CN105664244B - 一种制备多孔软骨支架的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物领域，公开了一种制备多孔软骨支架的方法，该方法包括：将用于多孔软骨支架的微球进行激光烧结，所述用于多孔软骨支架的微球中含有聚乳酸羟基乙酸、马钱子碱、聚乙烯醇、壳聚糖以及任选含有士的宁，且以所述用于多孔软骨支架的微球的总重量为基准，所述马钱子碱与任选含有的士的宁的总含量为0.1‑10重量％，且所述微球的平均粒径为1‑80微米。由本发明的方法提供的多孔软骨支架具有适宜的降解速率和缓释药物的功能，还能促进软骨组织形成且无药物不良反应、孔隙率适中。

Description

一种制备多孔软骨支架的方法
技术领域
本发明涉及医药支架领域，具体地，涉及一种制备多孔软骨支架的方法。
背景技术
随着我国交通运输事业的飞速发展和老龄化社会进程的逐步迈进，关节软骨创伤、感染、退行性变的发生率逐年增加，严重影响人们的生活质量。用组织工程软骨来修复关节软骨缺损具有广阔的应用前景，但种子细胞的缺乏一直是制约软骨组织工程技术临床应用的关键问题。自体软骨细胞是软骨构建效果最为理想的种子细胞，但在人体软骨中可供利用的软骨细胞数量非常有限，并且在取材时造成的创伤也较大，在体外大量扩增后又极易发生老化与去分化，难以维持软骨细胞的表型，从而丧失软骨的形成能力。
3D打印技术为组织工程支架制造提供了新的理论和技术。为促进软骨的再生，支架还应具有微孔结构以有利于降低局部的氧张力和非矿化骨样组织长入，因此如何制造出既有精确解剖学形态，又具有适当尺寸的孔隙及孔隙率的三维立体结构的支架，是医学界一直在探索的问题。
聚乳酸羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)是一种可降解的高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、安全性和靶向性修饰等优点。聚乳酸羟基乙酸制备成载药粉末后，利用3D打印制成的软骨支架能随着其在体内的逐渐降解，释放出其中包载的药物，实现缓慢释药，达到长效给药的目的，是一种良好的药物递送载体和支架材料。然而，聚乳酸羟基乙酸在生物体内降解后形成的局部酸性还是会导致周围器官和组织产生炎症反应，并且其相对较高的疏水性、较高的药物突释和较低的靶向性也在一定程度上限制了其应用。
另外，现代研究发现，某些具活血通络功效的中药能促进软骨细胞增殖、改善微循环。例如中药马钱子即为传统的治疗骨关节疾病的常用药物。马钱子味苦、性温、有大毒，入肝、脾经功能通络止痛，散结消肿，用于治疗风湿顽痹、麻木瘫痪、跌扑损伤、痈疽肿痛等。
马钱子碱和士的宁是中药马钱子中的有效成分，具有抗炎免疫、抗肿瘤、促血液循环等作用。近年研究还发现马钱子碱不仅能够促进软骨细胞增殖，而且能够在一定浓度范围内降低NO诱导的人软骨细胞早期凋亡，其保护软骨的作用可能是通过线粒体通路实现的。
马钱子碱促进软骨细胞增殖的作用令人鼓舞，但同时马钱子碱和士的宁还存在严重的中枢神经毒性，而且由于马钱子碱的治疗量和中毒量接近，稍有不慎就可引起惊厥，甚至发生强烈的痉挛、抽搐而危及生命，因而极大地限制了其在临床上的使用。如何提高马钱子碱或士的宁在其效应靶点中的浓度，减少其在组织中的分布从而降低其中枢神经毒性，是实现其减毒增效的关键。所以在确保疗效的基础上，开发马钱子碱和士的宁的缓控释药载体，成为了研究的焦点。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种制备多孔软骨支架的新方法，以期通过该新方法能够得到具有适宜降解速率、缓释药物的功能以及无药物不良反应且孔隙率适中、能够促进软骨细胞生长的优点的多孔软骨支架。
为了实现上述目的，本发明提供一种制备多孔软骨支架的方法，该方法包括：将用于多孔软骨支架的微球进行激光烧结，所述用于多孔软骨支架的微球中含有聚乳酸羟基乙酸、马钱子碱、聚乙烯醇、壳聚糖和任选的士的宁，且以所述用于多孔软骨支架的微球的总重量为基准，所述马钱子碱与任选的士的宁的总含量为0.1-10重量％，且所述微球的平均粒径为1-80微米。
本发明的发明人基于长期的创造性研究后发现，通过采用含有聚乳酸羟基乙酸、马钱子碱、聚乙烯醇和壳聚糖以及任选的含有士的宁的组合物作为多孔软骨支架的原料时，由于壳聚糖的亲水性和活性氨基的存在，通过壳聚糖的修饰可以改善PLGA载体的细胞粘附性和缓释性，而且壳聚糖所带的正电荷基团还可与表面带负电荷的细胞膜相互作用，增强膜通透性，提高对细胞的药物递送率，并且壳聚糖是天然阳离子聚合物，具有良好的生物相容性、粘附性及可降解性，具有较好的靶向性和抑菌性，而使用马钱子碱在促进软骨细胞增殖的同时还能够有效地避免聚乳酸羟基乙酸分解时引起的炎症等不良反应。
具体地，本发明提出了一种采用马钱子碱以及任选的士的宁作为实验药，利用乳化剂蒸发包埋进PLGA和壳聚糖内，然后利用机械球磨制备成复合粉末，为制备多孔软骨支架提供载药粉末材料，以获得一种兼有药物缓释功能的新型软骨组织工程支架原料。
本发明的上述技术方案还具有如下具体的优点：
1)本发明的多孔软骨支架具有适宜的降解速度，且降解产物对人体无害，具有良好的生物相容性；
2)本发明提供的多孔软骨支架具有适宜的孔隙率；
3)本发明提供的多孔软骨支架有利于细胞的黏附及增殖，促进软骨组织形成，且有缓释药物的功能，对机体无毒无害，对药效无不良影响。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的测试例4中细胞在由制备例1的微球制备得到的多孔软骨支架(实施例1中所得)上的黏附和生长情况的SEM图。
图2是本发明的测试例4中细胞在由对比制备例1的微球制备得到的多孔软骨支架(实施例1中所得)上的黏附和生长情况的SEM图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种制备多孔软骨支架的方法，该方法包括：将用于多孔软骨支架的微球进行激光烧结，所述用于多孔软骨支架的微球中含有聚乳酸羟基乙酸、马钱子碱、聚乙烯醇、壳聚糖以及任选含有士的宁，且以所述用于多孔软骨支架的微球的总重量为基准，所述马钱子碱与任选含有的士的宁的总含量为0.1-10重量％，且所述微球的平均粒径为1-80微米。
本发明的发明人在研究中发现：采用激光烧结技术制备本发明所述的多孔软骨支架时，相比于采用现有技术中的发泡法、模版法、铸造法等具有明显更大的优势；具体地，在采用非激光烧结技术制备本发明所述的多孔软骨支架时无法精确控制多孔支架的孔隙结构。
所述任选含有士的宁是指：本发明的用于多孔软骨支架的微球中可以含有士的宁，也可以不含有士的宁。当含有士的宁时，所述马钱子碱和任选含有的士的宁的总含量是指马钱子碱和士的宁的含量之和；当不含有士的宁时，所述马钱子碱和任选含有的士的宁的总含量是指马钱子碱的含量。
本发明优选所述用于多孔软骨支架的微球中含有士的宁。根据本发明的一种优选的具体实施方式，本发明的所述用于多孔软骨支架的微球中包括同时含有马钱子碱和士的宁的马钱子总生物碱。具体地，所述马钱子总生物碱包括士的宁、马钱子碱、伪番木鳖碱、伪马钱子碱、异番木鳖碱、番木鳖次碱、马钱子新碱和依卡精中的至少一种。
优选情况下，在本发明的用于多孔软骨支架的微球中，当含有士的宁时，所述马钱子碱和士的宁的含量重量比为1-2：1。
所述马钱子碱和士的宁可以通过商购得到，也可以通过自制提取得到。
优选地，以所述用于多孔软骨支架的微球的总重量为基准，所述马钱子碱与任选的含有的士的宁的总含量为1-3重量％。
优选地，在所述用于多孔软骨支架的微球中，相对于100重量份的聚乳酸羟基乙酸，所述聚乙烯醇的含量为10-35重量份，所述壳聚糖的含量为40-65重量份。更加优选情况下，在所述用于多孔软骨支架的微球中，相对于100重量份的聚乳酸羟基乙酸，所述聚乙烯醇的含量为18-22重量份，所述壳聚糖的含量为48-52重量份。本发明的发明人在研究中发现，控制本发明的组合物中的聚乙烯醇和壳聚糖的含量在上述范围内时，能够使得由本发明的方法制备得到的多孔软骨支架时具有更适宜的降解速度。
优选情况下，在本发明中，所述微球的平均粒径为1-50微米；更加优选情况下，在本发明中，所述微球的平均粒径为1-10微米。
优选情况下，本发明的前述方法包括：
(1)制备用于多孔软骨支架的微球：
1)在溶剂存在下，将马钱子碱与聚乳酸羟基乙酸进行第一接触，得到溶液I；
2)将步骤1)得到的所述溶液I与含有聚乙烯醇的溶液II进行第二接触，得到溶液III；
3)将步骤2)得到的所述溶液III与含有壳聚糖的溶液IV进行第三接触；
(2)制备多孔软骨支架：
将步骤(1)得到的用于多孔软骨支架的微球进行激光烧结。
优选地，所述激光烧结的条件包括：激光功率为2.0-3.0W，扫描速度为800-1000mm/min，扫描间距为0.4-0.8mm，光斑直径为0.2-0.4mm，粉床预热温度为40-45℃。
优选地，在步骤(1)中，所述第一接触的条件包括：温度为零下20℃至零上10℃，时间为0.1-8h。控制所述第一接触的温度为零下20℃至零上10℃时有利于载药颗粒的析出。
为了更加有利于形成含有马钱子碱以及任选含有的士的宁的均一溶液，本发明优选先将马钱子碱以及任选含有的士的宁与能够溶解该马钱子碱以及任选含有的士的宁的溶剂例如乙醇等进行混合，更加优选情况下，还可以在搅拌和/或超声条件下加速马钱子碱或者以及士的宁在溶剂中的溶解速率。
在步骤(1)中，所述溶剂为能够溶解所述马钱子碱和/或所述聚乳酸羟基乙酸的溶剂。优选情况下，溶解所述马钱子碱的溶剂可以为乙醇，溶解所述聚乳酸羟基乙酸的溶剂例如可以为二氯甲烷。
优选地，在步骤(1)中，所述第二接触在超声存在下进行，所述超声的条件包括：功率为5-15W，时间为0.2-6h。
所述溶液II可以为能够溶解聚乙烯醇的溶剂与所述聚乙烯醇形成的混合物，优选地，能够溶解聚乙烯醇的溶剂例如可以为水。
优选地，在步骤(1)中，所述第三接触在搅拌下进行，所述搅拌的条件包括：转速为200-4000rpm，时间为1-10h。
优选地，本发明的方法还包括将所述第三接触后得到的微球前体依次进行干燥和粉碎。进一步优选地，所述干燥在不高于60℃下进行，以及所述干燥的时间可以为1-24h。
优选地，在本发明中，所述粉碎可以采用球磨法进行，对球磨法进行粉碎的具体操作条件没有特别的限定，可以为本领域常规的各种操作方法，例如可以在氧化锆球存在下进行球磨，优选所述氧化锆球与微球前体的用量体积比为1.2-5：1。
根据一种更加优选的具体实施方式，本发明的制备多孔软骨支架的方法包括以下步骤：
(1)将含有马钱子碱和任选含有的士的宁的乙醇溶液与含有聚乳酸羟基乙酸的二氯甲烷溶液在温度为零下20℃至零上10℃条件下第一接触0.1-8h，得到溶液I；
(2)将步骤(1)得到的所述溶液I与含有聚乙烯醇的水溶液II进行在功率为5-15W的条件下超声0.2-6h，得到溶液III；
(3)将步骤(2)得到的所述溶液III与含有壳聚糖和聚乙烯醇的水溶液IV在转速为200-4000rpm的搅拌下接触1-10h；
(4)将经过步骤(3)得到的微球前体依次进行干燥和粉碎；
(5)将步骤(4)得到的用于多孔软骨支架的微球进行激光烧结。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
在没有特别说明的情况下，以下使用的各种原料均来自商购。
马钱子碱和士的宁均购自中国食品药品检定研究院。
制备例1-3用于制备用于多孔软骨支架的微球。
实施例1-6用于说明本发明的制备多孔软骨支架的方法。
制备例1
将1mg马钱子总生物碱(也称为马钱子总碱，其中，马钱子碱的含量为0.512mg，士的宁的含量为0.453mg)和1mL的乙醇置于2mL的EP管中，超声振动使之溶解，得到含有马钱子总碱的溶液1，备用；
将2mg的PLGA固体置于2mL的EP管中，加入1mL二氯甲烷使之完全溶解，得到含有聚乳酸羟基乙酸的二氯甲烷溶液2，备用；
将1mg的壳聚糖置于20mg的1重量％的PVA水溶液中，超声振动使之溶解，得到溶液IV，备用；
(1)取100微升溶液1与全部的溶液2在零下4℃混合并保持20min，得到溶液I；
(2)将在零下4℃超声5min(功率为5W)的溶液I与20mg的1重量％的PVA水溶液II在零下4℃混合并超声60min(功率为10W)，得到溶液III；
(3)将所述溶液III与溶液IV在转速为1000rpm的搅拌下接触4h，接触的温度为25℃，并在接触后用去离子水离心洗涤4次，得到微球前体；
(4)将所述微球前体在45℃下干燥15h，然后置于高能纳米球磨机中进行干法球磨处理，处理的条件为：球磨介质为氧化锆球(直径8mm)，球料体积比为2：1，控制球磨粉碎的温度在30℃以下，得到微球W1。
结果：经粒度仪测得所述微球W1的平均粒径在1-10微米之间的微球的重量占获得的全部微球重量的96.6％。
对比制备例1
本对比制备例采用与制备例1相似的方法进行，所不同的是：
本对比制备例制备微球的过程中不使用壳聚糖，也就是说，所述溶液IV中不含有壳聚糖，其余均与制备例1中相同。
得到微球D-W1。
结果：经粒度仪测得所述微球D-W1的平均粒径在1-10微米之间的微球的重量占获得的全部微球重量的45.3％。
制备例2
将0.8mg马钱子碱和1mL的乙醇置于2mL的EP管中，超声振动使之溶解，得到含有马钱子碱的溶液1，备用；
将2.5mg的PLGA固体置于2mL的EP管中，加入1mL二氯甲烷使之完全溶解，得到含有聚乳酸羟基乙酸的二氯甲烷溶液2，备用；
将1.2mg的壳聚糖置于25mg的1重量％的PVA水溶液中，超声振动使之溶解，得到溶液IV，备用；
(1)取100微升溶液1与全部的溶液2在零下8℃混合并保持20min，得到溶液I；
(2)将在零下8℃超声10min(功率为5W)的溶液I与20mg的1重量％的PVA水溶液II在零下8℃混合并超声80min(功率为8W)，得到溶液III；
(3)将所述溶液III与溶液IV在转速为1500rpm的搅拌下接触3.5h，接触的温度为25℃，并在接触后用去离子水离心洗涤4次，得到微球前体；
(4)将所述微球前体在45℃下干燥18h，然后置于高能纳米球磨机中进行干法球磨处理，处理的条件为：球磨介质为氧化锆球(直径8mm)，球料体积比为2：1，控制球磨粉碎的温度在30℃以下，得到微球W2。
结果：经粒度仪测得所述微球W2的平均粒径在1-10微米之间的微球的重量占获得的全部微球重量的96.9％。
对比制备例2
本对比制备例采用与制备例2相似的方法进行，所不同的是：
本对比制备例制备微球的过程中使用士的宁代替马钱子碱，其余均与制备例2中相同。
得到微球D-W2。
结果：经粒度仪测得所述微球D-W2的平均粒径在1-10微米之间的微球的重量占获得的全部微球重量的96.7％。
制备例3
将0.4mg马钱子碱和0.3mg士的宁与1mL的乙醇置于2mL的EP管中，超声振动使之溶解，得到含有马钱子碱和士的宁的溶液1，备用；
将1.8mg的PLGA固体置于2mL的EP管中，加入1mL二氯甲烷使之完全溶解，得到含有聚乳酸羟基乙酸的二氯甲烷溶液2，备用；
将0.93mg的壳聚糖置于20mg的1重量％的PVA水溶液中，超声振动使之溶解，得到溶液IV，备用；
(1)取100微升溶液1与全部的溶液2在0℃混合并保持30min，得到溶液I；
(2)将在0℃超声10min(功率为5W)的溶液I与18mg的1重量％的PVA水溶液II在0℃混合并超声100min(功率为5W)，得到溶液III；
(3)将所述溶液III与溶液IV在转速为2000rpm的搅拌下接触3h，接触的温度为25℃，并在接触后用去离子水离心洗涤4次，得到微球前体；
(4)将所述微球前体在45℃下干燥15h，然后置于高能纳米球磨机中进行干法球磨处理，处理的条件为：球磨介质为氧化锆球(直径8mm)，球料体积比为2：1，控制球磨粉碎的温度在30℃以下，得到微球W3。
结果：经粒度仪测得所述微球W3的平均粒径在1-10微米之间的微球的重量占获得的全部微球重量的96.2％。
对比制备例3
本对比制备例采用与制备例3相似的方法进行，所不同的是：
本对比制备例制备微球的过程中使用1毫升溶液1与全部的溶液2在0℃混合，其余均与制备例3中相同。
得到微球D-W3。
结果：经粒度仪测得所述微球D-W3的平均粒径在1-10微米之间的微球的重量占获得的全部微球重量的90.2％。
实施例1
分别取制备例1-3以及对比制备例1-3中得到的微球置于选择性激光烧结系统中进行激光烧结，烧结完成后利用压缩空气去除未烧结的粉末，得到所需的多孔软骨支架的三维实体，其中，激光烧结的工艺条件为：激光功率为2.5W，扫描速度为1000mm/min，扫描间距为0.6mm，光斑直径为0.4mm，粉床预热温度为42℃。
由制备例1-3的微球制备得到的多孔软骨支架分别为1-G1、1-G2和1-G3；
由对比制备例1-3的微球制备得到的多孔软骨支架分别为1-DG1、1-DG2和1-DG3。
实施例2
分别取制备例1-3以及对比制备例1-3中得到的微球置于选择性激光烧结系统中进行激光烧结，烧结完成后利用压缩空气去除未烧结的粉末，得到所需的多孔软骨支架的三维实体，其中，激光烧结的工艺条件为：激光功率为2.2W，扫描速度为1000mm/min，扫描间距为0.4mm，光斑直径为0.3mm，粉床预热温度为40℃。
由制备例1-3的微球制备得到的多孔软骨支架分别为2-G1、2-G2和2-G3；
由对比制备例1-3的微球制备得到的多孔软骨支架分别为2-DG1、2-DG2和2-DG3。
实施例3
分别取制备例1-3以及对比制备例1-3中得到的微球置于选择性激光烧结系统中进行激光烧结，烧结完成后利用压缩空气去除未烧结的粉末，得到所需的多孔软骨支架的三维实体，其中，激光烧结的工艺条件为：激光功率为2.8W，扫描速度为800mm/min，扫描间距为0.7mm，光斑直径为0.2mm，粉床预热温度为45℃。
由制备例1-3的微球制备得到的多孔软骨支架分别为3-G1、3-G2和3-G3；
由对比制备例1-3的微球制备得到的多孔软骨支架分别为3-DG1、3-DG2和3-DG3。
测试例1
本测试例用于评价由前述实施例制备得到的多孔软骨支架的体外释放情况。具体地，本测试例采用如下方法进行：
模拟药物在体内扩散代谢，采用动态浸泡方法，以10mL生理盐水装入试管中作为释放介质，用细金属丝将多孔软骨支架(缓释体系)悬置于释放介质中，试管置于37±0.5℃的恒温水浴中，隔天定时取出释放溶液，并及时更换新鲜生理盐水10mL，共释放50天。
各个多孔软骨支架平行进行3组实验，取样编号、取平均值并记录多孔软骨支架中马钱子碱(若不含马钱子碱则用士的宁替代)每天的释放量。
其中，各个多孔软骨支架在第10、20、30、40和50天时马钱子碱(若不含马钱子碱则用士的宁替代，下同)的累积释放度(释放量与原含量的重量百分比)如表1中所示，且各个多孔软骨支架中马钱子碱的释放量通过采用HPLC测试释放溶液中马钱子碱的浓度而确定。
从表1中可以看出：
由本发明的制备例1-3中的微球制备得到的多孔软骨支架均具有适宜的体外释放速率；而由对比制备例1的微球制备得到的多孔软骨支架的体外释放速率过慢，在50天之内的释放量小于10％，这并不能达到治疗的目的。
表1
多孔软骨支架 第10天 第20天 第30天 第40天 第50天
1-G1 5.23％ 11.62％ 17.69％ 24.68％ 32.45％
1-G2 5.14％ 11.25％ 16.99％ 23.87％ 31.58％
1-G3 5.42％ 11.51％ 17.59％ 24.57％ 32.55％
1-DG1 0 0.98％ 1.87％ 3.69％ 7.86％
1-DG2 4.99％ 10.26％ 15.89％ 21.33％ 28.69％
1-DG3 5.63％ 11.64％ 19.69％ 30.21％ 39.68％
2-G1 5.54％ 11.83％ 17.92％ 24.87％ 32.71％
2-G2 5.26％ 11.39％ 17.10％ 24.00％ 31.70％
2-G3 5.26％ 11.34％ 17.37％ 24.32％ 32.30％
2-DG1 0 0.79％ 1.96％ 3.99％ 8.36％
2-DG2 5.06％ 10.56％ 16.30％ 22.06％ 28.94％
2-DG3 5.55％ 11.51％ 19.60％ 30.14％ 39.49％
3-G1 5.01％ 11.47％ 17.43％ 24.42％ 32.22％
3-G2 5.21％ 11.32％ 17.08％ 23.98％ 31.69％
3-G3 5.56％ 11.68％ 17.73％ 24.70％ 32.72％
3-DG1 0 0.86％ 2.03％ 4.12％ 9.02％
3-DG2 4.85％ 10.01％ 15.56％ 21.09％ 28.46％
3-DG3 5.71％ 11.70％ 19.75％ 30.31％ 39.74％
测试例2
本测试例用于评价由前述实施例1制备得到的多孔软骨支架的生物相容性。具体地，本测试例采用如下方法进行：
取105只大鼠(由长沙市开福区东创实验动物科技服务部提供)，随机分成7组，其中1组为空白对照组，其余各组分别为1-G1、1-G2和1-G3以及1-DG1、1-DG2和1-DG3的实验组；10mg/L水合氯醛腹腔注射麻醉各组大鼠，无菌经左股后切开，分离股后肌成袋状为植骨模型。分别将多孔软骨支架切割成边长约3mm立方体小块，环氧乙烷灭菌处理后植入肌袋内，分别于手术后5天、10天、15天于各组中处死5只大鼠，将植入材料连同周围肌肉组织取出，经固定、脱钙、包埋、切片后进行HE染色，光镜下观察，各组结果如表2中所示。
从表2的结果可以看出：由本发明的制备例1-3中的微球制备得到的多孔软骨支架生物相容性好，未出现病理情况；而采用对比制备例1-3中的微球制备得到的多孔软骨支架的生物相容性差，且均出现细胞染色不均、肿胀、横纹减少或消失，甚至出现明显细胞坏死的情况。
表2
测试例3
本测试例用于评价由前述实施例制备得到的多孔软骨支架的孔隙率情况。具体地，本测试例采用如下方法进行：
使用GB/T1966-1996标准的多孔陶瓷显气孔率、容重实验方法测试上述实施例1-3制备得到的多孔软骨支架的孔隙率，测量数据如表3中所示，孔隙率通过计算而得。
从表3的结果可以看出：由本发明的制备例1-3中的微球制备得到的多孔软骨支架的孔隙率适中，且均在75-85％之间；而由对比制备例1和对比制备例3中的微球制备得到的多孔软骨支架的孔隙率均较低，特别是由对比制备例1的微球制备得到的多孔软骨支架的孔隙率仅为35-40％。
这说明，由本发明的制备例1-3中的微球制备得到的多孔软骨支架的内部通孔状态良好。通过扫描电镜图片观察能够看出，由本发明的制备例1-3中的微球制备得到的多孔软骨支架中的空隙之间均在120-240微米之间。因此，本发明的多孔软骨支架能够为体内软骨细胞的长入提供良好的通道环境，适合进行体内的植入修复。
测试例4
本测试例用于评价多孔软骨支架的体外生物相容性。具体地，本测试例采用如下方法进行：
采用陈晓东等(福建中医学院学报，2006.12，第16卷(6)，27-29)公开的方法培养大鼠关节软骨细胞至第三代；
将实施例1-3和对比例1-3中得到的多孔软骨支架放入24孔板内并加入数量1×105第三代软骨细胞制成的悬浮液置于37℃含5％的CO2培养箱中培养，分别于培养5天后取出一组材料，用2％戊二醛固定，临界点干燥、喷金，于环境扫描电子显微镜下观察细胞在材料上的黏附和生长情况。
结果：由制备例1-3的微球制备得到的多孔软骨支架上均可见多个细胞黏附，有细胞触角生成；而由对比制备例1-3制备得到的多孔软骨支架上并没有发现细胞黏附。具体地，图1(SEM图)示出了细胞在由制备例1的微球制备得到的多孔软骨支架(实施例1中所得)上的黏附和生长情况；图2(SEM图)示出了细胞在由对比制备例1的微球制备得到的多孔软骨支架(实施例1中所得)上的黏附和生长情况。
从图1和图2中可以看出由本发明的微球制备得到的多孔软骨支架较现有技术的方法获得的软骨支架的体外生物相容性好。
测试例5
本测试例用于评价多孔软骨支架的体外细胞增殖效果。具体地，本测试例采用如下方法进行：
将已消毒好的由实施例1-3和对比例1-3的3D打印软骨支架分别置入24孔板，每孔支架滴加200μL的DMEM，培养箱内预湿过夜，取生长状态良好的第二代软骨细胞，制备成浓度为1×107/mL单细胞悬液，微量移液器以1×106个/100μL接种到支架表面，2h后加入含10％胎牛血清的DMEM培养液，培养液稍浸没支架，放入37℃、5％的CO2培养箱进行细胞培养，每两天更换培养液1次。5天后，吸出培养液，无菌PBS清洗软骨细胞-支架复合物，去除未贴壁细胞，将软骨细胞-支架复合物转入新的24孔板，加入800μL无血清DMEM培养液和80μL的MTT溶液并在培养箱中孵育4h，直接加入溶解液800μL培养箱孵育过夜(参照MTT试剂盒说明书，无需去除原有培养液)，使紫色结晶物充分溶解，吸取200μL到96孔板中，酶标仪检测其在492nm处的吸光度，以200μL结晶溶解液作为空白对照孔，每组进行3次平行实验。统计学处理，采用SPSS 17.0统计软件，数据用表示，比较采用单因素方差分析，P＜0.05差异有统计学意义。结果如表3中所示。
由表3中的数据可以看出：本发明的含有马钱子碱的多孔软骨支架有利于软骨细胞的增殖，从而有利于损伤软骨的修复。
表3
多孔软骨支架 孔隙率/％ 细胞增殖OD值
对照组 - 0.1963±0.0075
1-G1 78.6 0.3410±0.0085
1-G2 78.9 0.3500±0.0073
1-G3 78.5 0.3440±0.0023
1-DG1 36.5 0.0610±0.0153<sup>*</sup>
1-DG2 76.2 0.1110±0.0123<sup>*</sup>
1-DG3 56.9 0.2163±0.0356<sup>*</sup>
2-G1 79.3 0.3423±0.0015
2-G2 79.1 0.3512±0.0051
2-G3 79.3 0.3425±0.0005
2-DG1 36.9 0.0622±0.0178<sup>*</sup>
2-DG2 76.8 0.1145±0.0168<sup>*</sup>
2-DG3 57.2 0.2178±0.0305<sup>*</sup>
3-G1 81.0 0.3401±0.0036
3-G2 81.3 0.3486±0.0055
3-G3 81.7 0.3456±0.0045
3-DG1 37.2 0.0603±0.0189<sup>*</sup>
3-DG2 76.9 0.1131±0.0157<sup>*</sup>
3-DG3 57.5 0.2171±0.0301<sup>*</sup>
*表示与正常组相比较，P<0.05。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种制备多孔软骨支架的方法，该方法包括：将用于多孔软骨支架的微球进行激光烧结，所述用于多孔软骨支架的微球中含有聚乳酸羟基乙酸、马钱子碱、聚乙烯醇、壳聚糖以及任选含有士的宁，且以所述用于多孔软骨支架的微球的总重量为基准，所述马钱子碱与任选含有的士的宁的总含量为0.1-10重量％，且所述微球的平均粒径为1-80微米，在所述用于多孔软骨支架的微球中，相对于100重量份的聚乳酸羟基乙酸，所述聚乙烯醇的含量为10-35重量份，所述壳聚糖的含量为40-65重量份。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，以所述用于多孔软骨支架的微球的总重量为基准，所述马钱子碱与任选含有的士的宁的总含量为1-5重量％。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，以所述用于多孔软骨支架的微球的总重量为基准，所述马钱子碱与任选含有的士的宁的总含量为1-3重量％。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，在所述用于多孔软骨支架的微球中，相对于100重量份的聚乳酸羟基乙酸，所述聚乙烯醇的含量为18-22重量份，所述壳聚糖的含量为48-52重量份。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，该方法包括：
(1)制备用于多孔软骨支架的微球：
1)在溶剂存在下，将马钱子碱与聚乳酸羟基乙酸进行第一接触，得到溶液I；
2)将步骤1)得到的所述溶液I与含有聚乙烯醇的溶液II进行第二接触，得到溶液III；
3)将步骤2)得到的所述溶液III与含有壳聚糖的溶液IV进行第三接触；
(2)制备多孔软骨支架：
将步骤(1)得到的用于多孔软骨支架的微球进行激光烧结。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述激光烧结的条件包括：激光功率为2.0-3.0W，扫描速度为800-1000mm/min，扫描间距为0.4-0.8mm，光斑直径为0.2-0.4mm，粉床预热温度为40-45℃。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述激光烧结的条件包括：激光功率为2.0-3.0W，扫描速度为800-1000mm/min，扫描间距为0.4-0.8mm，光斑直径为0.2-0.4mm，粉床预热温度为40-45℃。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述第一接触的条件包括：温度为零下20℃至零上10℃，时间为0.1-8h。
9.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述第二接触在超声存在下进行，所述超声的条件包括：功率为5-15W，时间为0.2-6h。
10.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述第三接触在搅拌下进行，所述搅拌的条件包括：转速为200-4000rpm，时间为1-10h。
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