催化剂，允许促进两种质子从一个H₂分子转移至相同底物分子，从而维持旋转关系。能实现这类转移的催化剂是均质的，例如，Rh或Ir有机金属络合物，由于它们的高毒性，其必须在注射之前从反应混合物除去；

vi)为了在MRI成像中是有效的，仲氢的自旋有序(spin-order)必须转化成¹³C净磁化强度。

vii)由于仲氢化产物的水溶液被用于体内用途，氢化反应应当直接在水中进行，或者，用于氢化的有机溶剂必须被完全除去。

技术人员会认识到，相同类型的标准同样适用于用不同于¹³C的非质子核适当富集的超极化物质的制备。

从上面可以看出，当使用PHIP超极化方法时必须面对的主要问题是，由于使用有毒的氢化催化剂和有机溶剂(氢化催化剂和氢更易溶于其中)，同时，关于反衬度，对于体内MRI用途，需要仲氢化产物的生理上可接受的水溶液。

因此，基于过渡金属的几类氢化催化剂正处于大量细查中。

基于均匀的过渡金属的催化剂已经被证实会提供最好的活性和选择性。具体地，已经证实在仲氢添加到不饱和前体上以后允许在¹³C上的更高极化的催化剂是Rh(I)阳离子络合物，优选地含有螯合膦配体，例如DPPB(二苯膦丁烷)或DPPE(二苯膦乙烷)和二烯分子，例如，环辛二烯或降冰片二烯(参见，例如，K.Goldman等人，Magn.Res.Med.2001，461-5)。

在有机溶剂中，优选地在丙酮中(它们更易溶于其中)，这些氢化催化剂达到最高效率。但是，显然，在将它们配制于用于体内施用的水性介质中之前，必须从反应混合物完全除去有机溶剂。例如，通过与在制药技术中常用的将溶液转化成固体干燥颗粒的方法类似的方法(参见，例如，US3615723)，借助于位于反应器下游与之紧邻的“喷雾干燥器”，可以实现该任务。在该情况下，将液体物质喷洒进干燥室，它在其中雾化，并由载气分散；然后通过施加真空，蒸馏更高挥发性的溶剂，而以前加入混合物中的水保留在“干燥器”中，由此提供加入的物质的水溶液。但是，由于低分子量分子(小于500Da)优选地用作仲氢化物质，与上述方法的应用有关的一个主要缺点源自氢化产物可能与有机溶剂一起损失。

另一方面，还已经使用水性溶剂，例如在WO99/24080中，与含有一些离子/极性基团的Rh(I)阳离子络合物一起使用，所述离子/极性基团主要是在膦配体上，为了提高催化剂水溶性和相应地它们在水性介质中的效率而故意引入。

但是，当在水性介质中工作时，有待解决的一个重要缺点是，由于氢在水中的低溶解度，这使得必须在非常高的压力(50-100巴)或更低的压力(10-15巴)但是在层流条件下工作，并进入合适的反应器(公开在例如Magn.Res.Mater.Phys.2009，22，111中)。另外，均匀催化剂的应用受到下述困难的阻碍：催化剂回收，并在重复利用的同时分离不含催化剂的产物溶液。

通常用于除去阳离子Rh络合物的方法包括，例如，在合适的阳离子-交换树脂上使反应混合物渗滤，尽管该方法导致显著的极化损失。

或者，已经使用基于负载于在固体表面(例如二氧化硅或聚合物)上的Rh(I)的催化剂。但是，使用负载的催化剂可得到的净极化显著低于用均匀的催化剂所观察到的，可能是因为底物-催化剂加合物的更低流动性，其导致在中间体水平增加的弛豫速率。因此，仍然需要容易且廉价的方法，其能克服上述纯化问题，并提供准备用于人或非人动物体的MR成像的超极化分子的水溶液。

发明内容

本发明提供的溶液涉及改进的一步生产方法，和借助于相转移从准备用于体内MRI诊断成像的水溶液快速分离高度极化的分子。

更具体地，在一个实施方案中，本发明涉及制备超极化分子的水溶液的方法，其中在单个步骤中，借助于快速的相转移萃取，将所述超极化分子与粗有机溶液分离，并从而在准备用于人或动物体的器官、区域或组织的MRI诊断成像的无杂质的水溶液中分离。

有利地，通过使用本发明的方法，一次性地在准备用于体内MRI用途的水溶液中得到超极化产物，其完全不含有有机溶剂、未反应的底物和氢化催化剂杂质，不需要任何进一步的纯化和/或后续配制。

优选地，在本发明的方法中，通过将仲氢添加到可溶于有机溶剂中的合适的不饱和底物(或“MR试剂前体”，或简称“前体”，在本文中互换使用)上，得到超极化分子(或MR成像剂)。

根据本发明，除非另有说明，本文互换使用的术语“MR试剂”或“MR成像剂”是指这样的物质或分子，其含有至少一个能产生磁共振信号的质子或非质子超极化的核。

适用于本发明目的的有机溶剂是与水不混溶的，且优选地包括：有机氯化的溶剂例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳，芳族溶剂例如苯和甲苯，醚类例如二乙醚、二异丙基醚和丁基醚，脂族烃类例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷和环己烷，醋酸乙酯和长链醇例如丁醇、戊醇、己醇等。在它们中，优选的是氯化的溶剂和上面的烃，其中特别优选的是氯仿和二氯甲烷。

优选地，通过使用PHIP技术，在氢化催化剂存在下，进行氢化反应，所述催化剂经过适当选择，所以可溶于有机溶剂，但是不溶于水和水性溶剂。典型地，上述催化剂以技术人员已知的催化量使用，例如以10∶1至5∶1的底物/催化剂比使用。

适用于本发明的催化剂的实例包括：式[Rh(二膦)二烯)]⁺[阴离子]^-的铑络合物，其中所述二膦优选地选自DPPB(1，4-双(二苯基膦基)丁烷)、DPPE(1，2-双(二苯基膦基)乙烷)及其衍生物，包括，例如，手性膦诸如DINAP(2，2’-双(二苯基膦基)-1，1’-binaftyl)、CHIRAPHOS(2，3-二苯基膦基丁烷)、DIOP(1，4-双(二苯基膦基)-1，4-二脱氧-2，3-O-亚异丙基-L-treitol)和DIPAMP(1，2-双[(2-甲氧基苯基)(苯膦基)]乙烷)；所述二烯优选地选自1，5-环辛二烯和降冰片二烯，且所述阴离子可以是任意阴离子，但是优选四氟硼酸盐或三氟甲基磺酸盐。在它们中，优选的是这样的催化剂，其中所述膦基团是二苯基膦基丁烷，而[双(二苯基膦基丁烷)(1，5-环辛二烯)]Rh(I)是特别优选的。

适用于本发明的MR试剂前体包括可氢化的物质，其通常包括一个或多个不饱和键，例如碳-碳双键或三键，其非常易溶于有机溶剂中，且在水中溶解度更低(即难溶)或优选地完全不溶，且能产生对应的仲氢化的分子，其可逆地代表增加的水溶性，或者，其快速地且选择性地转化成水溶性的分子，优选地通过单独的水或适当的水性溶剂的作用。

根据本发明，除非另有说明，关于根据本发明的MR试剂前体，本文互换使用的表述“难溶于水”或“几乎不溶于水”表示这样的化合物，其在水中具有微小的溶解度，优选地小于总前体量的20％，更优选地小于5％，且甚至最优选地小于1％。

有利地，上述条件使得下述操作成为可能：在与水不混溶的有机溶剂中进行氢化反应，并通过用水或用合适的水溶液简单地稀释粗反应混合物(分别基本上如图1和图4所示)，在水相中分离超极化的产物或其水溶性衍生物。

不言而喻，对于体内用途，不饱和底物必须转化成超极化的产物，其本身是生理上可接受的，或可以以其生理上可耐受的衍生物形式从粗反应物分离。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种方法，其中在与水不混溶的有机溶剂中溶解合适的不饱和底物，并在可溶于有机溶剂、但是不溶于水(更一般地，水性溶剂)的催化剂存在下，用仲氢氢化，以产生对应的仲氢化的化合物，其可以如下从有机反应介质(粗溶液)快速萃取：简单地通过用水或适当的水溶液稀释该后者，然后收集含有超极化的产物的水相。

在一个替代实施方案中，本发明涉及一种方法，其中在与水不混溶的有机溶剂中溶解合适的不饱和的前体，并在可溶于有机溶剂、但是不溶于水(更一般地，水性溶剂)的催化剂存在下，用仲氢氢化，以产生对应的仲氢化的化合物；将该后者快速地且选择性地转化成其水溶性的衍生物，所述衍生物如下从有机反应介质萃取：简单地通过用水或适当的水溶液稀释它，然后收集含有超极化的衍生化合物的水相。

更具体地，在一个优选的实施方案中，本发明涉及制备超极化分子的水溶液的方法，其中：

a)在与水不混溶的有机溶剂中溶解合适的不饱和底物，并在可溶于有机溶剂、但是不溶于水的催化剂存在下，用仲氢氢化，以产生对应的仲氢化的化合物；和

b)通过用水或水溶液稀释该后者，然后收集含有超极化的产物的水相，从有机反应介质分离仲氢化的化合物(原样)；或者，

c)将在步骤a)中得到的仲氢化的分子快速地且选择性地转化成其水溶性的衍生物，所述衍生物如下从有机反应介质分离：通过用水或合适的水溶液稀释该后者，然后收集含有超极化的衍生化合物的水相。

在本发明的一个优选的实施方案中，简单地通过用水或合适的水溶液稀释有机反应介质，将根据上面方法的步骤a)得到的仲氢化的分子快速地且选择性地转化成其水溶性的衍生物，然后通过收集含有它的水相，容易地通过粗反应物分离。

因此，在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及一种方法，其中：

a)在与水不混溶的有机溶剂中溶解合适的不饱和底物，并在可溶于有机溶剂、但是不溶于水的催化剂存在下，用仲氢氢化，以产生对应的仲氢化的化合物；和

c’)通过用水或合适的水溶液稀释粗有机溶液，将在步骤a)中得到的仲氢化的分子快速地且选择性地转化成其水溶性的衍生物，然后通过收集含有它的水相进行分离。

根据本发明，除非另有说明，本文互换使用的术语“水溶液”或“合适的水溶液”是指无菌的水或盐水溶液，其任选地适当地缓冲化，在任意情况下，都是生理上可耐受的，且可用于体内诊断用途，或者此外是指上面定义的水溶液，其另外包括合适量的适当选择的试剂，所述试剂能促进超极化分子快速且选择性地转化成水溶性的衍生物，并作为结果，产生它们的生理上可接受的水溶液，其不经进一步纯化就适用于体内诊断成像。

在这方面，从前述内容显而易见，当用于促进所述转化的试剂本身不是生理上可接受的时，必须基于反应本身的化学计量，精确地确定加入到水溶液中的它的量，从而完全用于仲氢化的分子向其水溶性的且生理上相容的(在生理pH条件下)衍生物的转化反应，并产生它们的生理上可接受的水溶液，准备用于体内诊断MRI成像。

根据本发明的水溶液的合适实例包括：水，生理盐水溶液，含有能促进合适的仲氢化的底物的水解的最小量的碱(例如NaOH)或酸(诸如柠檬酸或醋酸)的水溶液，或包含允许促进仲氢化的底物氨解以得到其水溶性的且生理上相容的衍生物(例如以生理上可接受的盐的形式，例如生理上可接受的酸或酰胺的盐)的生理上可接受的试剂(诸如胺或氨基酸(例如甘氨酸、亮氨酸、丙氨酸、丝氨酸))的水溶液。

在本发明的范围内，特别优选的是水、生理盐水溶液、NaOH的水溶液、和柠檬酸或醋酸的水溶液。

在本发明的一个优选的实施方案中，加入有机反应介质中的水溶液的体积等于用于溶解不饱和底物和氢化催化剂的有机溶剂的体积。更优选地，使用合适量的水溶液，从而提供超极化的目标分子的水溶液，其无需进一步浓缩即可使用。在个例中，相反地，任选地使用合适量的无菌的水或盐水溶液，可以实现收集的含有超极化的化合物的水相的适当稀释。

适用于本发明的MR试剂前体包括可氢化的底物，其通常包括一个或多个不饱和键。

一般而言，用于本发明的MR试剂前体应当是可高度极化的。

优选的前体试剂可极化至与至少5％、优选至少10％和更优选至少30％或甚至更高相对应的程度，且它们提供的超极化分子能维持极化足以允许成像操作的时间段。

此外，根据本发明的优选的前体试剂应当具有低分子量，优选地低于500D，且更优选地100-300D。

重要的是，且如前所述，用于本发明的底物分子非常易溶于有机相中，且在水相中的溶解度更低或不溶，且能产生对应的仲氢化的分子，其相反地更好地溶于水，或者，借助于适当的化学反应，并优选地通过水或适当的水溶液的单独作用，将其快速地且选择性地转化成水溶性的分子。

合适的实例例如包括取代的炔烃，对于用仲氢部分饱和，其产生对应的取代的烯烃。优选地，起始炔烃和用仲氢化产生的对应烯烃之间的水溶性差异至少60％有利于得到的烯烃，后者必须通过更高的水溶性来表征。

另一类有用的底物包括取代的烯烃，其通过仲氢的氢化，提供对应的取代的烷烃，水溶性差异至少60％有利于饱和的氢化产物(烷烃)，后者必须通过在水相中更高的溶解度来表征。

在仲氢化后可以快速地且容易地转化成水溶性的衍生物的前体的实例包括羧酸酐、活化的酯类和烯酮类。

足够稳定的不饱和的酐实际上可以在有机溶剂中仲氢化，然后用碱性水溶液水解(通过反应介质的稀释)，以形成对应的羧酸，其优选地进入水溶液中(任选地以生理上可接受的盐的形式)，然后可以通过水相自身的简单分离来分离。优选地计算要包含在水溶液中(加入有机相中)的碱的精确量，从而在萃取衍生物(例如羧酸)后，产生具有生理pH的其水溶液，准备用于MRI体内诊断。

如已经解释的，适用于本发明的前体都必然地含有至少一个不饱和位点，例如C-C双键或三键，其通过添加仲氢而被还原，得到对应的仲氢化的化合物。

但是，因为前面解释的原因，在体内磁共振成像中，在非质子核(或异核)处超极化分子的应用当然被视作优选的。

在其一个特别优选的实施方案中，本发明涉及制备超极化分子(或MR成像剂)的水溶液的方法，所述超极化分子包含超极化的非质子核(或异核，在本文互换使用)，例如¹⁹F、¹³C、¹⁵N或²⁹Si核，尤其是¹³C或¹⁵N超极化核。

一般而言，通过将极化从仲氢的质子转移至目标异核，实现根据本发明的范例通过使用PHIP方法进行的异核超极化。

更详细地，为了使用仲氢化的化合物作为例如¹³CMRI造影剂，必须使通过极化从仲氢转移至目标碳而得到的超极化的碳原子的“反相”信号完全转化成可用于成像采集的“同相”信号。该步骤可以如下进行：通过使用适当的脉冲序列(公开在例如，GoldmanM.，JohannessonH.，C.R.Phisique2005，6，575中)，或通过将适当的场循环(fieldcycling)过程施加于仲氢化的产物。该后一种方法包括将氢化的样品快速引入(非绝热地)磁屏蔽(场强度＝0.1μT)，然后缓慢地除去(绝热地)屏蔽，从而使样品处于与地球磁场(50μT)相对应的场值(fieldvalue)(在这方面，参见，例如，C.R.Phisique2004，5，315)。

与上面内容相一致，根据一个优选的实施方案，本发明的方法包括将适当的场循环过程施加于仲氢化的产物(例如在前述的本发明的方法的步骤a)中得到)，从而促进从质子核(源自仲氢添加)向目标非质子核的极化转移，并得到对应的异核超极化分子，然后通过相转移，从粗有机溶液中萃取，并根据前述方法的步骤b)、c)或c’)在水相中分离。

更具体地，在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及一种方法，其中：

a)在与水不混溶的有机溶剂中溶解合适的不饱和底物，并在可溶于有机溶剂、但是不溶于水的催化剂存在下，用仲氢氢化，以产生对应的仲氢化的化合物；

a’)施加适当的场循环过程，和

b)通过用水或水性溶剂稀释，从有机反应介质分离这样得到的异核超极化分子(原样)，然后收集含有超极化的产物的水相；或者，

c)将根据步骤a’)得到的超极化分子快速地且选择性地转化成其水溶性的衍生物，所述衍生物如下从粗溶液分离：通过用水或合适的水溶液稀释该后者，然后收集含有目标异核超极化的衍生物的水相。

根据本发明的一个优选实施方案，可用于制备异核超极化分子的水溶液的底物化合物包括具有核自旋＝1/2的非质子核(例如，¹³C、¹⁵N、²⁹Si和¹⁹F)以及不饱和键，所述非质子核可以以它的天然存在的同位素丰度存在，或优选地，据称在底物分子中富集，所述底物分子因此在所述非质子核中变成富集的或“标记的”。

对于体内用途，根据本发明优选的底物化合物是¹⁵N或¹³C、尤其是¹³C富集的，且具有至少10％或更高、优选50％或更高、特别优选99％或甚至更高的¹³C富集度。

特别优选的是这样的底物，其在离添加到含有仲氢的分子上的质子3个键的距离内含有碳原子(优选¹³C富集)，且具有长T₁弛豫时间。

满足这些要求的碳原子例如包括羰基的碳原子或季碳原子。

在该情况下，实际上，通过仲氢化添加的质子和¹³C标记的合适的羰基(或季碳化合物)之间的标量偶合使得极化向所述异核的转移成为可能，而它的长弛豫时间允许在生理条件下维持极化数十秒，甚至更优选超过60秒。

因此，选择用于本发明的底物包含链烯基或炔基和一个¹³C-富集的羰基取代基。

这类底物的合适的实例包含羧酸酐，其在它们的分子结构中包括合适的不饱和。

根据本发明优选的酐包括至少一个不饱和位点，且可以是内部的、或非内部的、混合的(也就是说式R₁-COOCO-R₂，其中R₁不同于R₂)、或对称的(即式R-COOOC-R)。混合的酐又可以由2种不饱和的羧酸形成，或由一种不饱和的酸和一种饱和的酸形成。

在第一种情况下，氢化反应会提供2种酸R₁-COOH和R₂-COOH，二者都被极化，而在第二种情况下，氢化反应会提供仅一种极化的酸(例如R₁-COOH)和一种未极化的“副产物”(例如R₂-COOH)。但是，在该后一种情况下，可以利用适当的脉冲序列的应用来将极化从R₁中邻近不饱和的羰基转移到第二个羰基。

该方法的应用(例如描绘在图5中)使得通过“间接的”极化方法来极化无未饱和的羧酸成为可能，且因而不是可直接氢化的(即，例如，前面的R₂-COOH残基)。

对于本发明而言特别优选的是马来酸酐、巴豆酸酐和顺式-丁烯酸酐(也称作异巴豆酸酐)和对应的混合的酐，诸如顺式-丁烯酸-醋酸酐和顺式-丁烯酸-乙基羰基酐。

活化的酯可以代表根据本发明的第二类底物化合物，它们可溶于有机溶剂中，且在氢化后，可以快速地转化成水溶性的衍生物。

示例性实例包括：

1)甲硅烷基酯，例如，式R-COO-SiR₃的三烷基甲硅烷基酯、式R-COO-SiArR₂的芳基-二烷基甲硅烷基酯、式R-COO-SiAr₂R的二芳基-烷基甲硅烷基酯和式R-COO-SiAr₃的三-芳基甲硅烷基酯。这些化合物实际上可以在有机溶剂中氢化，然后用弱酸水溶液水解成对应的羧酸(RCOOH)：这样得到的羧酸直接进入水相中，且可以通过分离该后者容易地分离。

2)甲锡烷基酯：例如，在氢化步骤后，通过与氟化物的反应，可以进行式R-COO-SnR₃的水不溶性的三-烷基甲锡烷基酯的适当水解。

3)酰基-氧烷基酯：例如通过与酸性或碱性溶液的反应，或甚至在有合适的酶催化剂存在下，可以容易地水解通式R-COO-CHR”OCOR”的酯，其中R’是H或Me，且R”是Me或t-Bu。

4)异戊二烯基化的酯：这些酯根据下面的方案通过热解进行分解：

5)式R-COO-CR’₃(其中R’是Ph或Me)的叔-烷基酯，其中所述水解可以例如通过使用超酸树脂来加速。

根据本发明的另一类不饱和底物是烯酮。实际上，给出张力环后，它们可以用仲氢容易地氢化，且此后，又因为张力，可以根据下面的方案快速地水解成酸：

然后，极化可以合适地转移至目标异核，例如因水解形成的羧基基团的碳原子，其中在该最后一个和源自仲氢的质子之间的偶合常数足够大，或在R中存在的合适的碳原子或氮，优选¹³C或¹⁵N富集的。

根据本发明特别优选的底物化合物包括具有诊断利益的生物分子的前体，其在氢化后，超极化转移至合适的异核，并随后任选地快速地且选择性地水解(或不同的适当的化学修饰)，以提供具有医疗/诊断利益的水溶性的生物分子。

这类底物化合物包括，例如，氨基酸、神经递质和通常的代谢物前体。合适的实例例如包括马来酸酐或马来酸/延胡索酸酯，其在氢化和水解后，会提供在柠檬酸循环诊断评价中具有有益用途的琥珀酸。

其它实例包括巴豆酸酐和/或异巴豆酸酐和酯，其通过氢化和水解提供丁酸，所述丁酸是通常通过所有动物物种的大肠中的碳水化合物和蛋白的微生物发酵生成的C₄酸，且似乎对细胞增殖、细胞凋亡和分化(其可以是促肿瘤的或抗肿瘤的，这取决于诸如暴露水平、其它代谢底物的可用性和细胞内环境等因素)具有不同的影响。

合适的β-γ不饱和的羧酸衍生物在氢化后可以提供合适的氨基酸，例如谷氨酸，优选地在羧基原子处富含¹³C，其可以用于评价谷氨酸(glutamate)代谢(由谷氨酸脱羧酶(GAD)催化的GABA-能神经元中抑制性GABA的合成；通过谷氨酸脱氢酶催化的谷氨酸脱氨处理多余的或废弃的氮)以及评价神经元和神经胶膜中的谷氨酸转运蛋白。

另一方面，适当修饰(例如通过引入合适地增加(或降低)它们在水性溶剂中的溶解度的适当官能团)的不饱和底物的可能用途，必须视作包含在本发明的范围内。例如，诸如苄氧基等官能团可以用于增加底物化合物在有机溶剂中的溶解度，然后可以在仲氢化反应过程中除去它，例如通过氢解，得到具有增加的水溶性的氢化的化合物。

因此，修饰的底物化合物构成本发明的另一个方面。

根据本发明的底物化合物(即用于仲氢化的不饱和底物，优选地被¹³C、¹⁵N或具有核自旋1/2的其它异核标记)是众所周知的，且可商业上得到，或它们可以根据已知的方法容易地制备。

类似地，在所讨论的方法中使用的催化剂是已知的，或如果不可原样商业得到，则通过已知的方法制备。类似地，适当的与水不混溶的有机溶剂可以选自上面列出的那些，可容易地在市场上得到。任选地，系统溶剂也可以由适当的溶剂混合物构成。

使用本发明的方法得到的超极化分子的无杂质的水溶液可以稳定临床上可接受的时间段。

根据本发明的水溶液优选地包括浓度范围为0.002至1.0M、优选0.01至0.5M的超极化分子。

使用本发明的方法得到的超极化分子的无杂质的水溶液可以有利地用于人或动物体器官、流体(fluid)、区域或组织的体外、离体和尤其是体内MR诊断成像，以及具有诊断利益的生理参数的诊断评估。

例如，马来酸(它的羧基¹³C化学位移在6.0-7.0范围内是pH-依赖性的)可通过乙炔二羧酸酯的氢化和水解得到，且可以用作组织中pH评价的探针。

另外，使用本发明的方法得到的具有生物利益的超极化分子的水溶液可以有利地用于新出现的场，所述场涉及使用MR成像技术评价具有诊断利益的代谢特性。

本发明的超极化分子的水溶液具有广泛用途，因为它们可以用于血管内的(例如静脉内的、动脉内的、冠脉内的、心室内的施用等)、鞘内的、腹膜内的、淋巴管内的和腔内的施用。本发明化合物的溶液或悬浮液也可以配制成用于气雾支气管造影术和灌输的气雾剂。

如前所述，使用本发明的方法得到的超极化分子的无杂质的水溶液可以原样用于体内MRI诊断成像，无需进一步纯化和/或配制。

因此，在另一个实施方案中，本发明涉及MR造影剂，其包含使用本发明的方法得到的超极化分子的无杂质的水溶液。

在一个不同的实施方案中，本发明涉及根据本发明的超极化分子的水溶液用于制备MR显像剂的用途，所述MR显像剂用于人或动物体器官、组织或区域的诊断评价，或用于借助于MR成像技术对生物学数据的评估或代谢评价。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于诊断成像方法中的使用本发明的方法得到的超极化分子的水溶液，在所述诊断成像方法中，借助于MR成像技术，得到人或动物体器官、区域或组织的MR图像或生物学参数评估或代谢特性评价。

更具体地，从另一个不同的视图看，本发明涉及借助于磁共振成像对人或动物体器官、区域、流体或组织进行诊断显影的方法，所述方法包括：

i)利用PHIP技术，在与水不混溶的有机溶剂中，且在可溶于有机溶剂、但是不溶于水的催化剂存在下，仲氢化MR成像剂前体，任选地施加合适的场循环，以得到在非质子核上具有净超极化的对应的MR试剂，用水或合适的水溶液稀释有机反应介质，并收集含有超极化的MR试剂的水相，

ii)将所述水相施用给人或动物体，

iii)将所述人或动物体暴露于辐射频率，以允许激发所述MR试剂中的超极化的核，

iv)记录由激发的核产生的信号，并从所述信号产生身体区域的图像或感兴趣的生物学数据。

实验部分

附图简述

图1显示了通过相转移萃取和分离仲氢化的产物的本发明方法的示意图。

图2显示了通过A的仲氢化得到的B(¹³C-富集的)的¹³C-NMR波谱(14T，298K，丙酮-d₆)。a)在仲氢化和场循环后立即记录的波谱；b)弛豫(5分钟)后记录的波谱。在提供的波谱中，S指示溶剂，且i表示杂质。

图3显示了通过A的仲氢化得到的B(¹³C-富集的)的¹³C-NMR波谱(14T，298K，D₂O)。a)在仲氢化、场循环和水(D₂O)萃取后立即记录的波谱；b)弛豫(5分钟)后记录的波谱。

图4显示了通过相转移萃取和分离仲氢化产物的本发明方法的示意图，所述方法包括首先将所述产物转化成水溶性的衍生物。

图5显示了通过极化从混合的酐中的一个羰基转移至另一个羰基并进一步水解得到的酸超极化的一个实例。

图6显示了下述物质的¹³C-NMR波谱(14T，298K)：a)通过在CDCl₃中仲氢化马来酸酐得到的琥珀酸酐(在仲氢化和场循环后立即记录的波谱)；b)在CDCl₃中仲氢化马来酸酐、场循环和在D₂O中用NaOD水解琥珀酸酐后得到的含有琥珀酸的水溶液的波谱。

图7显示了下述物质的¹³C-NMR波谱(14T，298K，丙酮-d₆)：a)通过在丙酮-d₆中仲氢化乙炔二-羧酸三甲基甲硅烷基酯C得到的烯烃D(实施例4)(在仲氢化和场循环后立即记录的波谱)；和b)在丙酮-d₆中仲氢化C、并随后在D₂O中用醋酸溶液水解得到的马来酸(在得到的混合物丙酮-d₆/D₂O上记录的波谱)。

实验结果

为了更好地解释本发明的方法目的，提供了下面的实施例，它们无意以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

超极化实验

通过在有H₂SO₄催化剂存在下乙炔二-羧酸二甲基酯与二乙二醇一甲醚的酯交换，合成对称的炔烃A(其式记录在下面)。已经合适地选择(寡)氧乙烯链(oxyethylenicchain)，以优选地增加仲氢化的产物B的水溶性。实际上，B在水中的溶解度高于炔烃A。

在配有Young阀的5mmNMR试管中，仲氢化不饱和底物A，所述试管装有丙酮-d₆(0.4mL)、用H₂预先活化的[双(二苯基膦基)丁烷](1，5-环辛二烯)铑(I)四氟硼酸盐催化剂(5mg)、底物A(0.02mmol)和4个大气压的仲氢(52％富集)。通过摇动试管10秒，开始反应(产率＝85％)，且在仲氢化后立即记录的¹³C信号增强了1500倍。

为了获取同相¹³C共振，根据US6,574,495公开内容，将磁场循环施加于氢化的样品：这通过将试管快速插入μ-金属加强层(metalshield)(场强度0.1μT)，随后缓慢地除去加强层来进行。整个场循环过程需要3-5秒。然后将样品插入光谱仪(14T)，并获取高分辨率NMR波谱(如图2所示)，其显示约250倍的¹³C信号增强。

实施例2

通过相转移制备实施例1的超极化的化合物的不含催化剂和有机溶剂的水溶液

使用通过在与纯丙酮中使用的相同的氢化条件(公开在实施例1中)下在CDCl₃/丙酮-d₆(6∶1)中仲氢化相应的化合物A得到的上面的仲氢化的化合物B的溶液，已经进行了实验，该实验证实本发明方法提供希望的仲氢化分子的不含催化剂和有机溶剂的水溶液的能力。

在场循环施加后，快速地打开试管，并加入0.4ml脱气的D₂O；将试管剧烈摇动3秒，然后静置5秒，在这期间发生相分离。用注射器采取水溶液，并转移进试管，用于NMR获取。获取¹³C波谱，记录在图3中，其显示¹³C信号增强100倍。得到的信号增强低于在纯丙酮中得到的，可能是因为在整个过程中由弛豫导致的部分极化损失。残余的极化无论如何对于增强的信号t165.99ppm(与溶解在D₂O中的B相对应)的检测而言是足够的。据估测，转移进水相中的B的量是总量的约10％。

实施例3

琥珀酸的水溶液

已经在有5mg[双(二苯基膦基丁烷)(1，5-环辛二烯)]Rh(I)四氟硼酸盐(通过与H₂反应活化)和5.5个大气压的仲氢存在下，在6∶1CDCl₃/丙酮-d⁶混合物(0.4ml)中仲氢化马来酸酐(52％)。在反应10秒后，已经施加场循环，且已经加入0.4ml在D₂O中的0.25MNaOH。因此将刚刚形成的琥珀酸酐转化成琥珀酸。剧烈摇动试管，然后静置5秒。已经将含有琥珀酸的水相转移进第二个试管，用于NMR获取。

得到的波谱记录在图6b中：在相萃取后残余的极化允许检测在174.65ppm的琥珀酸的增强的发射信号(信号增强约30倍)。所有琥珀酸被转移至水相，且最终的pH是中性的。

尽管使用高浓度的最终的水溶液(约0.12M)，观察到的信号的低强度是由于使用非¹³C富集的马来酸酐。

实施例4

活化的酯的应用

已经如下进行反应：使用乙炔二-羧酸三甲基甲硅烷基酯(C)作为不饱和底物化合物，其在用仲氢氢化后产生相应的烯烃(D)，后者又使用弱酸性水溶液转化成相应的马来酸。图7显示了在下述情况下得到的烯烃D的¹³C-NMR波谱(14T，298K，丙酮-d₆)：a)在仲氢化和场循环后立即得到；和b)随后在D₂O中用醋酸溶液水解后得到。得到的结果证实，超极化恢复非常高的信号增强(约700倍)，并证实在水解后仍然可观察到极化。

Claims (14)

1.制备超极化分子的水溶液的一步方法，所述方法包括：在与水不混溶的有机溶剂中，且在溶于有机溶剂、但是不溶于水的合适的催化剂存在下，仲氢化合适的不饱和底物，且通过用水溶液稀释粗反应介质，经过相转移萃取分离超极化分子，并收集含有超极化分子的水相，其中所述与水不混溶的有机溶剂选自：选自氯仿、二氯甲烷和四氯化碳的有机氯化的溶剂，选自苯和甲苯的芳族溶剂，选自二乙醚、二异丙基醚和丁基醚的醚类溶剂，选自戊烷、己烷、庚烷、辛烷和环己烷的脂族烃类，醋酸乙酯和选自丁醇、戊醇和己醇的长链醇，所述催化剂是式[Rh(二膦)二烯)]⁺[阴离子]^-的铑络合物，其中所述不饱和底物是不溶于水的或几乎不溶于水的，且对应的超极化分子是水溶性的，或者通过用水溶液稀释所述粗反应介质，所述对应的超极化分子快速地且选择性地转化成其水溶性的衍生物，且其中所述超极化分子一次性地在准备用于体内MRI用途的水溶液中得到，其完全不含有有机溶剂、未反应的底物和氢化催化剂杂质，不需要任何进一步的纯化和/或后续配制。

2.根据权利要求1的方法，其中所述不饱和底物包含合适的炔基或链烯基，且对应的仲氢化的分子分别包含对应的链烯基或饱和的烷基。

3.根据权利要求2的方法，其中所述不饱和底物另外包含可水解的基团。

4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述不饱和底物用具有核自旋1/2的非质子核标记。

5.根据权利要求4的方法，其中所述不饱和底物是¹³C或¹⁵N富集的。

6.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述催化剂是[双(二苯基膦基丁烷)(1,5-环辛二烯)]Rh(I)。

7.根据权利要求1的方法，其中:

a)在与水不混溶的有机溶剂中溶解合适的不饱和底物，并在可溶于有机溶剂、但是不溶于水的催化剂存在下，用仲氢氢化，以产生对应的仲氢化的化合物；和

b)通过用水或水溶液稀释它，借助于相转移萃取，从有机反应介质分离仲氢化的化合物，然后收集含有超极化的产物的水相；或者，

c)将在步骤a)中得到的仲氢化的化合物快速地且选择性地转化成其水溶性的衍生物，所述衍生物如下从有机反应介质分离：通过用水或水溶液稀释它，借助于相转移萃取，然后收集含有超极化的衍生化合物的水相。

8.根据权利要求7的方法，其中通过用水或水溶液稀释有机反应介质，将在步骤a)中得到的仲氢化的分子快速地且选择性地转化成其水溶性的衍生物。

9.根据权利要求7的方法，其中额外地将合适的场循环施加于在所述方法的步骤a)中得到的仲氢化的分子，从而产生在合适的异核上具有净极化的对应的分子。

10.根据权利要求9的方法，其中所述异核是¹³C或¹⁵N富集的核。

11.根据权利要求3的方法，其中所述不饱和底物选自羧酸酐、活化的酯或烯酮。

12.根据权利要求11的方法，其中所述不饱和底物是羧酸酐，所述羧酸酐选自马来酸酐、巴豆酸酐或异巴豆酸酐。

13.根据权利要求11的方法，其中所述不饱和底物是活化的酯，所述活化的酯选自甲硅烷基酯、甲锡烷基酯、酰基-氧烷基酯、异戊二烯基化的酯或叔-烷基酯。

14.根据权利要求3的方法，其中所述不饱和底物是马来酸酯、延胡索酸酯、巴豆酸酯或异巴豆酸酯。