CN105670008B - 一种水溶性交联透明质酸干粉及应用 - Google Patents

一种水溶性交联透明质酸干粉及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及透明质酸交联技术领域，特别涉及一种水溶性的交联透明质酸干粉：将透明质酸溶解在含交联剂的碱性溶液中进行反应；反应液稀释后加入氯乙酸反应；添加有机溶剂沉淀，调节pH值至近中性，得到白色沉淀；洗涤若干次，去除残留溶剂，得湿粉末；在25‑50℃进行真空干燥，得交联透明质酸干粉。交联透明质酸粉末是水溶性的，可根据需要配制各种浓度；无色透明、无颗粒、与水混溶、BDDE残留量为0，黏度高，生物相容性好；反应条件温和，可减低能耗；交联剂用量小，可大大降低成本与使用风险；操作简单，适合大量工业化生产，过程染菌几率小。

Description

一种水溶性交联透明质酸干粉及应用
技术领域
本发明涉及透明质酸交联技术领域，特别涉及一种水溶性的交联透明质酸干粉，还涉及其应用。
背景技术
HA因其独特的保湿性、黏弹性与生物学功能，已在临床医学、美容整形、化妆品和保健食品等领域得到了广泛应用。天然HA广泛分布于动物和人体的细胞外基质中，因此具有良好的生物相容性。但天然HA用作化妆品原料，添加量多时，涂抹过程中易拉丝、起泥，涂后的皮肤出汗或处在较潮湿的环境下，容易发黏。用于体内注射时，存在易发生降解，体内存留时间短，易扩散等不稳定的缺点，大大限制了其应用领域。
为了克服天然HA存在的上述缺点，国内外研究人员对HA进行了各种交联与修饰，争取在保留原有生物相容性的基础上，改进其流变学特性并延长其在体内的停留时间。
美国专利US20030148995公开了一种整形手术用水凝胶的制备方法。该专利是在HA交联成一团凝胶后，再经溶胀、浸泡等除去未反应的交联剂，由于HA交联后形成了一个不溶于水的致密的水凝胶网络，这种方法很难将交联剂的残留量降至足够低的水平。
中国专利CN 101724164 B公开了一种制备交联HA凝胶时无需纯化即可降低交联剂残留量的方法。该专利在交联HA凝胶制备过程中监测到交联剂含量随交联时间的增加而消耗降低。该专利所述方法虽然步骤简单，但是交联反应时间为3-28天，时间太长，且制备的凝胶均质后含有水不溶性的颗粒。
中国专利CN 103923328 A公开了一种制备交联HA干粉的方法。所述的制备交联HA干粉的介质是氢氧化钠水溶液-丙酮混合溶液，HA在固体状态下与BDDE发生交联反应。经中和、过滤、洗涤和真空干燥获得水不溶性干粉，加入去离子水会溶胀成凝胶颗粒。所述专利中，BDDE与HA的质量比为1:1.3-1:1.8，BDDE的用量很大。
专利WO2008056069涉及到一种溶于水的交联HA干粉的制备方法。该方法在交联反应阶段之前，需将HA预先活化，增加了操作步骤，且引入的耦合剂与催化剂残留，也会增加终产品使用时的安全性。
专利CN 102757572 A提供了一种新型的交联透明质酸的制备方法。其特征在于，以低浓度透明质酸为基质进行交联，再用有机溶剂将交联好的透明质酸进行沉淀并多次洗涤沉淀，过滤，得到白色湿沉淀，再复溶后透析，得到交联透明质酸凝胶。此方法中间得到的是含有大量有机溶剂和水的湿沉淀，复溶后虽进行透析，得到的交联透明质酸凝胶中仍会残留较大量的有机溶剂，影响凝胶的使用效果，且透析操作不易于大规模工业生产。
当交联HA凝胶应用于生物体内时，存在着影响其生物安全性的两个因素，即交联HA凝胶的固体颗粒状与交联剂残留。就是说，一方面，交联程度过大的交联HA凝胶呈固体颗粒状，表现为水不溶性，其不再像天然HA一样被细胞识别，因此被感知为异物而启动炎症反应。另一方面，当通过交联剂与HA进行化学交联制备交联HA时，产物中常残留大量的交联剂，应用于生物体时，会被识别为异物而引起炎症等副反应。因此，为了保持良好的生物相容性，需要制备一种理化特性尽可能靠近天然HA，交联剂残留量尽可能低，而在生物体内存留时间尽可能长的交联HA粉末或凝胶。
发明内容
为了解决以上现有技术中未交联透明质酸降解时间快，交联HA的水不溶性、交联剂残留的问题，本发明提供了一种水溶性的、无交联剂残留、降解时间慢的交联透明质酸。
本发明还提供了交联透明质酸的应用。
本发明是通过以下步骤得到的：
一种水溶性交联透明质酸干粉，是通过以下步骤得到的：
(1)将透明质酸溶解在含交联剂的碱性溶液中，10-50℃(优选为15-40℃，更优选为15-30℃)搅拌反应2-8小时(优选4-8小时)；
(2)向步骤(1)所得的反应液中加入水或无机盐水溶液稀释，随后在搅拌状态下加入含氯乙酸的有机溶剂，搅拌反应1-3小时，优选2小时；
(3)继续添加有机溶剂进行沉淀，然后加入无机酸调节pH值至近中性，得到白色沉淀；
(4)用有机溶剂洗涤白色沉淀若干次，去除残留溶剂，抽滤除去液体得湿粉末；
(5)湿粉末在25-50℃(优选为30-40℃)进行真空干燥，得交联透明质酸干粉。
所述的交联透明质酸干粉,优选交联剂为二乙烯基砜、乙二醇二缩水甘油醚、甘油二缩水甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、1,2,7,8-二环氧辛烷、1,3-二环氧丁烷和三偏磷酸钠中的一种以上。
所述的交联透明质酸干粉,优选步骤(1)中交联剂与透明质酸质量比为0.05-10：100，优选为0.1-5：100。
所述的交联透明质酸干粉,优选步骤(1)中碱性溶液由无机碱提供，其中碱浓度为0.1mol/L-1.5mol/L，优选为0.1-1.0mol/L。
优选交联剂与透明质酸质量比小于10：100时，透明质酸的分子量为1.0×105-3.0×106Da，透明质酸的浓度大于1％(w/v)且小于等于40％(w/v)，碱性溶液浓度为0.1-1.5mol/L；交联剂与透明质酸质量比为10：100时，透明质酸的分子量为1.0×105-3.0×106Da，透明质酸的浓度大于1％(w/v)且小于15％(w/v)，碱性溶液浓度大于等于0.1mol/L小于1mol/L，或透明质酸的分子量为1.0×105-1.05×106Da，透明质酸的浓度大于1％(w/v)小于等于40％(w/v)，碱性溶液浓度为0.1-1.5mol/L。
所述的交联透明质酸干粉,优选步骤(2)、(3)、(4)中有机溶剂是乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、丙二醇或丙酮。
所述的交联透明质酸干粉,优选步骤(2)中无机盐为钠盐、钾盐、钙盐、锌盐或镁盐。
所述的交联透明质酸干粉，优选步骤(2)中氯乙酸与透明质酸的质量比为1:1-40，含氯乙酸的有机溶剂与反应稀释液的体积比小于50％。
所述的交联透明质酸干粉,优选所述的透明质酸原料来自于动物组织提取，或来自于细菌发酵生产。可以是透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸锌等透明质酸金属盐，或将透明质酸的羟基、羧基等醚化、酯化、酰胺化、缩醛化、缩酮化、乙酰化得到的透明质酸衍生物等。透明质酸的分子量为1.0×105-3.0×106Da，优选为3.0×105-2.0×106Da，更优选为8.0×105-2.0×106Da。透明质酸的浓度为1-40％(w/v)，优选为2-30％(w/v)，更优选为5-20％(w/v)。
所述的交联透明质酸干粉,优选溶于水制成无色、透明、均匀的液体。
所述的交联透明质酸干粉在化妆品、软组织填充和关节腔注射液中的应用。应用于化妆品，有很好的保湿效果、增稠效果和活性成分缓释效果。应用于软组织填充，有很强的生物相容性。应用于关节腔注射液，可延长体内存留时间，减少注射次数。
该新型交联透明质酸可用于软组织填充，注射到皮下组织起到一定填充赋形作用、填充皱纹和皮下补水作用。
该新型交联透明质酸还可用于制备关节腔注射液，弥补现有医用透明质酸钠凝胶治疗骨关节炎时要反复多次注射的不足。
本发明所述的“水溶性交联透明质酸”是指溶于水或缓冲溶液中呈现均一相的交联透明质酸。
本发明经氯乙酸处理后透明质酸的羟基进行了羧甲基化，使得水溶性增强，抗酶解性也有所提高，因此交联后的透明质酸溶解性与抗酶解性更强。
交联剂除了在乙醇沉淀、脱水等纯化步骤中除去一部分之外，剩余的交联剂完全参与反应而耗尽。在使交联剂的自由态官能团完全消耗掉以后即终止交联反应。因此，交联剂残留量为0，交联产物中以键结态存在的一端为游离态的交联剂含量也为0。
本发明的有益效果
(1)本发明通过独特的交联制备方法，制得具有超高分子量和更强保水性的交联透明质酸。
(2)交联透明质酸粉末是水溶性的，可根据需要配制各种浓度；
(3)由上述粉末溶解而成的凝胶无色透明、无颗粒、与水混溶、BDDE残留量为0(检不出)，黏度高，生物相容性好；
(4)专利技术涉及的工艺反应条件温和，可减低能耗；交联剂用量小，可大大降低成本与使用风险；操作简单，适合大量工业化生产，过程染菌几率小。
附图说明
图1交联透明质酸的体外抗酶解能力比较，
图2样品涂抹前后皮肤水分含量增加率变化曲线，
图3样品涂抹前后皮肤水分散失量增加率变化曲线，
图4含交联透明质酸膏霜使用前后皮肤弹性相对增加率。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例进一步说明。
一、制备交联透明质酸的实施例如下。
实施例1
透明质酸钠浓度＝15％(w/v)，碱浓度＝1mol/L，交联剂与透明质酸钠质量比＝0.2g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚：100g透明质酸
称取0.03g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入100ml的1mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀后在电动搅拌下加入15g分子量为1.41×106Da的透明质酸钠，在25℃温度下反应4小时后，加入400ml的纯化水稀释上述反应液，然后一边强力搅拌一边流加预先溶解1g氯乙酸的乙醇200ml，搅拌2小时，然后继续流加乙醇1050ml，得到初交联透明质酸纤维。沉淀再用乙醇反复洗涤3次后，抽滤除去液体，得初交联透明质酸湿粉末。将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到交联透明质酸钠粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钠粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果得到无色透明且均相的粘稠状凝胶，测定的动力黏度为162400mPa·s。
实施例2
透明质酸钠浓度＝15％(w/v)，碱浓度＝1mol/L，交联剂与透明质酸钠质量比＝0.6g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚：100g透明质酸
称取0.09g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入100ml的1mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀后在电动搅拌下加入15g分子量为1.41×106Da的透明质酸钠，在25℃温度下反应4小时后，加入400ml的纯化水稀释上述反应液，然后一边强力搅拌一边流加预先溶解1g氯乙酸的乙醇200ml，搅拌2小时，然后继续流加乙醇1050ml，得到初交联透明质酸纤维。沉淀再用乙醇反复洗涤3次后，抽滤除去液体，得初交联透明质酸湿粉末。将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到交联透明质酸钠粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钠粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果得到无色透明且均相的粘稠状凝胶，测定的动力黏度为217000mPa·s。
实施例3
透明质酸钠浓度＝15％(w/v)，碱浓度＝1mol/L，交联剂与透明质酸钠质量比＝1g1,4-丁二醇二缩水甘油醚：100g透明质酸
称取0.15g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入100ml的1mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀后在电动搅拌下加入15g分子量为1.41×106Da的透明质酸钠，在25℃温度下反应4小时后，加入400ml的纯化水稀释上述反应液，然后一边强力搅拌一边流加预先溶解1g氯乙酸的乙醇200ml，搅拌2小时，然后继续流加乙醇1050ml，得到初交联透明质酸纤维。沉淀再用乙醇反复洗涤3次后，抽滤除去液体，得初交联透明质酸湿粉末。将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到交联透明质酸钠粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钠粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果得到无色透明且均相的粘稠状凝胶，测定的动力黏度为376000mPa·s。
实施例4
透明质酸钠浓度＝15％(w/v)，碱浓度＝1mol/L，交联剂与透明质酸钠质量比＝2g1,4-丁二醇二缩水甘油醚：100g透明质酸
称取0.30g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入100ml的1mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀后在电动搅拌下加入15g分子量为1.41×106Da的透明质酸钠，在25℃温度下反应4小时后，加入400ml的纯化水稀释上述反应液，然后一边强力搅拌一边流加预先溶解1g氯乙酸的乙醇200ml，搅拌2小时，然后继续流加乙醇1050ml，得到初交联透明质酸纤维。沉淀再用乙醇反复洗涤3次后，抽滤除去液体，得初交联透明质酸湿粉末。将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到交联透明质酸钠粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钠粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果得到无色透明且均相的粘稠状凝胶，测定的动力黏度为522000mPa·s。
实施例5
透明质酸钠浓度＝15％(w/v)，碱浓度＝1mol/L，交联剂与透明质酸钠质量比＝5g1,4-丁二醇二缩水甘油醚：100g透明质酸
称取0.75g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入100ml的1mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀后在电动搅拌下加入15g分子量为1.41×106Da的透明质酸钠，在25℃温度下反应4小时后，加入400ml的纯化水稀释上述反应液，然后一边强力搅拌一边流加预先溶解1g氯乙酸的乙醇200ml，搅拌2小时，然后继续流加乙醇1050ml，得到初交联透明质酸纤维。沉淀再用乙醇反复洗涤3次后，抽滤除去液体，得初交联透明质酸湿粉末。将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到交联透明质酸钠粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钠粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果得到无色透明且均相的粘稠状凝胶，测定的动力黏度为718600mPa·s。
比较例1
透明质酸钠浓度＝15％(w/v)，碱浓度＝1mol/L，交联剂与透明质酸钠质量比＝10g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚：100g透明质酸
称取1.50g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入100ml的1mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀后在电动搅拌下加入15g分子量为1.41×106Da的透明质酸钠，在25℃温度下反应4小时后，加入400ml的纯化水稀释上述反应液，然后一边强力搅拌一边流加预先溶解1g氯乙酸的乙醇200ml，搅拌2小时，然后继续流加乙醇1050ml，得到初交联透明质酸纤维。沉淀再用乙醇反复洗涤3次后，抽滤除去液体，得初交联透明质酸湿粉末。将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到交联透明质酸钠粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钠粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果交联透明质酸粉末不溶于水，在水中仍以白色固体状态存在。
实施例6
透明质酸钠浓度＝5％(w/v)，碱浓度＝0.1mol/L，交联剂与透明质酸钠质量比＝10g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚：100g透明质酸
称取0.50g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入100ml的0.1mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀后在电动搅拌下加入5g分子量为1.41×106Da的透明质酸钠，在25℃温度下反应4小时后，加入400ml的5％氯化钠水溶液稀释上述反应液，然后一边强力搅拌一边流加预先溶解1g氯乙酸的乙醇200ml，搅拌2小时，然后继续流加乙醇1050ml，得到初交联透明质酸纤维。沉淀再用乙醇反复洗涤3次后，抽滤除去液体，得初交联透明质酸湿粉末。将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到交联透明质酸钠粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钠粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果得到无色透明且均相的粘稠状凝胶，测定的动力黏度为504300mPa·s。
实施例7
透明质酸钠浓度＝5％(w/v)，碱浓度＝0.5mol/L，交联剂与透明质酸钠质量比＝10g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚：100g透明质酸
称取0.50g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入100ml的0.5mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀后在电动搅拌下加入5g分子量为1.41×106Da的透明质酸钠，在25℃温度下反应4小时后，加入400ml的纯化水稀释上述反应液，然后一边强力搅拌一边流加预先溶解1g氯乙酸的乙醇200ml，搅拌2小时，然后继续流加乙醇1050ml，得到初交联透明质酸纤维。沉淀再用乙醇反复洗涤3次后，抽滤除去液体，得初交联透明质酸湿粉末。将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到交联透明质酸钠粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钠粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果得到无色透明且均相的粘稠状凝胶，测定的动力黏度为293000mPa·s。
比较例2
透明质酸钠浓度＝5％(w/v)，碱浓度＝1mol/L，交联剂与透明质酸钠质量比＝10g1,4-丁二醇二缩水甘油醚：100g透明质酸
称取0.50g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入100ml的1mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀后在电动搅拌下加入5g分子量为1.41×106Da的透明质酸钠，在25℃温度下反应4小时后，加入400ml的纯化水稀释上述反应液，然后一边强力搅拌一边流加预先溶解1g氯乙酸的乙醇200ml，搅拌2小时，然后继续流加乙醇1050ml，得到初交联透明质酸纤维。沉淀再用乙醇反复洗涤3次后，抽滤除去液体，得初交联透明质酸湿粉末。将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到交联透明质酸钠粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钠粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果得到无色透明较稀凝胶，测定的动力黏度为91000mPa·s，比初始HA(1.41×106Da)的1％凝胶动力黏度低。
比较例3
透明质酸钠浓度＝15％(w/v)，碱浓度＝0.5mol/L，交联剂与透明质酸钠质量比＝10g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚：100g透明质酸
称取1.50g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入100ml的0.5mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀后在电动搅拌下加入15g分子量为1.41×106Da的透明质酸钠，在25℃温度下反应4小时后，加入400ml的纯化水稀释上述反应液，然后一边强力搅拌一边流加预先溶解1g氯乙酸的乙醇200ml，搅拌2小时，然后继续流加乙醇1050ml，得到初交联透明质酸纤维。沉淀再用乙醇反复洗涤3次后，抽滤除去液体，得初交联透明质酸湿粉末。将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到交联透明质酸钠粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钠粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果交联透明质酸粉末不溶于水，在水中仍以白色固体状态存在。
实施例8
透明质酸钠浓度＝10％(w/v)，碱浓度＝0.5mol/L，交联剂与透明质酸钠质量比＝10g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚：100g透明质酸
称取0.50g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入100ml的0.5mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀后在电动搅拌下加入5g分子量为1.41×106Da的透明质酸钠，在25℃温度下反应4小时后，加入400ml的纯化水稀释上述反应液，然后一边强力搅拌一边流加预先溶解1g氯乙酸的乙醇200ml，搅拌2小时，然后继续流加乙醇1050ml，得到初交联透明质酸纤维。沉淀再用乙醇反复洗涤3次后，抽滤除去液体，得初交联透明质酸湿粉末。将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到交联透明质酸钠粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钠粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果得到无色透明且均相的粘稠状凝胶，测定的动力黏度为567000mPa·s。
比较例4
透明质酸钠浓度＝1％(w/v)，碱浓度＝0.5mol/L，交联剂与透明质酸钠质量比＝10g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚：100g透明质酸
称取0.10g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入100ml的0.5mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀后在电动搅拌下加入1g分子量为1.41×106Da的透明质酸钠，在25℃温度下反应4小时后，加入400ml的纯化水稀释上述反应液，然后一边强力搅拌一边流加预先溶解1g氯乙酸的乙醇200ml，搅拌2小时，然后继续流加乙醇1050ml，得到初交联透明质酸纤维。沉淀再用乙醇反复洗涤3次后，抽滤除去液体，得初交联透明质酸湿粉末。将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到交联透明质酸钠粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钠粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果得到无色透明较稀凝胶，测定的动力黏度为61600mPa·s，比初始HA(1.41×106Da)的1％凝胶动力黏度低。
实施例9
透明质酸钠浓度＝25％(w/v)，碱浓度＝1.0mol/L，交联剂与透明质酸钠质量比＝1g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚：100g透明质酸钠
称取0.2g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入100ml的1.0mol/L氢氧化钾水溶液中，混匀后在电动搅拌下加入20g分子量为8.2×105Da万的透明质酸钠，在15℃温度下反应8小时后，加入400ml的纯化水稀释上述反应液，然后一边强力搅拌一边流加预先溶解4g氯乙酸的乙醇200ml，搅拌2小时，然后继续流加乙醇1050ml，得到初交联透明质酸纤维。沉淀再用乙醇反复洗涤3次后，抽滤除去液体，得初交联透明质酸湿粉末。将湿粉末放入50℃真空干燥，最终得到交联透明质酸钠粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钠粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果得到无色透明且均相的粘稠状凝胶，测定的动力黏度为443000mPa·s。
实施例10
透明质酸钠浓度＝10％(w/v)，碱浓度＝0.25mol/L，交联剂与透明质酸钠质量比＝2g 1,2,7,8-二环氧辛烷：100g透明质酸钠
称取0.2g 1,2,7,8-二环氧辛烷加入100ml的0.25mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀后在电动搅拌下加入10g分子量为1.30×106Da的透明质酸钠，在30℃温度下反应6小时后，加入400ml的4％氯化钠水溶液稀释上述反应液，然后一边强力搅拌一边流加预先溶解2g氯乙酸的乙醇200ml，搅拌2小时，然后继续流加乙醇1050ml，得到初交联透明质酸纤维。沉淀再用乙醇反复洗涤3次后，抽滤除去液体，得初交联透明质酸湿粉末。将湿粉末放入30℃真空干燥，最终得到交联透明质酸钠粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钠粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果得到无色透明且均相的粘稠状凝胶，测定的动力黏度为407000mPa·s。
实施例11
透明质酸钾浓度＝15％(w/v)，碱浓度＝1.0mol/L，交联剂与透明质酸钾质量比＝1g乙二醇二缩水甘油醚：100g透明质酸钾
称取0.15g乙二醇二缩水甘油醚加入100ml的1.0mol/L氢氧化钾水溶液中，混匀后在电动搅拌下加入15g分子量为1.41×106Da的透明质酸钾，在25℃温度下反应4小时后，加入400ml的纯化水稀释上述反应液，然后一边强力搅拌一边流加预先溶解3g氯乙酸的乙醇200ml，搅拌2小时，然后继续流加乙醇1050ml，得到初交联透明质酸纤维。沉淀再用乙醇反复洗涤3次后，抽滤除去液体，得初交联透明质酸湿粉末。将湿粉末放入30℃真空干燥，最终得到交联透明质酸钾粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钾粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果得到无色透明且均相的粘稠状凝胶，测定的动力黏度为323000mPa·s。
实施例12
透明质酸锌浓度＝8％(w/v)，碱浓度＝0.5mol/L，交联剂与透明质酸钾质量比＝10g三偏磷酸钠：100g透明质酸锌
称取0.8g三偏磷酸钠加入100ml的0.5mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀后在电动搅拌下加入8g分子量为1.05×106Da的透明质酸锌，在25℃温度下反应5小时后，加入400ml的纯化水稀释上述反应液，然后一边强力搅拌一边流加预先溶解1.8g氯乙酸的乙醇200ml，搅拌2小时，然后继续流加乙醇1050ml，得到初交联透明质酸纤维。沉淀再用乙醇反复洗涤3次后，抽滤除去液体，得初交联透明质酸湿粉末。将湿粉末放入30℃真空干燥，最终得到交联透明质酸锌粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸锌粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果得到无色透明且均相的粘稠状凝胶，测定的动力黏度为430000mPa·s。
实施例13
透明质酸钠浓度＝1％(w/v)，碱浓度＝0.1mol/L，交联剂与透明质酸钠质量比＝10g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚：100g透明质酸
称取0.10g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入100ml的0.1mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀后在电动搅拌下加入1g分子量为2.80×106Da的透明质酸钠，在25℃温度下反应4小时后，加入400ml的5％氯化钠水溶液稀释上述反应液，然后一边强力搅拌一边流加预先溶解1g氯乙酸的乙醇200ml，搅拌2小时，然后继续流加乙醇1050ml，得到初交联透明质酸纤维。沉淀再用乙醇反复洗涤3次后，抽滤除去液体，得初交联透明质酸湿粉末。将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到交联透明质酸钠粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钠粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果得到无色透明且均相的粘稠状凝胶，测定的动力黏度为256000mPa·s。
实施例14
透明质酸钠浓度＝40％(w/v)，碱浓度＝1.5mol/L，交联剂与透明质酸钠质量比＝10g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚：100g透明质酸
称取4.00g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入100ml的1.5mol/L氢氧化钠水溶液中，混匀后在电动搅拌下加入40g分子量为3.70×105Da的透明质酸钠，在25℃温度下反应4小时后，加入400ml的纯化水稀释上述反应液，然后一边强力搅拌一边流加预先溶解1g氯乙酸的乙醇200ml，搅拌2小时，然后继续流加乙醇1050ml，得到初交联透明质酸纤维。沉淀再用乙醇反复洗涤3次后，抽滤除去液体，得初交联透明质酸湿粉末。将湿粉末放入40℃真空干燥，最终得到交联透明质酸钠粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钠粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果得到无色透明且均相的粘稠状凝胶，测定的动力黏度为342900mPa·s。
比较例5：不经氯乙酸处理
同实施例1相比，反应液中不加入氯乙酸，其余操作同实施例1一致，得到的粉末不溶于水。
比较例6
同实施例1相比，得湿粉末后，经20℃干燥，得交联透明质酸钠粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钠粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果得到无色透明且均相的粘稠状凝胶，测定的动力黏度为103500mPa·s。
比较例7
同实施例1相比，得到白色沉淀后，沉淀不经过洗涤，直接进行真空干燥，最终得到交联透明质酸钠粉末。准确称取上述制备的交联透明质酸钠粉末1g，用纯化水100ml溶解，结果得到的粉末不溶于水，在水中仍以白色固体状态存在。
二、以实施例1-14制备的交联透明质酸粉末为研究对象，进行理化性质研究。
实施例15动力黏度的测定
用水分测定仪分别测定实施例1-14制备的交联透明质酸粉末的含水量，均在5-15％之间。折干后用纯化水配成浓度为0.2％的溶液，均呈无色透明、均相、粘稠状。使用旋转粘度计，选择适当的转子与转速测定0.2％溶液的动力黏度，结果见表1。
表1天然透明质酸与交联透明质酸动力黏度的比较
天然透明质酸的分子结构是一线性单链，在水溶液中扩展后无规则卷曲成线圈状。这种线圈状的三级结构是依靠氢键和疏水作用维持的，一旦受到外界作用力便很容易变形。交联透明质酸是利用交联剂的活性官能团，在透明质酸分子间和分子内部通过共价键产生桥接，从而赋予交联透明质酸致密的网状结构，不易受外界作用力的干扰。表现在动力黏度上，则是交联透明质酸的动力黏度远远高于天然透明质酸。
实施例16交联剂残留量的测定
实施例1-11、13-14的交联透明质酸粉末用5mmol/L，pH6.0的磷酸盐缓冲溶液配制成凝胶，经透明质酸酶充分水解后，再按照Nelis和Sinsheimer的方法，测定水解产物中环氧化物官能团的含量。Nelis和Sinsheimer的方法是采用高度灵敏的荧光光度法在生理条件下测定脂肪族环氧化合物的含量。测定波长为370nm下的吸收波长。(A SensitiveFluorimetric for the Determination of Aliphatic Epoxides under PhysiologicalConditions,Analytical Biochemistry,Volume 115,Issue 1,15July 1981,Pages 151-157.)
用上述方法测定实施例1-11、13-14制备的交联透明质酸粉末中交联剂残留情况，结果见表2。
表2交联透明质酸粉末中交联剂残留量的测定
*不在检量限范围(1-300ppm)
实施例17抗酶降解性的测定
细菌透明质酸酶可以特异性降解透明质酸，酶解产物中会出现双键，在232nm处有紫外吸收。因此A232能够反映酶解情况，A232数值越大，表示含双键的降解产物越多，酶解作用越强。以实施例1-5、实施例9、比较例6得到的交联透明质酸配成的0.2％溶液为底物，加入细菌透明质酸酶，在温度为37℃，5mmol/L，pH6.0的磷酸盐缓冲溶液为介质下进行酶解反应，加热煮沸2分钟以终止酶解反应。通过测定不同反应时间下酶解产物在232nm处的紫外吸收值，以天然透明质酸(分子量为1.30×106Da)与Restylane为对照，可以看出实施例1-5、实施例9、比较例6、天然透明质酸、Restylane的交联透明质酸都具有不同程度的抗酶降解性能，如图1所示，其中，天然透明质酸、比较例6和Restylane降解较严重，实施例4、5、9降解现象较轻微。
三、交联透明质酸的保湿及改善皮肤弹性功效研究。
以实施例1制备的交联透明质酸粉末为例，以天然透明质酸(分子量为1.30×106Da)与Restylane为对照，并设置空白试验。具体地，以基础精华液作为空白，用基本精华液配制1‰天然透明质酸溶液、用基础精华液将Restylane凝胶稀释20倍作为对照，用基本精华液配制的0.2‰、0.4‰和1‰交联透明质酸溶液作为实验样品，进行了保湿功效的初步研究。以基础膏霜作为对照，分别加入0.2‰、0.4‰和1‰的交联透明质酸作为实验样品，进行了改善皮肤弹性功效的初步研究。
实施例18：交联透明质酸保湿性的测定
在受试者左、右前臂屈侧标记6个4cm×4cm的试验区域，分别涂抹实验样品0.2‰、0.4‰和1‰交联透明质酸溶液，对照品1‰天然透明质酸溶液、Restylane凝胶20倍稀释液及空白，涂抹量为3.0±0.1mg/cm2，轻轻按摩至样品吸收。使用皮肤水分测定仪和皮肤水分流失测定仪测定涂抹前及涂后30min，1h，3h，6h，16h，20h及24h时各区域内的皮肤水分含量和皮肤水分流失量。
实验结果如图2和图3所示。从图2可以看出，0.5h时，涂抹交联透明质酸的3个浓度的样品，皮肤水分含量均高于空白和对照；1h至6h，1‰交联透明质酸溶液样品的皮肤水分含量最高，0.2‰、0.4‰交联透明质酸溶液样品比1‰天然透明质酸溶液、Restylane凝胶20倍稀释液的皮肤水分含量略高；16h后各组均不能增加皮肤含水量。交联透明质酸样品对皮肤水分散失的影响见图3。结果显示，样品浓度越高，皮肤水分散失越少，锁水能力越强；1h内，三个浓度样品均使皮肤水分散失量有所下降；1‰交联透明质酸溶液样品在24h内能够持续抑制水分散失，锁水效果更好。Restylane凝胶20倍稀释液的皮肤保湿性略优于1‰天然透明质酸溶液，但不及0.2‰、0.4‰和1‰交联透明质酸溶液。
实施例19：交联透明质酸改善皮肤弹性的功效研究
将受试者左、右前臂屈侧分别划分为上下两个部分，分别涂抹实验样品0.2‰、0.4‰和1‰交联透明质酸溶液及对照，涂抹量为3.0±0.1mg/cm2，轻轻按摩至样品吸收，每日早晚各一次，共持续涂抹8周。使用皮肤弹性测定仪测定皮肤弹性的变化。
实验结果如图4所示，涂抹含0.4‰交联透明质酸的膏霜后与对照品相比，皮肤弹性有显著性增加，含1‰交联透明质酸的膏霜次之，含0.2‰的交联透明质酸对皮肤弹性增加率最低，并非浓度越高效果越好。含0.4‰交联透明质酸的膏霜使用1周后弹性增加7.53％，使用8周后弹性增加8.66％。
综上，本发明所得的交联透明质酸粉末及其凝胶具有水溶性、很高的动力黏度、很强的抗酶降解性和无交联剂残留，因此可以放心安全使用。应用到化妆品中，具有良好的保湿效果，以及对皮肤弹性有较好的改善作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种水溶性交联透明质酸干粉，其特征在于是通过以下步骤得到的：
（1）将透明质酸溶解在含交联剂的碱性溶液中，10-50℃搅拌反应2-8小时；
（2）向步骤（1）所得的反应液中加入水或无机盐水溶液稀释，随后在搅拌状态下加入含氯乙酸的有机溶剂，搅拌反应1-3小时；
（3）继续添加有机溶剂进行沉淀，然后加入无机酸调节pH值至近中性，得到白色沉淀；
（4）用有机溶剂洗涤白色沉淀若干次，去除残留溶剂，抽滤除去液体得湿粉末；
（5）湿粉末在25-50℃进行真空干燥，得交联透明质酸干粉；
所述的步骤（1）中交联剂与透明质酸质量比小于10：100时，透明质酸的分子量为1.0×105-3.0×106Da，透明质酸的浓度大于1%且小于等于40%，碱性溶液浓度为0.1-1.5mol/L；
交联剂与透明质酸质量比为10：100时，透明质酸的分子量为1.0×105-3.0×106Da，透明质酸的浓度大于1%且小于15%，碱性溶液浓度大于等于0.1 mol/L 小于1mol/L，或透明质酸的分子量为1.0×105-1.05×106Da，透明质酸的浓度大于1%小于等于40%，碱性溶液浓度为0.1-1.5mol/L；
所述透明质酸的浓度为质量体积百分比浓度，表示每100mL液体中含有的透明质酸的克数。
2.根据权利要求1所述的交联透明质酸干粉,其特征在于交联剂为二乙烯基砜、乙二醇二缩水甘油醚、甘油二缩水甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、1,2,7,8-二环氧辛烷、1,3-二环氧丁烷和三偏磷酸钠中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的交联透明质酸干粉,其特征在于步骤（2）、（3）、（4）中有机溶剂是乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、丙二醇或丙酮。
4.根据权利要求1所述的交联透明质酸干粉,其特征在于步骤（2）中无机盐为钠盐、钾盐、钙盐、锌盐或镁盐。
5.根据权利要求1所述的交联透明质酸干粉，其特征在于步骤（2）中氯乙酸与透明质酸的质量比为1:1-40。
6.根据权利要求1所述的交联透明质酸干粉，其特征在于所述的透明质酸为透明质酸金属盐，或将透明质酸的羟基、羧基进行醚化、酯化、酰胺化、缩醛化、缩酮化、乙酰化得到的透明质酸衍生物。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的交联透明质酸干粉，其特征在于其溶于水能够得到无色、透明、均匀的液体。
8.一种权利要求1-6中任一项所述的交联透明质酸干粉在化妆品和关节腔注射液中的应用。
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