CN109330743B

CN109330743B - 一种3d打印组织工程支架及其制备方法

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Publication number: CN109330743B
Application number: CN201811104332.9A
Authority: CN
Inventors: 杨高洁; 李晓云; 吴苏州; 陈明惠
Original assignee: Shenzhen Jinglai New Material Technology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Jinglai New Material Technology Co ltd
Priority date: 2018-09-21
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2038-09-21
Also published as: CN109330743A

Abstract

本发明公开一种3D打印组织工程支架及其制备方法。所述3D打印组织工程支架为采用选择性激光烧结快速成型技术将钙磷活性生物材料含量梯度变化的人造高分子‑水凝胶复合微球按照设计的三维模型进行逐层烧结而获得的多孔层叠结构，所述人造高分子‑水凝胶复合微球为含KGN的水凝胶微球外包裹有人造医用高分子材料和钙磷活性生物材料，或者含KGN的水凝胶微球外包裹有人造医用高分子材料。所述3D打印组织工程支架通过将KGN包载在水凝胶微球中，且同时在该水凝胶微球的表面包裹钙磷活性生物材料和人造高分子材料，通过表面人造高分子材料和水凝胶的缓慢降解，实现了KGN在体内长时间的缓释，从而更可控地促进骨、软骨组织修复。

Description

一种3D打印组织工程支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其是一种3D打印组织工程支架及其制备方法。

背景技术

选择性激光烧结是一种通过红外激光器作能源，在计算机控制下根据分层截面信息，将粉末造型材料利用激光束进行有选择地烧结并层层堆积成型的3D打印技术。该类成型方法工艺简单、应用材料范围广、成型速度快、易于控制、稳定性和精确性高，可应用于医用材料和组织工程支架的加工，尤其适用于骨/软骨组织工程支架的个性化制备。

关节软骨结构复杂，其包括浅表层、过渡层、辐射层和钙化层等多级叠层结构。在空间架构上，不同层表现出与其关节软骨相适应的生物力学；在成分组成上，具有不同层级呈现有机/无机含量梯度变化的规律。软骨层主要由透明质酸和硫酸软骨素等多糖组成，过渡层、辐射层中钙磷盐逐渐增加，而钙化层则高度钙化，钙磷成分与软骨下骨的骨质相似。因此，理想的骨软骨的综合性缺损修复组织工程支架，需要对应机体骨软骨的不同层级结构而具备不同的力学性能和材料组分。为了构建这种多级复杂结构的叠层支架，选择性激光烧结技术是这类支架很好的加工成型手段。

然而，目前基于选择性激光烧结技术的多孔支架难以加载生长因子，并且难以实现水凝胶材料和医用高分子材料的一次成型，以及生长因子和水凝胶的缓释。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种加载生长因子的3D打印组织工程支架。

为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：该3D打印组织工程支架包括钙磷活性生物材料含量呈逐层梯度变化的多孔层叠结构，所述多孔层叠结构由人造医用高分子-水凝胶复合微球通过选择性激光烧结制成，所述人造医用高分子-水凝胶复合微球为含KGN的水凝胶微球外包裹有钙磷活性生物材料和人造医用高分子材料，或者含KGN的水凝胶微球外包裹有人造医用高分子材料。

另外，本发明还提供所要求保护的3D打印组织工程支架的制备方法，其包括以下步骤：

S1：制备钙磷活性生物材料含量梯度变化的人造医用高分子-水凝胶复合微球系列：合成含KGN的水凝胶微球，在所述水凝胶微球外部包裹不同含量的钙磷活性生物材料和人造医用高分子材料，得到人造医用高分子-水凝胶复合微球；

S2：通过软件建模设计多孔多层级结构的三维模型；

S3：利用选择性激光烧结快速成型技术，将所述人造医用高分子-水凝胶复合微球系列按照所述三维模型进行逐层烧结，获得钙磷活性生物材料含量呈逐层梯度变化的多孔层叠结构。

与现有技术相比，本发明具有下述有益效果：(1)本发明中通过激光烧结法可以个性化3D打印出不同层级结构、不同孔隙率、以及不同力学强度并一次成型的多孔支架，并且力学性能良好，结构上利于营养物质运输、组织和血管长入。(2)本发明所述制备方法获得的3D打印多孔支架，可模拟缺损部位的不同空间层结构和成分，并且可通过对支架物料组分和含量的精确调控，为缺损部位提供不同组分的水凝胶以及梯度含量钙磷活性生物材料的机体细胞外环境，分别对应机体内的软骨层、钙化软骨层、软骨下骨层的结构力学和物质组分，因此具有不同层级有不同促进骨或者软骨愈合的能力。(3)本发明所述3D打印组织工程支架以人造医用高分子材料包裹含KGN的水凝胶微球而形成的人造医用高分子-水凝胶复合微球为原料，不但解决了以往单纯医用高分子材料难以加载生长因子、单纯水凝胶材料强度低且降解过快等难题，而且通过含KGN的水凝胶微球的表面的人造医用高分子材料在体内的降解以及水凝胶包载，实现了KGN在体内长时间的缓释，从而更可控地促进骨、软骨组织修复。

附图说明

图1为本发明的一实施例提供3D打印组织工程支架中浅层的扫描电镜图；

图2为本发明的一实施例提供3D打印组织工程支架中过渡层的扫描电镜图。

具体实施方式

本发明主要针对基于选择性激光烧结技术的多孔支架难以加载生长因子的问题提供一种解决方案。

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。本发明不限定于以下实施方式，在不脱离发明范围内，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

本发明所述3D打印组织工程支架包括钙磷活性生物材料含量呈逐层梯度变化的多孔层叠结构，所述多孔层叠结构由人造医用高分子-水凝胶复合微球通过选择性激光烧结制成，所述人造医用高分子-水凝胶复合微球为含KGN的水凝胶微球外包裹有钙磷活性生物材料和人造医用高分子材料，或者含KGN的水凝胶微球外包裹有人造医用高分子材料。

本发明所述3D打印组织工程支架包括多孔层叠结构，通过调节所述多孔层叠结构中各层的物料组成和含量，可模拟缺损部位的不同空间层结构和成分；同时，在该多孔层叠结构中，钙磷活性生物材料含量呈逐层梯度变化，可分别对应机体内软骨层、钙化软骨层、软骨下骨层的结构力学和物质组分，因此具有不同层级有不同促进骨或者软骨愈合的能力；进一步，所述多孔层叠结构是由人造医用高分子-水凝胶复合微球通过选择性激光烧结制成，所述选择性激光烧结可以个性化3D打印出不同层级结构、不同孔隙率、以及不同力学强度并一次成型的多孔支架，并且力学性能良好，结构上利于营养物质运输、组织和血管长入；通常所述水凝胶微球的强度低，然而本发明通过在水凝胶微球外部包裹钙磷活性生物材料和人造医用高分子材料或者仅包裹人造医用高分子材料，从而形成人造医用高分子-水凝胶复合微球，所述人造医用高分子-水凝胶复合微球具有较高的强度，并且，还可以通过调节包裹在所述水凝胶微球外的钙磷活性生物材料和人造医用高分子材料的组成和含量来调节所述人造医用高分子-水凝胶复合微球的强度，进而调节多孔层叠结构中不同层的强度；更进一步，所述水凝胶微球为含KGN的水凝胶微球，通过利用水凝胶来负载所述KGN，从而解决了单纯医用高分子材料难以加载生长因子的难题，另外，将所述水凝胶微球制成所述人造医用高分子-水凝胶复合微球，使得所述KGN在体内的释放受所述人造医用高分子-水凝胶复合微球中人造医用高分子材料在体内的降解的影响，从而实现所述KGN在体内长时间的缓释，从而更可控地促进骨、软骨组织修复。

通常，间充质干细胞(MSC,mesenchymal stem cells)是一种干细胞，能够分化成不同的细胞类型，包括软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞和肌细胞。所述KGN(即kartogenin)作为一种小分子化合物，其能选择性诱导干细胞分化为软骨细胞而促进软骨的产生，同时可抑制软骨细胞的肥大分化，并且在动物体内所述KGN还能引发干细胞的归巢行为。

所述钙磷活性生物材料可以为羟基磷灰石、磷酸三钙、磷酸四钙等中的至少一种。优选所述钙磷活性生物材料为羟基磷灰石。

所述水凝胶微球可以由壳聚糖、胶原、透明质酸钠、硫酸软骨素等中的至少一种制成。优选所述水凝胶微球由胶原、透明质酸钠、硫酸软骨素中的至少一种制成。

所述人造医用高分子材料可以为聚己内酯、聚酰胺、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基乙酸等中的至少一种。优选所述人造医用高分子材料为聚己内酯，在所述人造医用高分子-水凝胶复合微球中所述聚己内酯与所述水凝胶微球的质量比为4:1～1:1。

进一步，所述多孔层叠结构设置为包括三层，分别为浅层、过渡层和底层。在所述多孔层叠结构中，各层之间相互连接，即所述浅层与所述过渡层连接，所述过渡层与所述底层连接。详细地，构成所述浅层的人造医用高分子-水凝胶复合微球至少包括10-30％(wt)的透明质酸钠，10-30％(wt)的硫酸软骨素，60-70％(wt)的聚己内酯，0-2％(wt)的羟基磷灰石；构成所述过渡层的人造医用高分子-水凝胶复合微球至少包括5-10％(wt)的透明质酸钠，5-10％(wt)的硫酸软骨素，10-20％(wt)的胶原，70-80％(wt)的聚己内酯，2-10％(wt)的羟基磷灰石；构成所述底层中的人造医用高分子-水凝胶复合微球至少包括20-30％(wt)的胶原，40-70％(wt)的聚己内酯，10-30％(wt)的羟基磷灰石。所述浅层、所述过渡层和所述底层分别对应机体内软骨层、钙化软骨层、软骨下骨层的结构力学和物质组分，因此具有不同层级有不同促进骨或者软骨愈合的能力。更详细地，所述浅层的孔隙率为70-90％，厚度为1.5-3mm；所述过渡层的孔隙率为60-80％，厚度为2-4mm；所述底层的孔隙率为30-40％，厚度为0.5-1mm。可以看出，不同层具有不同的厚度和不一样的孔隙率，结构上利于营养物质运输、组织和血管长入。

本发明还提供所要求保护的3D打印组织工程支架的制备方法，其包括以下步骤：

S2：通过软件建模设计多孔多层级结构的三维模型；

S3：利用选择性激光烧结快速成型技术，将所述人造医用高分子-水凝胶复合微球系列按照所述模型进行逐层烧结，获得钙磷活性生物材料含量呈逐层梯度变化的多孔层叠结构。

以下对所述3D打印组织工程支架的制备方法进行详细说明。

具体地，执行步骤S1：制备所述人造医用高分子-水凝胶复合微球。而制备所述人造医用高分子-水凝胶复合微球又包括两步：第一步，制备含KGN的水凝胶微球；第二步，在所述水凝胶微球外部包裹人造医用高分子材料和不同含量的钙磷活性生物材料，得到人造医用高分子-水凝胶复合微球。在所述人造医用高分子-水凝胶复合微球中，所述钙磷活性生物材料的含量可以大于零，也可以等于零，即在所述人造医用高分子-水凝胶复合微球可以含有所述钙磷活性生物材料，也可以不含有所述钙磷活性生物材料。

更具体地，所述第一步包括：将KGN加入到水凝胶溶液中，所述水凝胶溶液含有壳聚糖、胶原、透明质酸钠、硫酸软骨素等中的至少一种，所述水凝胶溶液的浓度为10～20mg/L，所述KGN在所述水凝胶溶液中的浓度为0.01-0.1％(wt)；接下来加入交联剂，所述交联剂优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在所述水凝胶溶液中的浓度为1.01mol/L，所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺在所述水凝胶溶液中的浓度为1mol/L；进一步，在搅拌下逐渐滴加2-3倍体积的丙酮溶液，制备成乳液，所述搅拌为650rpm转速的磁力搅拌；更进一步，固化得到含KGN的水凝胶微球，使用去离子水多次离心清洗所述水凝胶微球。

所述第二步包括：将清洗后得到的水凝胶微球分散于丙酮溶液中以制备成水凝胶微球混悬液，所述丙酮溶液含有1-5％吐温80，所述水凝胶微球在所述水凝胶微球混悬液中的浓度优选为10mg/ml；接下来，将所述水凝胶微球混悬液加入到3倍体积的含有人造医用高分子材料、含有或者不含有钙磷活性生物材料的二氯甲烷溶液中，并超声分散形成S/O混合相；所述人造医用高分子材料可以为聚己内酯、聚酰胺、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基乙酸等中的至少一种；优选所述人造医用高分子材料为聚己内酯，所述二氯甲烷溶液中含有2％(wt)的聚己内酯；所述钙磷活性生物材料可以为羟基磷灰石、磷酸三钙、磷酸四钙等中的至少一种；优选所述钙磷活性生物材料为羟基磷灰石，所述二氯甲烷溶液中含有0～1％(wt)的羟基磷灰石；进一步，再在搅拌下逐步滴加10倍体积的聚乙烯醇水溶液，所述聚乙烯醇水溶液中聚乙烯醇的含量为2％(wt)，所述搅拌为1000rpm转速的磁力搅拌，所述聚乙烯醇水溶液可以使得溶解在二氯甲烷内的聚己内酯析出并形成包裹在水凝胶微球外的聚己内酯固体膜结构；更进一步，搅拌3h；再进一步，离心分离，离心过程中转速为4000rpm，使用去离子水多次水洗离心产物，过筛获得粒径为100-300μm的人造医用高分子-水凝胶复合微球。

执行步骤S2：通过软件建模设计多孔多层级结构的三维模型。所述三维模型可以是两层级结构，也可以三层级结构，还可以是四层级结构，在此不作限定。优选所述三维模型是三层级结构，所述三层级结构包括底层、过渡层和浅层。

执行步骤S3：利用选择性激光烧结快速成型技术，将所述人造医用高分子-水凝胶复合微球系列按照所述三维模型进行逐层烧结，获得钙磷活性生物材料含量呈逐层梯度变化的多孔层叠结构。需要说明的是，所述多孔层叠结构同时具有小尺寸的孔隙和大尺寸的孔隙，所述小尺寸的孔隙由人造医用高分子-水凝胶复合微球与人造医用高分子-水凝胶复合微球之间构筑，所述大尺寸的孔隙通过建模设计并激光烧结形成，其主要用于组织长入。

具体地，将所述三维模型的数据信息以STL文件输送到激光烧结设备中，按照设计好的激光烧结参数进行逐层加工，最终形成多孔和多层级精确结构的3D打印组织工程支架。具体地，所述激光烧结的参数为：激光功率为10-15W，激光束直径100-200μm，扫描速度为1000-1600mm/s，扫描间距为0.1-0.2mm，层厚度为0.1-0.15mm。

需要说明的是所述S1与所述S2的顺序不是必须的，即所述S1与所述S2的顺序可以调换。

以下根据实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不限定于此实施例。

实施例

S1：制备钙磷活性生物材料含量梯度变化的人造医用高分子-水凝胶复合微球系列。所述人造医用高分子-水凝胶复合微球系列指的是对应所述多孔层叠结构中不同层所使用的人造医用高分子-水凝胶复合微球。在本实施例中，所述多孔层叠结构优选设置为包括三层，分别为浅层、过渡层和底层。所述人造医用高分子-水凝胶复合微球系列包括浅层人造医用高分子-水凝胶复合微球、过渡层人造医用高分子-水凝胶复合微球和底层人造医用高分子-水凝胶复合微球。

首先制备所述浅层人造医用高分子-水凝胶复合微球，步骤包括：将KGN以0.01％(wt)的质量百分数加入至10mg/mL透明质酸钠、硫酸软骨素混合水凝胶溶液中，并加入1.01mol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1mol/L的N-羟基硫代琥珀酰亚胺后，在650rpm转速的磁力搅拌下逐渐滴加3倍体积的丙酮溶液，制备成乳液，待水凝胶微球固化后，用去离子水数次离心清洗；将清洗后的水凝胶微球以浓度10mg/ml分散于含有2％吐温80的丙酮溶液中，制备成水凝胶微球混悬液，将所述水凝胶微球混悬液加入到3倍体积含有2wt％的聚己内酯、的二氯甲烷溶液中，超声分散形成S/O混合相，再在1000rpm转速下逐步滴加10倍体积的2％(wt)的聚乙烯醇水溶液，搅拌3h，4000rpm离心，离心产物用去离子水洗3次，过筛获得粒径为100-300μm的人造医用高分子-水凝胶复合微球，即浅层人造医用高分子-水凝胶复合微球。

然后制备所述过渡层人造医用高分子-水凝胶复合微球，步骤包括：将KGN以0.03％(wt)的质量百分数加入至5mg/mL的胶原、5mg/mL透明质酸钠、5mg/mL硫酸软骨素的混合水凝胶溶液中，并加入1.01mol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1mol/L的N-羟基硫代琥珀酰亚胺后，在650rpm转速的磁力搅拌下逐渐滴加3倍体积的丙酮溶液，制备成乳液，待水凝胶微球固化后，用去离子水数次离心清洗；将清洗后的水凝胶微球以浓度10mg/ml分散于含有5％吐温80的丙酮溶液中，制备成水凝胶微球混悬液，将所述水凝胶微球混悬液加入到3倍体积含有2％(wt)的聚己内酯、0.5％(wt)的羟基磷灰石的二氯甲烷溶液中，超声分散形成S/O混合相，再在1000rpm转速下逐步滴加10倍体积的2％(wt)的聚乙烯醇水溶液，搅拌3h，4000rpm离心，离心产物用去离子水洗3次，过筛获得粒径为100-300μm的人造医用高分子-水凝胶复合微球，即过渡层人造医用高分子-水凝胶复合微球。

接下来制备所述底层人造医用高分子-水凝胶复合微球，步骤包括：将KGN以0.03％(wt)的质量百分数加入至6mg/mL的胶原水凝胶溶液中，并加入1.01mol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1mol/L的N-羟基硫代琥珀酰亚胺后，在650rpm转速的磁力搅拌下逐渐滴加3倍体积的丙酮溶液，制备成乳液，待水凝胶微球固化后，用去离子水数次离心清洗；将清洗后的水凝胶微球以浓度10mg/ml分散于含有5％吐温80的丙酮溶液中，制备成水凝胶微球混悬液，将所述水凝胶微球混悬液加入到3倍体积含有2％(wt)的聚己内酯、1.5％(wt)的羟基磷灰石的二氯甲烷溶液中，超声分散形成S/O混合相，再在1000rpm转速下逐步滴加10倍体积的2％(wt)的聚乙烯醇水溶液，搅拌3h，4000rpm离心，离心产物用去离子水洗3次，过筛获得粒径为100-300μm的人造医用高分子-水凝胶复合微球，即底层人造医用高分子-水凝胶复合微球。

需要说明的是制备所述浅层人造医用高分子-水凝胶复合微球、过渡层人造医用高分子-水凝胶复合微球和底层人造医用高分子-水凝胶复合微球的顺序并不是必须的。

S2：通过软件建模设计多孔且多层级结构的三维模型，所述三维模型包括浅层、过渡层和底层。

S3：将设计的三维模型的数据信息以STL文件输送到激光烧结设备中，进行逐层选择性激光烧结，最终形成包括浅层、过渡层和底层结构的3D打印组织工程支架。在进行激光烧结的过程中，可以先加工形成浅层，之后形成过渡层，最后形成底层；也可以先加工形成底层，之后形成过渡层，最后形成底层。

在本实施例中，先采用选择性激光烧结技术将所述底层人造医用高分子-水凝胶复合微球烧结成具有多孔结构的底层。在激光烧结形成所述底层的过程中，激光烧结参数为：激光功率为15W，激光束直径100μm，扫描速度为1000mm/s，扫描间距为0.1mm，单层厚度为0.15mm，总高度为0.5mm。接下来将所述过渡层人造医用高分子-水凝胶复合微球铺展在所述底层上，采用选择性激光烧结技术将所述过渡层人造医用高分子-水凝胶复合微球烧结成具有多孔结构的过渡层。在激光烧结形成所述过渡层的过程中，激光烧结参数为：激光功率为10W，激光束直径200μm，扫描速度为1500mm/s，扫描间距为0.2mm，单层厚度为0.15mm，总高度为2mm。然后再将所述浅层人造医用高分子-水凝胶复合微球铺展在所述过渡层上，采用选择性激光烧结技术将所述浅层人造医用高分子-水凝胶复合微球烧结成具有多孔结构的浅层。在激光烧结形成所述浅层的过程中，激光烧结参数为：激光功率为10W，激光束直径200μm，扫描速度为1500mm/s，扫描间距为0.2mm，单层厚度为0.15mm，总高度为1.5mm。

以上所述仅为本发明的一个实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims

1.一种3D打印组织工程支架，其特征在于，包括钙磷活性生物材料含量呈逐层梯度变化的多孔层叠结构，所述多孔层叠结构由人造医用高分子-水凝胶复合微球通过选择性激光烧结制成，所述人造医用高分子-水凝胶复合微球为含KGN的水凝胶微球外包裹有钙磷活性生物材料和人造医用高分子材料，或者含KGN的水凝胶微球外包裹有人造医用高分子材料；

所述多孔层叠结构包括浅层、过渡层和底层，各层之间相互连接；

所述浅层中的人造医用高分子-水凝胶复合微球包括10-30%（wt）的透明质酸钠，10-30%（wt）的硫酸软骨素，60-70%（wt）的聚己内酯，0-2%（wt）的羟基磷灰石；所述过渡层中的人造医用高分子-水凝胶复合微球包括5-10%（wt）的透明质酸钠，5-10%（wt）的硫酸软骨素，10-20%（wt）的胶原，70-80%（wt）的聚己内酯，2-10%（wt）的羟基磷灰石；所述底层中的人造医用高分子-水凝胶复合微球包括20-30%（wt）的胶原，40-70%（wt）的聚己内酯，10-30%（wt）的羟基磷灰石。

2.根据权利要求1所述的3D打印组织工程支架，其特征在于，所述浅层的孔隙率为70-90%，厚度为1.5-3mm；所述过渡层的孔隙率为60-80%，厚度为2-4mm；所述底层的孔隙率为30-40%，厚度为0.5-1mm。

3.根据权利要求1所述的3D打印组织工程支架，其特征在于，所述人造医用高分子-水凝胶复合微球的粒径为100-300μm。

4.一种根据权利要求1-3任一项所述的3D打印组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2：通过软件建模设计多孔多层级结构的三维模型；

5.根据权利要求4所述的3D打印组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述S1包括以下步骤：

S1a：将KGN加入至水凝胶溶液中，并加入交联剂，在搅拌下逐渐滴加丙酮溶液，制备成乳液，固化得到含KGN的水凝胶微球，清洗；

S1b：将清洗后得到的水凝胶微球分散于丙酮溶液中，制备成水凝胶微球混悬液；将所述水凝胶微球混悬液加入含有人造医用高分子材料、含有或者不含有钙磷活性生物材料的二氯甲烷溶液中，超声分散形成S/O混合相，再在搅拌下逐步滴加聚乙烯醇水溶液，搅拌、离心、水洗，获得人造医用高分子-水凝胶复合微球。

6.根据权利要求5所述的3D打印组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述S1包括以下步骤：

S1a：将KGN加入至浓度为10-20 mg/mL的含胶原、透明质酸钠、硫酸软骨素中的至少一种的水凝胶溶液中，并加入交联剂，在搅拌下逐渐滴加2-3倍体积的丙酮溶液，制备成乳液，固化得到含KGN的水凝胶微球，清洗；

S1b：将清洗后得到的水凝胶微球以浓度10 mg/ml分散于含有1-5%吐温80的丙酮溶液中，制备成水凝胶微球混悬液；将所述水凝胶微球混悬液加入到3倍体积的含有2%（wt）的聚己内酯、0~1%（wt）的羟基磷灰石的二氯甲烷溶液中，超声分散形成S/O混合相，再在搅拌下逐步滴加10倍体积的2%（wt）的聚乙烯醇水溶液，搅拌、离心、水洗、过筛，获得粒径为100-300μm的人造医用高分子-水凝胶复合微球。

7.根据权利要求5所述的3D打印组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述KGN在所述水凝胶溶液中的浓度为0.01-0.1%（wt）。

8.根据权利要求4所述的3D打印组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述激光烧结的参数为：激光功率为10-15 W，激光束直径100-200 μm，扫描速度为1000-1600 mm/s，扫描间距为0.1-0.2 mm，层厚度为0.1-0.15 mm。