CN105671036A - 一种检测人类cox-2基因多态性的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测人类COX-2基因多态性的试剂盒及其应用。本发明盒体内的物质包括检测COX-2基因上的rs20417号SNP位点的特异性引物及特异性荧光探针、Taq？DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水。本发明克服了基因突变检测的多种方法各自存在的缺陷。本发明检测准确性高、检测简单方便、检测时间短、结果分析简单的优点，适合临床实验室使用，能够对COX-2基因多态性位点进行定性检测，根据SNP位点进行PCR荧光扩增反应，只需根据两种不同的荧光曲线是否起线就能进行结果判断，不会产生人为误差，假阳性和假阴性率低，提高效率降低检测成本，无需DNA提取，免去DNA提取的步骤和成本并避免气溶胶污染。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术，特别涉及一种检测人类COX-2基因多态性的试剂盒及其应用。
背景技术
环氧化物水解酶(cyclo-oxygen-ase，COX)，是前列腺素(PGs)合成所必须的酶，也是PGs合成初始步骤中的关键性限速酶。COX有两种同工酶COX-1和COX-2。人体COX-2基因定位于染色体的1q25.2～q25.3区，长度约8.3kb，包含10个外显子和9个内含子，共编码604个氨基酸。在5′端转录起始点上游有一些转录调控序列，包括2个核转录因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)位点、2个激活蛋白质-(2activatorportein-2，AP-2)位点、TATAbox序列、cAMP反应元件(cAMPresponsiveelement，CRE)、CCAAT增强子结合蛋白位点(CCAAT/enhancerbindingprotein，C/EBP)、Ets-1转录因子位点等。COX-2几乎在所有组织中有表达，主要分布于细胞核膜上，其表达调控主要集中在转录水平。诱导其表达的因素包括癌基因、白细胞介素-1、缺氧、紫外线、转化生长因子和肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)等，而地塞米松、抗氧化剂、抑癌蛋白P53等则可抑制其表达。因此，COX-2基因多态性改变可能潜在地影响某种因子的结合，改变基因的转录活性，进而影响环氧化酶的表达。通过对COX-2基因多态性的检测可为个体对某些疾病(如癌症等)的易感性诊断提供帮助
在本发明作出之前，目前进行基因突变检测的方法有数十种。金标准法为基因测序法。基因测序法是目前应用最广泛、较准确的一种方法，但是该方法需要昂贵的仪器设备和专业的人员进行操作，费时费力，在临床上很难进行推广。基因芯片法具有快速高通量的优点，但是操作上复杂，步骤多，成本高也不易普及。以限制性酶切片段长度多态性(RFLP)检测基因突变的方法具有成本低廉的优点，但是过程烦琐，时间长也不适合普及。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制一种检测人类COX-2基因多态性的试剂盒及其应用。
本发明的技术方案是：
一种检测人类COX-2基因多态性的试剂盒，包括盒体和装于盒体内的物质，其主要技术特征在于：所述盒体内的物质包括检测COX-2基因上的rs20417号SNP位点的特异性引物及特异性荧光探针、TaqDNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水；
所述特异性引物中的正义引物和反义引物的序列为：
正义引物：5’-CAGAAGAAATACTGTTCTCCGTACC-3’，
反义引物：5’-TCCATCAGAAGGCAGGAAACT-3’；
所述特异性荧光探针包括野生型探针和突变性探针，它们的序列为：
野生型探针：5’-FAM-TTTCCCGCCTCTCT-MGB-3’
突变型探针：5’-HEX-TTTCCCCCCTCTCT-MGB-3’。
所述盒体中各物质的含量为：浓度为10μM的特异性引物共0.45μl，其中正义引物和反义引物各0.225μl；浓度为5μM的特异性荧光探针共0.2μl，其中野生型探针和突变型探针各0.1μl；浓度为5单位/μl的TaqDNA聚合酶0.02μl；浓度为20mM的dNTP混合液0.1μl；浓度为25mM的MgCl2溶液0.5μl；5X荧光定量PCR反应缓冲液2μl；去离子水4.73μl。
所述特异性引物中，正义引物的Tm值为58.6℃，反义引物的Tm值为58.5℃；所述特异性荧光探针中，野生型探针的Tm值为67℃，突变型探针的Tm值为66℃。
所述试剂盒的保存温度为-20℃。
本发明的另一技术方案是：
一种检测人类COX-2基因多态性的试剂盒的应用，其主要技术物征在于：所述试剂盒用于检测COX-2基因上的rs20417号SNP位点的基因型。
本发明与现有技术相比，优点在于检测准确性高、检测简单方便、检测时间短、结果分析简单的优点，适合临床实验室使用：
(1)利用本发明试剂盒能够对COX-2基因多态性位点进行定性检测，根据SNP位点进行PCR荧光扩增反应，只需根据两种不同的荧光曲线是否起线就能进行结果判断，不会产生人为误差，假阳性和假阴性率低，提高效率降低检测成本。
(2)无需DNA提取，只需裂解全血细胞，将细胞裂解后的悬液加入反应体系即可完成扩增，免去DNA提取的步骤和成本并避免气溶胶污染，提高检测效率和准确度，缩短检测时间。
(3)本发明试剂盒所使用的荧光检测探针为Taqman探针，该探针费用低廉；同时本发明所有的反应全程闭管操作，PCR反应后不需要进行PCR产物纯化、电泳、酶切、杂交等，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率，另外降低了PCR产物污染引起假阳性的风险。
附图说明
图1——COX-2基因上的rs20417号SNP位点-纯合野生型扩增曲线示意图。
图2——COX-2基因上的rs20417号SNP位点-杂合型扩增曲线示意图。
图3——COX-2基因上的rs20417号SNP位点-纯合突变型扩增曲线示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
一种检测人类COX-2基因多态性的试剂盒，试剂盒中包括以下COX-2基因上的rs20417号SNP位点的扩增特异性引物1对及2条特异性荧光探针。
用于COX-2基因上的rs20417号SNP位点检测的特异性引物中的正义引物和反义引物的序列为：
正义引物：5’-CAGAAGAAATACTGTTCTCCGTACC-3’，
反义引物：5’-TCCATCAGAAGGCAGGAAACT-3’；
所述特异性荧光探针包括野生型探针和突变性探针，它们的序列为：
野生型探针：5’-FAM-TTTCCCGCCTCTCT-MGB-3’
突变型探针：5’-HEX-TTTCCCCCCTCTCT-MGB-3’。
所述的一种检测人类COX-2基因多态性的试剂盒，还包括TaqDNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水。
所述的野生型特异性荧光探针为Taqman探针，该探针5’端的荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为MGB。
所述的突变型特异性荧光探针为Taqman探针，该探针5’端的荧光基团为HEX，3’端的淬灭基团为MGB。
试剂盒组成
试剂盒的配置成份配合配置，使用时仅需加入样本即可完成实验配置，此种配置更为方便快捷，为优选配置。
配合反应液成份组成：
| 组成成份 | 体积 |
| 10μM的特异性引物 | 0.45μl |
| 正义引物和反义引物 | 0.225μl |
| 5μM的特异性荧光探针 | 0.2μl |
| 5单位/μl的Taq DNA聚合酶 | 0.02μl |
| 20mM的dNTP混合液 | 0.1μl |
| 25mM的MgCl2 | 0.5μl |
| 5X荧光定量PCR反应缓冲液 | 2μl |
| 去离子水 | 4.73μl |
使用试剂盒的操作步骤
步骤1：全血细胞裂解液的制备
取受检者外周静脉血300μl，加入700μl细胞裂解液，颠倒混匀5次，12000rpm离心1分钟，倒去上清，并将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保沉淀在管中，加入300μl双蒸水，涡旋震荡混匀成细胞裂解悬液。
步骤2：荧光定量PCR反应
荧光定量PCR反应体系总体积为10μl，包括：浓度为20ng/μl的细胞裂解悬液2μl、浓度为10μM的特异性引物共0.45μl，其中正义引物和反义引物各0.225μl；浓度为5μM的特异性荧光探针共0.2μl，其中野生型探针和突变型探针各0.1μl；浓度为5单位/μl的TaqDNA聚合酶0.02μl；浓度为20mM的dNTP混合液0.1μl；浓度为25mM的MgCl2溶液0.5μl；5X荧光定量PCR反应缓冲液2μl；去离子水4.73μl。
在ABI7500型荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为：50℃下2min，95℃下10min，再进行40～55个PCR循环(92℃下15s，58℃下1min)，反应结束后在ABI7900HT型荧光定量PCR仪读取荧光量。
步骤3：基因型分析及确定基因型
采用ABI7500型荧光定量PCR仪自带软件SDS(SequenceDetectionSystems)V2.0，根据检测反应管中的FAM荧光和HEX荧光PCR曲线，判断COX-2基因上的rs20417号SNP位点的分型，分型的具体依据见下表。
COX-2基因上的rs20417号SNP位点分型依据
| PCR反应管曲线扩增结果 | FAM荧光 | HEX荧光 |
| 纯合野生型 | 阳性(起线) | 阴性(不起线) |
| 杂合型 | 阳性(起线) | 阳性(起线) |
| 纯合突变型 | 阴性(不起线) | 阳性(起线) |
如图1所示，荧光定量PCR扩增曲线仅FAM荧光起线，HEX荧光不起线，为COX-2基因上的rs20417号SNP位点纯合野生型。
如图2所示，荧光定量PCR扩增曲线FAM和HEX2条荧光都起线，为COX-2基因上的rs20417号SNP位点杂合型。
如图3所示，荧光定量PCR扩增曲线仅仅HEX荧光起线，FAM荧光不起线，为COX-2基因上的rs20417号SNP位点纯合突变型。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种检测人类COX-2基因多态性的试剂盒，包括盒体和装于盒体内的物质，其特征在于：所述盒体内的物质包括检测COX-2基因上的rs20417号SNP位点的特异性引物及特异性荧光探针、TaqDNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水；
所述特异性引物中的正义引物和反义引物的序列为：
正义引物：5’-CAGAAGAAATACTGTTCTCCGTACC-3’，
反义引物：5’-TCCATCAGAAGGCAGGAAACT-3’；
所述特异性荧光探针包括野生型探针和突变性探针，它们的序列为：
野生型探针：5’-FAM-TTTCCCGCCTCTCT-MGB-3’
突变型探针：5’-HEX-TTTCCCCCCTCTCT-MGB-3’。
2.如权利要求1所述的一种检测人类COX-2基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述盒体中各物质的含量为：浓度为10μM的特异性引物共0.45μl，其中正义引物和反义引物各0.225μl；浓度为5μM的特异性荧光探针共0.2μl，其中野生型探针和突变型探针各0.1μl；浓度为5单位/μl的TaqDNA聚合酶0.02μl；浓度为20mM的dNTP混合液0.1μl；浓度为25mM的MgCl2溶液0.5μl；5X荧光定量PCR反应缓冲液2μl；去离子水4.73μl。
3.如权利要求1所述的一种检测人类COX-2基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物中，正义引物的Tm值为58.6℃，反义引物的Tm值为58.5℃；所述特异性荧光探针中，野生型探针的Tm值为67℃，突变型探针的Tm值为66℃。
4.如权利要求1所述的一种检测人类COX-2基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的保存温度为-20℃。
5.一种检测人类COX-2基因多态性的试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂盒用于检测COX-2基因上rs20417号SNP位点的基因型。
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| CN108949532A (zh) * | 2018-10-12 | 2018-12-07 | 宁波奥丞生物科技有限公司 | 用于检测cox-2基因多态性的试剂盒 |
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