CN105648066A - 检测机械力对dna与dna聚合酶相互作用影响的方法 - Google Patents

检测机械力对dna与dna聚合酶相互作用影响的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105648066A
CN105648066A CN201610083886.XA CN201610083886A CN105648066A CN 105648066 A CN105648066 A CN 105648066A CN 201610083886 A CN201610083886 A CN 201610083886A CN 105648066 A CN105648066 A CN 105648066A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
paper folding
hollow
stranded dna
templates
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610083886.XA
Other languages
English (en)
Inventor
张萍
李宾
张峰
周星飞
胡钧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Original Assignee
Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Institute of Applied Physics of CAS filed Critical Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Priority to CN201610083886.XA priority Critical patent/CN105648066A/zh
Publication of CN105648066A publication Critical patent/CN105648066A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测机械力对DNA与DNA聚合酶相互作用影响的方法。其包括以下步骤：利用原子力显微镜对含有dNTP、两端分别固定于空心DNA折纸内侧边缘上两个不同位点的单链DNA模板及结合所述单链DNA模板的DNA聚合酶Klenow片段的缓冲体系进行扫描，两个不同位点不位于同一直线边缘上，缓冲体系置于新解离的云母衬底上，通过原子力显微镜成像观察双链DNA的合成。本发明提供的检测方法获取非双螺旋方向机械力对DNA和DNA聚合酶结构和功能作用的信息进而得到机械力对DNA合成的影响，且可在纳米尺度上精确定位，为检测一定张力条件下的DNA与DNA聚合酶的相互作用关系提供了条件。

Description

检测机械力对DNA与DNA聚合酶相互作用影响的方法
技术领域
本发明涉及纳米技术领域，具体地涉及一种检测机械力对DNA与DNA聚合酶相互作用影响的方法。
背景技术
DNA与DNA聚合酶间的相互作用与细胞、组织的发生，发展和演化等生命过程密切相关，也为现代生物技术所广泛采用，其中包括DNA测序、法医检验、纳米生物传感检测以及DNA扩增技术等。DNA与DNA聚合酶作用受到多重因素的调控和影响。如在体内，与单链结合蛋白、解旋酶、拓扑异构酶等分子功能状态密切相关；在体外，也受到多种环境因素如温度、离子浓度和pH值等的影响。
DNA与DNA聚合酶相互作用的最终产物是双链DNA(dsDNA)，也就是DNA聚合酶以亲代DNA链为模板催化合成子代DNA链的过程。在合成DNA时，马达分子蛋白DNA聚合酶与DNA模板间存在着多种多样的相互作用，如寻找DNA模板链，特异性结合到引物链3’端的位置上。然后，沿着DNA模板以5’端向3’端的方向移动，合成子代DNA链。合成结束后，脱离DNA链。这种多步骤的合成过程，任何一个环节上的改变，都可能导致它们间相互作用的影响。已有研究证明，DNA合成过程也能够受到外部作用力的影响和控制，CARLOSBUSTAMANTE等人利用光镊手段，研究了不同张力DNA模版链对DNA聚合酶合成速度的影响，发现当对DNA链施加的力较小时，DNA合成速率加快；作用力达到约6pN时，合成速率到达峰值；而作用力大于约34pN后，DNA合成速率呈现下降趋势；当作用力增强到一定程度后，会出现合成暂时停滞现象。目前，光镊方法主要侧重研究基本平行于DNA链纵向拉伸弹性(沿双螺旋方向)的作用力对DNA合成的影响，而DNA及其DNA聚合酶也有可能受到其他方向作用力的作用，如周围液体的扰动，蛋白质等生物大分子结合、解离过程的影响，甚至细胞骨架重排和细胞迁移所造成的周边微环境等的影响。但目前尚缺乏检测非DNA双螺旋方向的机械力对DNA和DNA聚合酶相互作用影响的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服了现有技术中缺少一种检测非DNA双螺旋方向的机械力对DNA与DNA聚合酶相互作用影响的方法的技术问题，提供了一种检测方法，通过该检测方法可以获取非双螺旋方向机械力对DNA和DNA聚合酶结构和功能作用的信息，进而得到机械力对DNA合成的影响。
本发明通过以下技术方案来解决上述技术问题：
本发明技术方案之一：一种检测机械力对单链DNA模板与DNA聚合酶相互作用影响的方法，所述方法包括以下步骤：利用原子力显微镜对含有dNTP、单链DNA模板-空心DNA折纸及结合所述单链DNA模板的DNA聚合酶Klenow片段的缓冲体系进行原子力显微镜扫描成像观察双链DNA的合成；所述缓冲体系在新解离的云母衬底上，所述单链DNA模板-空心DNA折纸的单链DNA模板两端分别固定于空心DNA折纸内侧边缘上两个不同位置，所述两个不同位置不位于同一直线边缘上。
本发明中，所述空心DNA折纸可以为本领域常规的DNA折纸，所述空心DNA折纸的图案可根据需要设计，只要图案的中间存在空隙能够容纳待检测DNA链长度即可，较佳地为中间空心的矩形或中间空心的三角形，更佳地为中间空心的等边三角形，最佳地为边长大于30nm的中间空心的等边三角形，如边长为35nm的中间空心的等边三角形。所述DNA折纸的制备方法可以为本领域常规的方法，较佳地由单链脚手架链M13mp18DNA和订书钉单链自组装形成，所述订书钉链的序列较佳地为A17与C33两条链分别替换为序列表SEQIDNO.1与SEQIDNO.2所示序列的订书钉链DNA集合ABCL，所述订书钉链DNA集合ABCL为2010年3月17日发表在JAmChemSoc.第132卷第10期第3248-3249页的题为Goldnanoparticleself-similarchainstructureorganizedbyDNAorigami的论文的SupportinOnlineInformation中的S11-S16页所记载的从A01至Loop的DNA序列的集合，总共208条序列，可自组装成等边三角形DNA折纸。所述订书钉单链用于固定脚手架链形成目标图形，更佳地包括以下步骤：将单链脚手架链DNAM13mp18与A17与C33两条链分别替换为序列表SEQIDNO.1与SEQIDNO.2所示序列的订书钉链DNA集合ABCL混合于TAE-Mg2+缓冲体系，从95℃退火至20℃，退火速率为0.1℃/10s，其中所述单链脚手架链M13mp18与所述A17与C33两条链分别替换为序列表SEQIDNO.1与SEQIDNO.2所示序列的订书钉链DNA集合ABCL的摩尔浓度比可以为本领域常规的比例，较佳地为1∶10。组装好的DNA折纸用40mMTris-乙酸、1mMEDTA、12.5mMMgCl2，pH8.0缓冲液超滤。
本发明中，所述单链DNA模板(ssDNA)可以为本领域常规的单链DNA模板，其作为DNA复制的模板被所述DNA聚合酶Klenow片段结合。所述单链DNA模板可以通过本领域常规的方式固定于所述DNA折纸上，较佳地通过两末端固定的方式被固定于所述DNA折纸上，更佳地，通过如下方式被固定于所述折纸上：在所述空心DNA折纸的内侧边缘的订书钉链序列中选择两个不同位置各多出一段核苷酸序列分别与所述单链DNA模板的5’端与3’端序列配对，使所述单链DNA模板通过5’端与3’端杂交固定到所述DNA折纸上并位于所述DNA折纸中央。所述两个不同的位置不在所述空心DNA折纸内侧同一直线的边缘上，但可以分别位于不同直线的边缘上，例如分别位于三角形三条边中的两条边上，或位于矩形四条边中的两条边上。可以根据所述单链DNA模板的长度通过调整在所述DNA折纸不同的两边上与所述单链DNA模板互补的两个位点的位置来调整固定于所述DNA折纸上的单链DNA模板的张力，最佳地，所述单链DNA模板SEQIDNO.3通过其5’端与其3’端分别与订书钉链SEQIDNO.1所示的序列的5’端的20个碱基与订书钉链SEQIDNO.2所示的序列的3’端的20个碱基杂交固定到前述DNA折纸上并位于其中央。所述杂交可以为本领域常规的方法，较佳地为将所述单链DNA模板与所述DNA折纸混合后升温至50℃后以0.5℃/min的速率退火至15℃，再用TAE-Mg2+缓冲液超滤。所述DNA聚合酶为Klenow片段(KF)。所述dNTP的终浓度可以为本领域常规的使DNA合成能够正常进行的浓度，较佳地为15.6μM。所述缓冲体系可以为本领域DNA聚合酶Klenow片段工作的常规缓冲体系，所述缓冲体系中的缓冲成分较佳地为TAE-Mg2+缓冲液，所述TAE-Mg2+缓冲液为40mMTris-乙酸、1mMEDTA、12.5mMMgCl2，pH8.0。
本发明中，所述缓冲体系可以根据本领域常规的方法制备，较佳地按以下步骤制备：1)将所述单链DNA模板两端分别固定于所述空心DNA折纸内侧边缘上两个不同位点，制得单链DNA模板-空心DNA折纸；2)将步骤1)所述单链DNA模板-空心DNA折纸与所述DNA聚合酶Klenow片段混合20-37℃温育3-30min，较佳地25℃温育10min，加入dNTPs后即得。按上述方法制得的所述含有dNTP、两端分别固定于空心DNA折纸内侧边缘上两个不同位点的单链DNA模板及结合所述单链DNA模板的DNA聚合酶Klenow片段的缓冲体系须立刻置于原子力显微镜显微镜下扫描成像。步骤1)中，将所述单链DNA模板两端分别固定于所述空心DNA折纸内侧边缘上两个不同位点较佳地可以按以下方式进行：将所述单链DNA模板通过5’端与3’端杂交固定到所述空心DNA折纸上并位于所述DNA折纸中央的空心中，更佳地可以通过以下方式进行：将所述单链DNA模板与所述空心DNA折纸混合后升温至50℃，以0.5℃/min的退火速率退火至15℃，以前述TAE-Mg2+缓冲液超滤。步骤2)中所述dNTP的终浓度可以为本领域常规的使DNA合成能够正常进行的浓度，较佳地为15.6μM。
本发明中，所述原子力显微镜可以为本领域常规的原子力显微镜，所述原子力显微镜探针可以为本领域常规的原子力显微镜探针，较佳地为Bruke公司氮化硅探针(SNL-10，弹性系数0.35N/m)。所述原子力显微镜的扫描模式可以为本领域常规的模式，例如采用“J”扫描头，“轻敲”模式，调节扫描参数在小力区(F＜200pN)成像，分别收集不同阶段样品的AFM图像。所述原子力显微镜成像的衬底为新解离的云母。使用时，所述含有dNTP、两端分别固定于空心DNA折纸内侧边缘上两个不同位点的单链DNA模板及结合所述单链DNA模板的DNA聚合酶Klenow片段的缓冲体系置于所述新解离的云母表面上，所述新解离的云母粘于铁片上，之后即可置于原子力显微镜载样台上进行原子力显微镜成像。所述扫描的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为9-72min，如7min、9min、13min、39min或72min。
本发明中，所述通过所述原子力显微镜成像观察双链DNA的合成可以通过本领域常规的方法进行，较佳地为通过分析AFM形貌图像和高度图进行，例如以所述DNA折纸的高度作为合成的双链DNA高度的参考值，测量到位于所述DNA折纸中央的DNA的高度为所述DNA折纸高度1/2以上的视为双链DNA，1/2以下的视为单链DNA。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明还提供了一优选的实施方案，其包括以下步骤：
(1)将单链脚手架链DNAM13mp18与A17与C33两条链分别替换为序列表SEQIDNO.1与SEQIDNO.2所示序列的订书钉链DNA集合ABCL混合于TAE-Mg2+缓冲体系，从95℃退火至20℃，退火速率为0.1℃/10s，制得空心DNA折纸；其中，所述订书钉链DNA集合ABCL为2010年3月17日发表在JAmChemSoc.第132卷第10期第3248-3249页的题为Goldnanoparticleself-similarchainstructureorganizedbyDNAorigami的论文的SupportinOnlineInformation中的S11-S16页所记载的从A01至Loop的DNA序列的集合，所述单链脚手架链M13mp18与所述A17与C33两条链分别替换为序列表SEQIDNO.1与SEQIDNO.2所示序列的订书钉链DNA集合ABCL的摩尔浓度比为1∶10，所述TAE-Mg2+缓冲液为40mMTris-乙酸、1mMEDTA、12.5mMMgCl2，pH8.0；
(2)将步骤(1)制得的空心DNA折纸用TAE-Mg2+缓冲体系超滤，得超滤过的空心DNA折纸；
(3)将序列如序列表SEQIDNO.3所示的单链DNA模板与步骤(2)中所述超滤过的空心DNA折纸按摩尔比50∶1混合，升温至50℃，以0.5℃/min的退火速率退火至15℃，以前述TAE-Mg2+缓冲液超滤，得单链DNA模板-空心DNA折纸；
(4)将步骤(3)所得单链DNA模板-空心DNA折纸与所述DNA聚合酶Klenow片段混合，20-37℃温育3-30min，加入dNTPs后得含有dNTP、单链DNA模板-空心DNA折纸及结合所述单链DNA模板的DNA聚合酶Klenow片段的缓冲体系；
(5)步骤(4)所述缓冲体系制备完成后立刻置于新解离的云母上，用Bruke公司原子力显微镜氮化硅探针扫描成像，所述原子力显微镜探针为氮化硅探针SNL-10，其弹性系数为0.35N/m；所述原子力显微镜的扫描模式采用“J”扫描头，“轻敲”模式，调节扫描参数在F＜200pN的小力区成像；所述扫描的时间为7-72分钟。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供的检测方法通过原子力显微镜技术借助探针在扫描成像过程中可对衬底表面上物体施加pN-nN间的作用力，检测垂直于衬底表面作用力对吸附于界面上的DNA及其DNA与DNA聚合酶相互作用的影响，获取非双螺旋方向机械力对DNA和DNA聚合酶结构和功能作用的信息进而得到机械力对DNA合成的影响。另外，由于所述DNA折纸是程序化可控的，且可在纳米尺度上精确定位，所以在一定范围内固定于所述DNA折纸上的DNA的张力精确可控，从而为检测一定张力条件下的DNA与DNA聚合酶的相互作用关系提供了条件。
附图说明
图1为实施例1中DNA折纸图案的示意图。
图2为实施例3机械力对DNA于DNA聚合酶Klenow片段相互作用影响的AFM图像。
图3为图2中方框部分小范围的扫描放大图。
图4为实施例3中扫描时间和扫描范围对DNA复制影响的统计结果图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明中的试剂和仪器来源如下：
M13mp18单链DNA与DNA聚合酶片段Klenow片段(KF)购自NEB公司；
订书钉链购于生工生物工程(上海)股份有限公司；
dNTPs购自TaKaRa公司(中国，大连)；
原子力显微镜探针为Bruke公司氮化硅探针(SNL-10，弹性系数0.35N/m)；
PCR仪为PTC-200PeltierThermalCycler(MJResearch)；
AFM为NANOScopeIIIa或NANOScopeVIII系统(DigitalInstrument，美国)。
本发明中所用到订书钉链DNA集合ABCL为所述订书钉链DNA集合ABCL为2010年3月17日发表在JAmChemSoc.第132卷第10期第3248-3249页的题为Goldnanoparticleself-similarchainstructureorganizedbyDNAorigami的论文的SupportinOnlineInformation中的S11-S16页所记载的从A01至Loop的DNA序列的集合，总共有208条序列，可自组装成等边三角形DNA折纸。
实施例1等边三角形空心DNA折纸的制备
本实施例设计的空心DNA折纸利用M13mp18DNA和订书钉单链自组装形成等边三角形图案，等边三角形空心DNA折纸的制备方法如下：将环形长脚手架单链DNAM13mp18与A17与C33两条链分别替换为序列表SEQIDNO.1与SEQIDNO.2所示序列的订书钉链DNA集合ABCL混合于TAE-Mg2+缓冲体系(40mMTris-乙酸，1mMEDTA，12.5mMMgCl2，pH8.0)，再置于PCR仪里从95℃退火至20℃，退火速率为0.1℃/10s，其中M13mpl8与订书钉链的摩尔浓度比为1∶10，用TAE-Mg2+缓冲液超滤，制得组装好的空心DNA折纸。
本实施例中等边三角形空心DNA折纸的边长为35nm，如图1所示。所得的等边三角形空心DNA折纸的A边的订书钉链A2、A3、A6、A7、A10和A11的中间序列各多出28个碱基(5’-TCCTCTTTTGAGGAACAAGTTTTCTTGT-3’)作为DNA折纸的marker，SEQIDNO.1所示的订书钉链DNA序列YA17的5’端多伸出20个碱基(CGTAGGAGTCCTACACTACC)，SEQIDNO.2所示的订书钉链DNA序列YC33的3’端多伸出20个碱基(TAACACTCCGAACGTATTAC)用于模板DNA在折纸特定位点的杂交反应。
实施例2单链DNA模板-DNA折纸的制备
将序列如序列表SEQIDNO.3所示的114ntDNA模板杂交到实施例1中制得的空心DNA折纸上，使之位于空心DNA折纸中央，其两端通过杂交固定于空心DNA折纸上，形成单链DNA模板-空心DNA折纸，步骤如下：将过量114ntDNA模板与空心DNA折纸混合，114ntDNA模板与空心DNA折纸的摩尔比为50∶1，后置于PCR仪，从50℃退火至15℃，退火速率为0.5℃/min，用TAE-Mg2+缓冲液超滤后制得单链DNA模板-空心DNA折纸。经测定，所制得的单链DNA模板-空心DNA折纸的摩尔浓度为0.15nM。
实施例3DNA与DNA聚合酶Klenow片段之间相互作用的AFM成像和分析
将实施例2所制得的单链DNA模板-空心DNA折纸3.0μL与1.0μL浓度为85U/mL的Klenow片段(KF)在试管中混匀，25℃温育10min，加入1.0μL浓度为62.5μM的dNTPs后，立刻取3μL上述样品滴于新解离的云母片上，液体池中注入TAE-Mg2+缓冲液30μL后扫描成像。采用“J”扫描头，“轻敲”模式。调节扫描参数在小力区(F＜200pN)，采用AFM原位的实时动态扫描方式，分别收集不同阶段样品的AFM图像，包括DNA折纸、单链DNA模板-空心DNA折纸、复制过程中的和复制完成后的空心DNA折纸，图像用NanoScopeAnalysis软件进行处理和分析。
经过单链DNA模板与DNA聚合酶相互作用，单链DNA模板最终可转变成为双链DNA。这种DNA聚合酶以亲代DNA单链为模板催化合成子代DNA链的DNA复制过程，可采用纳米检测手段AFM来表征。通过分析AFM形貌图像和高度图，区分单链DNA和双链DNA，获得DNA复制效率，由此判断DNA和DNA聚合酶相互作用效果。通常认为，理论上双链DNA直径约为2.0nm，而单链DNA直径约为1.0nm，单链DNA直径为双链DNA的1/2。在分析AFM图像数据时，也以此为基本原则。如以DNA折纸的高度作为dsDNA的参考值，测量高度为其1/2以上，视为双链DNA；小于1/2视为单链DNA。为了减少人为因素所引起的测量误差，测量位置设定在等边三角形空心DNA折纸中心位置与DNA链交叉处，也就是两条线的交叉处，如图2F所示，在等边三角形空心DNA折纸中点画一条与C边平行的平行线，平行线与DNA链交叉处测得的高度数据为高度测量值。
AFM成像结果如图2与图3所示，图2A为开始连续扫描7分钟后的DNA分子的AFM图像，原来的114nt单链DNA模板链主要呈现两种不同的情况，部分为单链DNA，部分为双链。如在图2A左上方的方框内，位于三角形中间的DNA链测量高度为0.8nm，而DNA折纸测量高度值大于2.6nm，如图2a1与图3a2所示，此DNA链即为单链DNA。在图2A右下方的方框内，位于三角形折纸中间的DNA链测量高度为2.0nm，与其折纸2.3nm高度相近，如图2a3与图3a4所示，此DNA链即为双链DNA。随后以原来扫描区域为中心(见图2c中间的方框)扩大范围继续扫描，图2B、2C、2D和2E分别为扫描9、13、39和72分钟时的AFM图像。为获取高清晰度DNA链的AFM图像，扫描9和39分钟时后，选择了边长800nm的方框进行小范围扫描(图2B中左下方的方框，图2D中右上方的方框)，分别获得图2C和图2E图像。图2c1、图3c2和图3c3分别为图2C中下方的方框中的放大图像和其高度图像。衬底表面上可见分散状态的颗粒状物质，测量高度和宽度分别为3.2nm和3.0nm。与中国专利CN201110069865.X中的65KD链霉亲和素相比(AFM图像测量表观高度约为3.0-5.0nm)，高度类似，由此判断为单个76KD的单个KF分子；同时，也观察到结合在DNA链上的KF(如图2c4和图3c5所示)，其测量高度达到了4.8nm，大于折纸的测量高度值的两倍。在图2E中，DNA折纸三角形C边的环区清晰可见。图2e1、图3e2分别为图2E中方框区域的形貌图和高度图像，其测量高度达到2.2nm，与DNA折纸高度类似，显示为双链DNA。
统计结果如图4所示：扫描时间和扫描范围对DNA复制有显著影响。探针扫描时所产生的机械力对DNA和/或DNA聚合酶Klenow片段有一定作用，且拖延了DNA的复制进程。尤其表现在样品放置在新解离的云母表面上最初的反应时间段内。前7分钟内，连续扫描区域和间断扫描区域内dsDNA所占比率分别为40％和68％；7-40分钟内，两区域都呈现快速增加，前7分钟连续扫描(时间长)区域的增幅大于间断扫描区域(时间短)。40-70分钟期间，dsDNA增加减缓，但是依然是持续扫描区域的增加幅度大于间断扫描区域；70分钟后，两区域到了平台阶段，几乎没有变化，但是持续扫描区域dsDNA的数量依然低于间断扫描区域近5％。这部分差别可能与扫描过程中探针对DNA及其DNA聚合酶结构的影响或损伤有部分关系。
AFM轻敲模式扫描成像时，DNA及其DNA聚合酶主要受到了垂直于衬底表面上的探针作用力的影响相对较大(沿DNA直径方向)，而在其他方向上相对较小。所以，本发明涉及的是探针扫描是一种非单一方向的机械力，且这种机械力对DNA和DNA聚合酶都可能产生影响，同时，也可对两者同时产生影响，最终导致的都是对DNA及其与DNA聚合酶相互作用的影响。然而，由于DNA和DNA聚合酶分子具有良好的弹性或柔性，虽然在微小的外力作用下会发生构像的改变，影响其功能，但是，在一定时间内其结构与功能可以得到恢复或部分恢复。
实施例4DNA与DNA聚合酶Klenow片段之间相互作用的AFM成像和分析
将实施例2所制得的单链DNA模板-空心DNA折纸3.0μL与1.0μL浓度为85U/mL的Klenow片段(KF)在试管中混匀，20℃温育30min，加入1.0μL浓度为62.5μM的dNTPs后，立刻取3μL上述样品滴于新解离的云母片上，液体池中注入TAE-Mg2+缓冲液30μL后扫描成像。采用“J”扫描头，“轻敲”模式。调节扫描参数在小力区(F＜200pN)，采用AFM原位的实时动态扫描方式，分别收集不同阶段样品的AFM图像，包括DNA折纸、单链DNA模板-空心DNA折纸、复制过程中的和复制完成后的空心DNA折纸，图像用NanoScopeAnalysis软件进行处理和分析。
实施例5DNA与DNA聚合酶Klenow片段之间相互作用的AFM成像和分析
将实施例2所制得的单链DNA模板-空心DNA折纸3.0μL与1.0μL浓度为85U/mL的Klenow片段(KF)在试管中混匀，37℃温育3min，加入1.0μL浓度为62.5μM的dNTPs后，立刻取3μL上述样品滴于新解离的云母片上，液体池中注入TAE-Mg2+缓冲液30μL后扫描成像。采用“J”扫描头，“轻敲”模式。调节扫描参数在小力区(F＜200pN)，采用AFM原位的实时动态扫描方式，分别收集不同阶段样品的AFM图像，包括DNA折纸、单链DNA模板-空心DNA折纸、复制过程中的和复制完成后的空心DNA折纸，图像用NanoScopeAnalysis软件进行处理和分析。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种检测机械力对单链DNA与DNA聚合酶相互作用影响的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：利用原子力显微镜对含有dNTP、单链DNA模板-空心DNA折纸及结合所述单链DNA模板的DNA聚合酶Klenow片段的缓冲体系进行原子力显微镜扫描成像观察双链DNA的合成；所述缓冲体系在新解离的云母衬底上，所述单链DNA模板-空心DNA折纸由空心DNA折纸和两端分别固定于空心DNA折纸内侧边缘上两个不同位置的单链DNA模板组成，所述两个不同位置不位于同一直线边缘上。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述缓冲体系由包括以下步骤的方法制备：
1)将所述单链DNA模板两端分别固定于所述空心DNA折纸内侧边缘上两个不同位置，制得单链DNA模板-空心DNA折纸；
2)将步骤1)所述单链DNA模板-空心DNA折纸与所述DNA聚合酶Klenow片段混合，20-37℃温育3-30min，加入dNTPs后即得所述缓冲体系。
3.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)中所述缓冲体系立即滴加到新解离的云母衬底上，进行原子力显微镜扫描成像。
4.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)中，所述的固定的方法包括以下步骤：将所述单链DNA模板通过5’端与3’端杂交固定到所述空心DNA折纸上并位于所述DNA折纸中央的空心中；和/或，步骤2)中，所述dNTP的终浓度为15.6μM。
5.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述空心DNA折纸为中间空心的矩形或中间空心的三角形。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述空心DNA折纸为中间空心的等边三角形，较佳地为边长大于30nm的中间空心的等边三角形。
7.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述DNA折纸由单链脚手架链M13mp18DNA和A17和C33分别被序列表SEQIDNO.1与SEQIDNO.2所示的序列所替换的订书钉链DNA集合ABCL自组装形成，所述订书钉链DNA集合ABCL为2010年3月17日发表在JAmChemSoc.第132卷第10期第3248-3249页的题为Goldnanoparticleself-similarchainstructureorganizedbyDNAorigami的论文的SupportinOnlineInformation中的S11-S16页所记载的从A01至Loop的DNA序列的集合；所述单链DNA模板的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.3所示。
8.如权利要求7所述方法，其特征在于，所述DNA折纸的制备方法包括以下步骤：将单链脚手架链DNAM13mp18与A17与C33两条链分别替换为序列表SEQIDNO.1与SEQIDNO.2所示序列的订书钉链DNA集合ABCL混合于TAE-Mg2+缓冲体系，从95℃退火至20℃，退火速率为0.1℃/10s，其中所述单链脚手架链M13mp18与所述A17与C33两条链分别替换为序列表SEQIDNO.1与SEQIDNO.2所示序列的订书钉链DNA集合ABCL的摩尔浓度比为1∶10，所述TAE-Mg2+缓冲液为40mMTris-乙酸、1mMEDTA、12.5mMMgCl2，pH8.0。
9.如权利要求7所述方法，其特征在于，所述单链DNA模板通过其5’端与其3’端分别与SEQIDNO.1所示的序列的5’端的20个碱基与SEQIDNO.2所示的序列的3’端的20个碱基杂交固定到所述DNA折纸上并位于所述DNA折纸中央。
10.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述原子力显微镜探针为氮化硅探针SNL-10，其弹性系数为0.35N/m；所述原子力显微镜的扫描模式采用“J”扫描头，“轻敲”模式，调节扫描参数在F＜200pN的小力区成像；所述扫描的时间为7-72分钟。
CN201610083886.XA 2016-02-05 2016-02-05 检测机械力对dna与dna聚合酶相互作用影响的方法 Pending CN105648066A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610083886.XA CN105648066A (zh) 2016-02-05 2016-02-05 检测机械力对dna与dna聚合酶相互作用影响的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610083886.XA CN105648066A (zh) 2016-02-05 2016-02-05 检测机械力对dna与dna聚合酶相互作用影响的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105648066A true CN105648066A (zh) 2016-06-08

Family

ID=56488518

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610083886.XA Pending CN105648066A (zh) 2016-02-05 2016-02-05 检测机械力对dna与dna聚合酶相互作用影响的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105648066A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109557341A (zh) * 2018-11-22 2019-04-02 中国科学院上海应用物理研究所 一种精准高通量单分子力谱方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1766104A (zh) * 2005-09-01 2006-05-03 上海交通大学 原子力显微镜诱导单分子dna定位突变方法
CN102252954A (zh) * 2011-03-22 2011-11-23 中国科学院上海应用物理研究所 单个生物分子反应实时原位表征方法
CN102559891A (zh) * 2011-12-27 2012-07-11 中国科学院上海应用物理研究所 一种涉及dna折纸的方法及其结构和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1766104A (zh) * 2005-09-01 2006-05-03 上海交通大学 原子力显微镜诱导单分子dna定位突变方法
CN102252954A (zh) * 2011-03-22 2011-11-23 中国科学院上海应用物理研究所 单个生物分子反应实时原位表征方法
CN102559891A (zh) * 2011-12-27 2012-07-11 中国科学院上海应用物理研究所 一种涉及dna折纸的方法及其结构和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王奇: "基于DNA折纸的DNA复制的原子力显微术研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库——基础科学辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109557341A (zh) * 2018-11-22 2019-04-02 中国科学院上海应用物理研究所 一种精准高通量单分子力谱方法
CN109557341B (zh) * 2018-11-22 2021-05-18 中国科学院上海应用物理研究所 一种高通量单分子力谱方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10948454B2 (en) Nanopore-based analysis of protein characteristics
Adamcik et al. Observation of single‐stranded DNA on mica and highly oriented pyrolytic graphite by atomic force microscopy
Kasas et al. Escherichia coli RNA polymerase activity observed using atomic force microscopy
CN103348238B (zh) 具有提高的灵敏度的纳米线场效应晶体管生物传感器
US7812621B2 (en) Measuring apparatus and method for measuring a surface capacitance of an insulating film
CN103052718B (zh) 通过杂交的dna测序方法
CN102559891B (zh) 一种涉及dna折纸的方法及其结构和应用
CN106244712B (zh) Dna测序方法
CA2773101A1 (en) Controlled tunnel gap device for sequencing polymers
Spokoini-Stern et al. Visualizing the structure and motion of the long noncoding RNA HOTAIR
EP1271135A3 (en) System and method for deconvoluting the effect of topography on scanning probe microscopy measurements
Kim et al. Imaging and three-dimensional reconstruction of chemical groups inside a protein complex using atomic force microscopy
CN102252954B (zh) 单个生物分子反应实时原位表征方法
Dubrovin et al. The effect of underlying octadecylamine monolayer on the DNA conformation on the graphite surface
CN105760715A (zh) 一种检测单分子dna复制的图像可视化方法
Zou et al. Force Spectroscopy of Individual Stimulus‐Responsive Poly (ferrocenyldimethylsilane) Chains: Towards a Redox‐Driven Macromolecular Motor
CN105648066A (zh) 检测机械力对dna与dna聚合酶相互作用影响的方法
Nunes et al. A “Force Buffer” protecting immunoglobulin titin.
Hobbs et al. Real time observation of crystallization in polyethylene oxide with video rate atomic force microscopy
CN106771375A (zh) 一种界面处dna形貌随温度变化的检测方法
CN109557341B (zh) 一种高通量单分子力谱方法
Okerberg et al. Dendritic crystallization in thin films of PEO/PMMA blends: A comparison to crystallization in small molecule liquids
Godehardt et al. Optimum topographical and morphological information in AFM tapping mode investigation of multicomponent polyethylene
US20070082352A1 (en) Microscopy tip
CN105699699A (zh) 一种单个抗体分子原子力显微镜成像的样品制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160608

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication