CN102252954B - 单个生物分子反应实时原位表征方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单个生物分子反应实时原位表征方法。该方法包括如下步骤：将反应物I固定于DNA折纸设计位点，然后对修饰有反应物I的DNA折纸进行原子力显微镜成像，之后加入与所述反应物I对应结合的反应物II，并持续扫描成像收集数据即可。该方法能够进行实时原位检测，准确记录描述单个分子反应过程，并有利于研究界面上单分子反应动态过程。
Description
技术领域
本发明涉及一种单个生物分子反应实时原位表征方法。
背景技术
到目前为止，大多数单分子研究依然采用光学显微镜的方法，其标记步骤不可避免，而荧光寿命也是必须考虑的问题。同时，针对单分子研究的特点还需要对检测体系中的某些组分固定、对捕获分子、检测分子等进行细致的调节，以获取高的信噪比；另外，困扰检测的非特异性吸附也是必须特别考虑的。而另一方面，基于原子力显微镜(AFM)的力谱方法可对分子间的相互作用力给出定量的描述，精度可达到PN量级，是研究单分子的重要方法之一；但是，检测速度相对较慢，通量低。最近发展起来的快速扫描AFM在单分子成像研究获得了很大的进展，可实时记录蛋白质构象变化的动态过程，为研究生物单分子行为及其机理提供了非常有价值的实验数据；但是，对于蛋白质构型变化不够显著，如小于1纳米的构型变化，就比较困难了。
DNA折纸术是最近几年得到迅猛发展的纳米技术，利用一条单链DNA(通常为M13mp18)与相配对的200多条寡核苷酸链自组装而成。一般通过设计不同的寡核苷酸链，可使DNA组装成不同的结构；同时由于寡核苷酸链末端可被多种分子修饰，所以具有图案可控和编码可循的特征，具有反应位点精确可控的优势；而AFM具有纳米级的分辨率，通过检测折纸上特定位置的形貌变化就能够准确判断反应变化的情况，如反应是否发生，以及反应速度快慢等。
但是，现有技术中并没有一种能够针对单个生物分子反应的实时原位成像方法，该现状亟待解决。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服了现有技术中对于单个生物分子反应实施动态实时原位纳米尺度成像方法存在空白的缺陷，提供了一种能够进行实时检测，准确记录描述单个分子反应过程，并便利研究界面上单分子反应动态过程的单个生物分子反应实时原位表征方法。
本发明的单个生物分子反应实时原位表征方法包括如下步骤：将反应物I固定于DNA折纸设计位点，然后对修饰有反应物I的DNA折纸进行原子力显微镜成像，之后加入与所述反应物I对应结合的反应物II，并持续扫描成像收集数据即可。
本发明中，所述的反应物I、反应物II为本领域常规所述的生物单分子之间可反应结合的一对物质，如抗原-抗体反应，DNA-蛋白质反应，较佳的为生物素-亲和素系统、或凝血酶-适配体反应系统。
本发明中，所述的反应物I固定于DNA折纸设计位点的方式为本领域常规操作条件进行选择，一般为修饰于DNA折纸上(也称反应物I修饰的DNA折纸)。所述的DNA折纸、及其反应物I固定位点的设计均可为本领域常规操作方式设计。
本发明的单个生物分子反应原位表征方法较佳的为包括如下步骤：将生物素固定于DNA折纸设计位点，对修饰有生物素的DNA折纸进行原子力显微镜成像，之后加入链霉亲和素，并持续扫描成像收集数据即可。
其中，所述的生物素为本领域常规所述，小分子、分子量244；所述的亲和素本领域常规所述，分子量为65kD，理论值大小为5nm×4nm×4nm。
其中，所述的DNA折纸为本领域常规所述。所述的DNA折纸的图案可根据需要设计，本实验中较佳的为100nm×70nm长方形图案。所述的DNA折纸按本领域常规，一般由脚手架链M13mp18 DNA和订书钉单链自组装形成，订书钉单链用于固定脚手架链形成目标图形。
其中，所述的生物素固定的DNA折纸的设计位点一般按DNA折纸的图案形状设计，本领域技术人员可按本领域常规操作具体进行，一般在DNA折纸制备时将目标设计位点的订书钉单链替换为生物素修饰的订书钉单链即可。所述的脚手架链M13mp18 DNA、订书钉单链(未修饰生物素)和生物素修饰的订书钉单链均市售可得，例如，脚手架链M13mp18 DNA(N4040S)可购自NEB公司、订书钉单链和生物素修饰的订书钉单链可购自上海生工公司。
其中，所述的生物素固定于DNA折纸的制备按本领域常规操作，一般于1×TAE/Mg2+缓冲液中进行。所述的1×TAE/Mg2+缓冲液一般包括如下组分：Tris 40mM，乙酸20mM，EDTA 2mM，MgCl212.5mM，且pH值为8。所述的生物素固定于DNA折纸的制备方法较佳的包括如下步骤：将脚手架链M13mp18 DNA与订书钉单链(包括订书钉单链和生物素修饰的订书钉单链)混合后置于1×TAE/Mg2+缓冲液体系，再置于PCR仪(EppendorfMastercycler Personal machine)上从95℃退火至20℃即可，其中退火速度为0.1℃/10s。所述的有生物素的DNA折纸制备后一般于4℃保存。所述的脚手架链M13mp18 DNA与订书钉单链较佳的按摩尔比1∶10～1∶5混合，更佳的为1∶10。
其中，所述的原子力显微镜为本领域常规所述，例如NANOScope IIIa系统(Digital Intrument，美国)、或者V型系统均可。所述的原子力显微镜扫描头、原子力显微镜(AFM)探针均为本领域常规，例如原子力显微镜扫描头为J型扫描头、AFM探针为NP-S氮化硅针尖(弹性系数0.58Nm-1，Veeco公司)。
其中，所述的原子力显微镜成像为本领域常规操作，一般为将修饰有生物素的DNA折纸溶液滴加于云母片上吸附，之后置于原子力显微镜下，于液相轻敲模式进行成像操作。
其中，所述的原子力显微镜成像的条件为本领域常规，一般影响不大，较佳的为温度25℃。
其中，所述的原子力显微镜成像的各种溶液均按按本领域常规脱气处理。
其中，所述的修饰有生物素的DNA折纸溶液的浓度较佳的为3.2nM～1.6nM，更佳的为1.6nM。
其中，所述的修饰有生物素的DNA折纸溶液的用量为本领域常规，较佳的为大于0且≤5μL，更佳的为2μL。
其中，所述的吸附的时间为本领域常规，较佳的为2min～5min，更佳的为5min。
其中，所述的原子力显微镜成像的云母衬底按本领域常规，一般为新解离的云母片。使用时，云母片粘于铁片上，之后即可置于原子力显微镜载样台上进行AFM成像。
其中，所述的成像操作为本领域常规，较佳的为将1×TAE/Mg2+缓冲液注入固定好的液体槽中进行成像操作。所述的1×TAE/Mg2+缓冲液的用量较佳的为30uL～50uL，更佳的为50μL。其中，所述的液体槽为本领域常规使用，较佳的为配有细口径导管的两孔的液体槽。液体槽一般在使用时固定于载有样品的云母片上方，之后注入成像时的各种溶液随后即可进行成像操作。
其中，所述的链霉亲和素(streptavidin，SA)溶液的浓度较佳的为7.6nM～76nM。所述的链霉亲和素溶液的用量较佳的为30uL～50uL，更佳的为50uL。所述的链霉亲和素溶液在成像过程中加入较佳为待吸附修饰有生物素的DNA折纸的云母片成像稳定后加入。所述的链霉亲和素溶液加入速度较佳的为以不影响成像为准。所述的链霉亲和素溶液加入时，较佳的将液体槽的大孔堵住。所述的链霉亲和素市售可得，如可购自上海生工公司。
其中，所述的原子力显微镜成像模式为本领域常规，较佳的为AFM轻敲模式。所述的原子力显微镜成像使用力较佳的为最小力成像。
其中，所述的原子力显微镜成像参数为本领域常规，较佳的为扫描速率2Hz，驱动振幅400mV，电压0.3V，扫描数256。
本发明中所用原料和试剂均市售可得。
在符合本领域常识的基础上，本发明中上述的各技术特征优选条件可以任意组合得到较佳实例。
本发明的积极进步效果在于：本发明的单个生物分子反应原位表征方法能够对单分子反应进行实时检测，纳米尺度下准确记录描述单个分子反应过程，研究界面上的单分子反应动态过程，有希望提供一种非标记的单分子反应检测方法进而为生物分子动力学研究提供有效的信息。
附图说明
图1为实施例1DNA折纸上生物素化订书钉单链位点的示意图。
图2为实施例1固定于DNA折纸上的生物素与链霉亲和素动态实时原位的AFM图像。
图3为实施例1固定于DNA折纸上的生物素与链霉亲和素的结合率随时间变化曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下述实施例中，脚手架链M13mp18 DNA(N4040S)购自NEB公司，链霉亲和素、未修饰生物素的订书钉单链和生物素化的订书钉单链购自上海生工公司。
实施例1
1、本实施例设计的DNA折纸利用M13mp18 DNA和订书钉单链自组装形成长方形图案，长宽分别为100nm和70nm，如图1所示，在DNA折纸的四个位置上，订书钉链的末端为生物素化修饰，用于与链霉亲和素的结合。
具体生物素化的方块DNA折纸的制备：
将M13mp18 DNA单链和订书钉单链(包括生物素化订书钉单链)按1∶10摩尔浓度混合起来，并置于1×TAE/Mg2+缓冲体系(Tris 40mM，乙酸20mM，EDTA 2mM，MgCl2 12.5mM，且pH值为8)中，总体积为61uL，之后再置于PCR仪上以退火速度0.1℃/10s从95℃退火至20℃，反应完成后4℃保存即可。
2、实时原位检测链霉亲和素与生物素修饰的DNA折纸上的生物素动态反应过程
滴2μL修饰有生物素的DNA折纸于新解离的云母上，吸附5分钟后，在50μL 1×TAE/Mg2+缓冲液中，以AFM的液相轻敲模式成像，成像稳定后，向液体槽中缓慢注入一定7.6nM的50uL链霉亲和素溶液，连续扫描观测链霉亲和素与折纸术上的生物素位点结合过程，观测结果记录于图2。其中，原子力显微镜为NANOScope IIIa系统(Digital Intrument，美国)，原子力显微镜扫描头为J型扫描头，AFM探针为NP-S氮化硅针尖(弹性系数0.58Nm-1，Veeco公司)，成像条件为温度25℃，湿度40％～50％，成像参数为扫描速率2Hz，驱动振幅400mV，电压0.3V，扫描数256，且使用设备最小力成像。
如图2所示，图2a为加入链霉亲和素之前的AFM图像，图像中的DNA折纸衬底表面上没有链霉亲和素，DNA折纸高度、长和宽的大小分别为2.4±0.1nm，102.5±3.3nm，71.1±1.8nm；
图2b为加入链霉亲和素2分钟后的AFM图像，由图可见有57个生物素位点上有白色圆点状物显现出来，其表观高度在2.5nm～4.0nm间，与理论值相当，说明链霉亲和素已经与生物素结合。
随着时间的延长，白色颗粒状物逐渐增多，最后结合率几乎可达到100％，如图2的c、d、e、f分别为加入链霉亲和素7.5min、10min、20min和25min后的AFM图像；其中，图2g为图2d图像中的放大图像；图2h为图2g图像中相对应截面图，对图2g中折纸的高度分析，显示出链霉亲和素高3.7nm，DNA折纸与链霉亲和素的总高度达到6.0nm。
3、链霉亲和素与生物素的结合率
待反应完成后，统计出扫描区域范围内结合到DNA方块折纸上的链霉亲和素的总数，记为N。假设扫描时间为t时结合了的链霉亲和素的个数为n，则(n/N)×100％为该t时间的链霉亲和素与生物素结合的效率。以扫描时间为横坐标，链霉亲和素和生物素结合的效率为纵坐标，即可得到链霉亲和素与生物素结合率随时间变化的曲线图。
如图3所述记录为同一浓度(7.6nM)链霉亲和素溶液，做五组平行实验求平均值所得到的曲线图。从图3中可以看到，刚加入链霉亲和素时，两者间的结合速度最快，在15分钟内一直维持在较高的水平，随着生物素位点的减少，其与链霉亲和素结合的速度也随之下降，最后，在约30分钟时，结合率基本已经达到100％的水平。
结论：由上述实验结果可知，本发明的单个生物分子反应实时原位表征方法使用生物素-链霉亲和素体系，生物素与亲和素结合特异性非常高，只与DNA折纸上的生物素结合，由此也说明此系统中的非特异性吸附极其少，甚至可达到几乎为零的程度，无生物素修饰的位置，无论是在DNA折纸表面上或者云母片的其他区域，都无可见的新物质出现；并且，本发明可直接在DNA折纸上生物素修饰的位置观察到高度的变化，且该高度增加与理论值接近，由此，只要通过比较DNA折纸上设计的生物素位点数与AFM图像中结合有亲和素的生物素位点数，就可测定结合率，进而可通过计数的方法获取反应动力学参数，更有望成为真正的单分子水平的生物分子动力学研究方法。
Claims (6)
1.一种单个生物分子反应实时原位表征方法，其特征在于：其包括如下步骤：将生物素固定于DNA折纸设计位点，对修饰有生物素的DNA折纸进行原子力显微镜成像，之后加入链霉亲和素，并持续扫描成像收集数据；通过比较DNA折纸上设计的生物素位点数与AFM图像中结合有亲和素的生物素位点数，测定结合率，进而通过计数的方法获取反应动力学参数；所述的生物素固定于DNA折纸的制备于1×TAE/Mg2+缓冲液中进行；所述的生物素固定于DNA折纸的制备方法包括如下步骤：将脚手架链M13mp18DNA与订书钉单链混合后置于1×TAE/Mg2+缓冲液体系，再置于PCR仪上从95℃退火至20℃，其中退火速度为0.1℃/10s；其中，所述的脚手架链M13mp18DNA与订书钉单链按摩尔比1:10~1:5混合；所述的原子力显微镜成像为将修饰有生物素的DNA折纸溶液滴加于云母片上吸附，之后置于原子力显微镜下,于液相轻敲模式进行成像操作；所述的修饰有生物素的DNA折纸溶液的浓度为3.2nM~1.6nM；所述的修饰有生物素的DNA折纸溶液的用量为大于0且≤5μL；其中，吸附的时间为2min~5min；成像操作为将1×TAE/Mg2+缓冲液注入固定好的液体槽中进行成像操作；所述的1×TAE/Mg2+缓冲液的用量为30uL~50uL；所述的液体槽为配有细口径导管的两孔的液体槽。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的DNA折纸为100nm×70nm长方形图案，由脚手架链M13mp18DNA和订书钉单链自组装形成，订书钉单链用于固定脚手架链形成目标图形。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的脚手架链M13mp18DNA与订书钉单链按摩尔比1:10混合。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的修饰有生物素的DNA折纸溶液的浓度为1.6nM；所述的修饰有生物素的DNA折纸溶液的用量为2μL；所述的吸附的时间为5min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的链霉亲和素的溶液的浓度为7.6nM~76nM；所述的链霉亲和素溶液的用量为30uL~50uL；所述的链霉亲和素溶液在成像过程中加入，为待吸附修饰有生物素的DNA折纸的云母片成像稳定后加入；所述的链霉亲和素溶液加入速度为以不影响成像为准；所述的链霉亲和素溶液加入时将液体槽的大孔堵住。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的原子力显微镜成像使用力为最小力成像；所述的原子力显微镜成像参数为扫描速率2Hz，驱动振幅400mV，电压0.3V，扫描数256。
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