CN105648074B - Fan1基因在ii型糖尿病诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了FAN1基因在II型糖尿病诊断中的应用，FAN1基因在II型糖尿病患者的血液中表达水平高于健康人血液的表达水平，通过检测患者血液中FAN1基因的表达水平，可以诊断患者是否患有糖尿病，从而实现患者的早期治疗。

Description

FAN1基因在II型糖尿病诊断中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及FAN1基因在II型糖尿病诊断中的应用。

背景技术

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。随着全球范围内人们生活水平的不断提高，糖尿病患病人数也迅速增加。世界卫生组织(WHO)估计到2030年，全世界糖尿病患者人数将超过3.5亿。由于糖尿病的发病率不断上升，其无法最终治愈的慢性病本质，以及与其并发症(包括但不限于心血管疾病，肾衰竭，癌症，失明，截肢)相关的严重的健康隐患，迫切需要有新的、有效的方法来评估或预测个体今后可能患有糖尿病的风险，以便可以采取预防性措施来预防或延迟这些个体中糖尿病的发生或降低糖尿病相关症状/风险的严重程度。

大多数糖尿病案例分成三大类：I型、II型和妊娠糖尿病。II型糖尿病比I型糖尿病更为常见，超过90％的糖尿病患者为II型糖尿病。后者与特征为肥胖和胰岛素抵抗(降低胰岛素敏感性)的现代病密切相关。现代研究表明II型糖尿病有很强的遗传成分，目前已发现20多个候选基因如胰岛素基因、胰岛素受体基因、胰岛素受体底物-1基因、葡萄糖转运蛋白基因、葡萄糖激酶基因、糖原合成酶基因、β3受体基因及线粒体基因等与II型糖尿病有关联，上述候选基因与II型糖尿病关联的研究为我们在群体中进行发病风险预测提供了分子生物学基础，目前世界许多国家都在致力于此方面的研究。

目前，II型糖尿病的诊断主要依靠尿糖、尿酮、尿白蛋白、血电解质、血尿素氮和肌酐等实验室检查和各种辅助检查，但是临床上尚无可靠的生物标志物可以对II型糖尿病进行风险预测和早期诊断。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供与II型糖尿病相关的基因标志物，使用基因标志物来诊断疾病具有及时性、特异性和灵敏性，使患者在糖尿病早期就能知晓风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测FAN1基因表达水平的产品在制备诊断II型糖尿病工具中的应用。

进一步，上面所述诊断产品包括：通过实时定量PCR、RT-PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测FAN1基因的表达水平。

进一步，所述用实时定量PCR诊断II型糖尿病的产品至少包括一对特异扩增FAN1基因的引物；所述用RT-PCR诊断II型糖尿病的产品至少包括一对特异扩增FAN1基因的引物；所述用免疫检测诊断II型糖尿病的产品包括：与FAN1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断II型糖尿病的产品包括：与FAN1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断II型糖尿病的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与FAN1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与FAN1基因的核酸序列杂交的探针。

进一步，所述用实时定量PCR诊断II型糖尿病的产品至少包括的一对特异扩增FAN1基因的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

进一步，所述产品包括芯片和/或试剂盒；其中所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒。

所述基因检测试剂盒包括SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增FAN1基因和管家基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。

本发明提供了一种诊断II型糖尿病的工具，所述工具能够通过检测FAN1基因的表达水平来诊断II型糖尿病。

进一步，上面所述的工具包括芯片、或试剂盒。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的寡核苷酸 探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测FAN1基因转录水平的针对FAN1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的FAN1蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测FAN1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括FAN1蛋白的特异性抗体。其中，所述基因芯片可用于检测包括FAN1基因在内的多个基因(例如，与II型糖尿病相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括FAN1蛋白在内的多个蛋白质(例如与II型糖尿病相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与II型糖尿病的标志物同时检测，可大大提高II型糖尿病诊断的准确率。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

进一步，上面所述试剂包括使用实时定量PCR、RT-PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测FAN1基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对FAN1基因的引物和/或探针。

进一步，所述基因检测试剂盒包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增FAN1基因和管家基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。

进一步，所述扩增FAN1基因的引物对序列包括正向引物SEQ ID NO.5和反向引物SEQ ID NO.6。

上面所述的基因检测试剂盒可用于检测包括FAN1基因在内的多个基因(例如，与II型糖尿病相关的多个基因)的表达水平，所述蛋白免疫检测试剂盒可用于检测包括FAN1蛋白在内的多个蛋白质(例如，与II型糖尿病相关的多个蛋白质)的表达水平。

本发明中与FAN1基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂 交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明中所述FAN1蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述FAN1蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与FAN1蛋白的结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体，如所述的片段可以通过化学法从头合成或利用重组DNA技术合成。

在本发明的上下文中，“FAN1基因”包括人FAN1基因以及人FAN1基因的任何功能等同物的多核苷酸。FAN1基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中FAN1基因(NC_000015.10)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

优选地，FAN1基因的编码序列包括以下任一种DNA分子：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述FAN1基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

本发明的FAN1基因可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达FAN1的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体所述载体包括病毒载体、真核表达载体。

病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。

真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。

在本发明的上下文中，FAN1基因表达产物包括人FAN1蛋白以及人FAN1蛋白的部分肽。所述FAN1蛋白的部分肽含有与II型糖尿病相关的功能域。

“FAN1蛋白”包括FAN1蛋白以及FAN1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括FAN1蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人FAN1的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

优选地，FAN1蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述FAN1蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

氨基酸序列的修饰可以源自自发突变或遗传后修饰，也可以人工诱导天然基因产生。通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是 NDUFAB1蛋白的融合蛋白。对于与FAN1蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留FAN1蛋白的生物学活性即可。

本发明的FAN1蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留FAN1蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了一种II型糖尿病的分子诊断手段，与传统的诊断手段相比，通过检测FAN1基因的表达水平来进行诊断更及时、更特异、更灵敏，实现II型糖尿病患者的早期诊断。

附图说明

图1显示高通量测序法检测FAN1基因在II型糖尿病患者中的表达情况。

图2显示QPCR法检测FAN1基因在II型糖尿病患者中的表达情况。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SprIIngHarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与II型糖尿病相关的基因标志物

1、样品收集

各收集10例正常人血液和II型糖尿病患者血液样本，上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备及质量分析

2.1RNA样品的制备

(1)匀浆处理

直接取血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10,000rpm离心1min。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1mlTrizol。

(2)分层

a.样品加入TRizol后，室温放置5min，使样品充分裂解。4℃12,000rpm离心10min，取上清；

b.每1ml Trizol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。

(3)RNA沉淀

a.4℃12,000rpm离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相小心的转移到新管中。

b.在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。

(4)RNA漂洗

a.RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇(用RNase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1ml TRizol加入1ml 75％乙醇。

b.4℃5,000-8,000rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。室温放置1-2min晾干沉淀。

(5)溶解RNA

沉淀中加入50-100μl RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存。

2.2RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)

NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

2.3RNA样品的质量分析(Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent Technologies 2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。

3、高通量转录组测序

3.1RNA-seq读段定位

首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。

3.2转录丰度评估

匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapIIens.GRCh37.63.gtf)。

3.3差异表达基因的检测

将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到CuffdIIff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在CuffiDff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。

4、结果

RNA-seq结果如图1所示，FAN1基因在II型糖尿病患者血液中的表达量显著高于正常人的表达量。

实施例2 QPCR测序验证FAN1基因的差异表达

1、根据高通量测序的检测结果选择FAN1基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择II型糖尿病患者血液和正常人血液各70例。

2、RNA提取步骤同实施例1。

3、逆转录：使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：

(1)取总RNA 2μg进行逆转录，加入OlIIgo(dT)2μl，充分混匀；70℃水浴；5min后立即冰浴2-3min；

(2)构建25μl反应体系，其中包括5×逆转录缓冲液5μl，dNTP(2.5mM)5μl，RNasIIn40U/μl，M-MLV 200U/μl，补无核酶水至25μl；

(3)42℃水浴60min后，95℃水浴5min以灭活M-MLV，-20℃储存备用。

4、QPCR扩增

(1)引物设计

根据Genebank中FAN1基因和管家基因GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海博尚生物技术有限公司合成。

GAPDH基因的引物序列对如下：

正向引物序列为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)。

FAN1基因的引物对序列如下：

正向引物序列为5’-TGAGAATGAAGATGATATGTTG-3’(SEQ ID NO.5)；

反向引物序列为5’-GTGTTAAGTCTAAGGCAATC-3’(SEQ ID NO.6)。

(2)PCR反应体系：正向引物和反向引物各1μl，SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，模板2μl，加去离子水补足至25μl。

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自IInvIItrogen公司。

(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图2所示，与正常人血液相比，FAN1基因在II型糖尿病患者血液中的表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.检测FAN1基因表达水平的产品在制备诊断II型糖尿病工具中的应用，其特征在于，所述FAN1基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过实时定量PCR、RT-PCR、原位杂交或基因芯片检测FAN1基因的表达水平。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断II型糖尿病的产品至少包括一对特异扩增FAN1基因的引物；所述用RT-PCR诊断II型糖尿病的产品至少包括一对特异扩增FAN1基因的引物；所述用原位杂交诊断II型糖尿病的产品包括与FAN1基因的核酸序列杂交的探针；所述用基因芯片诊断II型糖尿病的产品包括与FAN1基因的核酸序列杂交的探针。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断II型糖尿病的产品包括一对特异扩增FAN1基因的引物，其序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括基因检测试剂盒。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述工具包括基因芯片或基因检测试剂盒；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测FAN1基因转录水平的针对FAN1基因的寡核苷酸探针；所述基因检测试剂盒包括用于检测FAN1基因转录水平的试剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测FAN1基因转录水平的试剂包括针对FAN1基因的引物和/或探针。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述基因检测试剂盒包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增FAN1基因和管家基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述扩增FAN1基因的引物对的序列如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示。