CN102559891B - 一种涉及dna折纸的方法及其结构和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种涉及DNA折纸的方法及其结构和应用。本方法包括步骤：1)制备末端修饰反应物I的DNA折纸订书钉链，并且使该订书钉链末端和该反应物I之间含有一连接体；2)将步骤1)所得的订书钉链和脚手架链进行自组装；3)加入与所述反应物I特异性结合的反应物II；4)检测反应物I和反应物II结合的信息。通过在反应物I与订书钉短链间加上连接体，特别是对于吸附在固液界面上DNA折纸，可以精确控制反应物I在DNA折纸上保持与反应物II有效的反应位点。本发明可以是基因芯片的检测方法，也可以特异性排布反应物。本发明可以检测单分子反应，具有极高的灵敏度和特异性。

Description

一种涉及DNA折纸的方法及其结构和应用

技术领域

本发明属于检测方法领域，特别涉及一种涉及DNA折纸的方法及其结构和应用。

背景技术

自2006年Rothemund发明折纸术以来，就引起了包括化学、生物、物理和材料科学等众多领域科学家们的兴趣，已经成为纳米领域的研究热点之一。

DNA折纸具有十分优异的特点，除了可通过分子设计构建精致、地址可循的纳米图形外，许多研究小组已经注意到折纸的另外一个特性-手性。在溶液中折纸无手性的区别，但当折纸吸附在界面上时，就存在正反面朝向的不同，且互为镜像。不同研究组获得的数据不尽相同。Rothemund，Andersen等实验数据类似，正反面的比例接近为50％；Voigt在文章中也提及手性问题，不过正反面的比例相差较大，90-95％为正面朝上。钱璐璐在研究中国地图时发现，正面朝上的地图远小于反面朝上的地图，仅占不到10％。这其中折纸本身形状不同，可能是造成结果有差异的主要原因。在折纸的可能应用中，手性与折纸功能化相关，特别是涉及折纸在界面上的吸附如纳米传感器、芯片及其分子机器等的实际应用时，折纸在界面上的取向(手性)就显得特别重要。折纸功能性分子与其他分子作用需要分子间的碰撞、接触才能得以实现。如果折纸功能面朝下，修饰的功能性分子被挤压在折纸与衬底表面间，就无法实现其特定的功能。

发明内容

本发明针对现有的对靶物质的检测的方法灵敏度较低的不足，提供一种涉及DNA折纸的方法及其结构和应用。本发明的方法可以对单分子进行检测或监测，并且可以控制单分子在有效反应位点进行反应。

本发明的第一方面提供一种涉及DNA折纸的方法，包括以下步骤：

1)制备末端修饰反应物I的DNA折纸订书钉链，并且使该订书钉链末端和该反应物I之间含有一连接体；

2)将步骤1)所得的订书钉链和脚手架链进行自组装；

3)加入与所述反应物I特异性结合的反应物II；

4)检测反应物I和反应物II结合的信息。

优选的，所述的连接体是寡聚脱氧核苷酸。

更优选的，所述的连接体是5-15个寡聚dT。

优选的，所述的反应物I和反应物II为抗原-抗体，DNA-蛋白质，DNA-DNA，生物素-亲和素、凝血酶-适配体反应，或者地高辛-适配体。

优选的，检测反应物I和反应物II结合的信息的方法是原子力显微镜成像法。

优选的，所述的订书钉链和脚手架链进行自组装形成的DNA折纸是二维折纸。

更优选的，所述的DNA折纸是吸附在固相界面上的二维DNA折纸。

最优选的，所述的DNA折纸是吸附在AFM的基板上的二维DNA折纸。

本发明的第二方面提供一种调控界面上DNA折纸反应位点的方法，包括将反应物I连接于DNA折纸订书钉链末端，然后和脚手架链进行自组装，再加入与能与反应物II特异性结合的反应物II，检测反应物I和反应物II结合的信息，其特征在于，使反应物I与订书钉链间含有连接体。

优选的，所述的连接体是不同长度的寡聚脱氧核苷酸。

优选的，所述的连接体是5-15个寡聚dT。

更优选的，所述的连接体是5-10个寡聚dT。

优选的，所述的DNA折纸是吸附在固相界面上的二维DNA折纸。

本发明的第三方面提供一种涉及DNA折纸的结构，包括自组装在一起的订书钉链和脚手架链，其中，订书钉链的末端连接着反应物I，并且该订书钉链末端和该反应物I之间含有一连接体。

优选的，该结构还含有与反应物I结合的反应物II。

优选的，所述的订书钉链和脚手架链进行自组装形成的DNA折纸是二维折纸。

本发明的第四方面提供所述的涉及DNA折纸的结构在监测反应物I和反应物II的作用中的用途，或者在检测或研究反应物II中的用途，或者在基因芯片检测或者特异排布在DNA折纸术构造的基板上的小分子的检测中的用途。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1为修饰生物素无dT。其中图1a为折纸的设计示意图；图1b为加入链霉亲和素反应后的AFM图；图1c为对图1b zoom-in后的图；图1d为对图1c的高度分析图。

图2为修饰生物素连5个dT。其中图2a为折纸的设计示意图；图2b为在裸云母上所成的DNA折纸上的生物素和链霉亲和素结合的动态实时原位AFM图；图2c为在APTES修饰的云母上所成的原子力图；图2d为固定于DNA折纸上的生物素与链霉亲和素的结合率随时间变化图。

图3为无dT和5个dT共存于同一个折纸，生物素在折纸上所构成的图案为L型。

图4为无dT和5个dT共存于同一个折纸，无dT和5个dT的生物素在量上和在折纸所处位置上都具有一致性。

图5为无dT和n个dT共存于同一个折纸，无dT和n个dT的生物素在量上和在折纸所处位置上都具有一致性。n分别为2，3，4，10。

具体实施方式

本发明提供一种涉及DNA折纸的方法及其结构和应用。本发明的方法可以对单分子进行检测或监测，并且可以控制单分子在有效反应位点进行反应。

本发明提供一种涉及DNA折纸的方法，包括以下步骤：

1)制备末端修饰反应物I的DNA折纸订书钉链，并且使该订书钉链末端和该反应物I之间含有一连接体；

2)将步骤1)所得的订书钉链和脚手架链进行自组装；

3)加入与所述反应物I特异性结合的反应物II；

4)检测反应物I和反应物II结合的信息。

本发明中，所述的连接体是连接订书钉链末端和反应物I的物质，使反应物I连接于接订书钉链末端之上，又和接订书钉链末端保持一定的距离。该连接体的长度可以是0.7-14纳米，优选3.5-7纳米。所述的连接体可以是寡聚核苷酸，优选寡聚脱氧核苷酸。可以是dT，dA，dG或者dC，优选dT。优选1-20个dT，更优选5-15个dT，最优选5-10个dT。

本发明中，所述的反应物I、反应物II为本领域常规可反应结合的一对物质，如抗原-抗体系统，DNA-蛋白质系统，DNA-DNA系统。这些物质中，反应物I和反应物II可以特异性结合，如抗原以及该抗原的抗体能够特异性结合。如蛋白质和其核酸适体特异性结合，其他非蛋白类物质和它们的核酸适体特异性结合。还有如DNA和其互补链的结合，也包括DNA链部分互补的情况。还包括已知的其他可以发生特异性结合的物质，这些都在本发明的保护范围之内。较佳的如生物素-亲和素、凝血酶-适配体，地高辛-适配体等。

本发明中，检测反应物I和反应物II结合的信息采用现有技术，如进行原子力显微镜(AFM)成像。可以对修饰有反应物I的DNA折纸进行原子力显微镜成像，在成像中加入与所述反应物I对应结合的反应物II，持续扫描成像，收集数据，观察到折纸形貌变化，由此可判断结合反应情况。也可以在反应物I和反应物II结合完全后，进行进行原子力显微镜成像，收集数据。

本发明中所述的原子力显微镜为本领域常规所述，例如NanoScope IIIa系统(Digital Intrument，美国)、或者V型系统均可。所述的原子力显微镜扫描头、原子力显微镜探针均为本领域常规，例如原子力显微镜扫描头为J型扫描头、AFM探针为NP-S氮化硅针尖(弹性系数0.58Nm^-1，Veeco公司)。

本发明所述的原子力显微镜成像为本领域常规操作，一般为将修饰有反应物I的DNA折纸溶液滴加于成像衬底上吸附，之后置于原子力显微镜下，于液相轻敲模式进行成像操作。

其中，本发明原子力显微镜成像的衬底按本领域常规，一般是云母衬底，较佳的选自以下两种云母：其一为新解离的云母片，其二为用APTES(3-胺基丙基-三乙氧基硅烷)修饰的云母。使用时，云母片粘于铁片上，吸附上样品之后即可置于原子力显微镜载样台上进行AFM成像。

本发明原子力显微镜成像模式为本领域常规，较佳的为AFM液相轻敲模式。所述的原子力显微镜成像使用力较佳的为最小力成像。本发明原子力显微镜成像操作为本领域常规，较佳的为将1×TAE/Mg²⁺缓冲液注入固定好的液体槽中进行成像操作。所述的1×TAE/Mg²⁺缓冲液的用量较佳的为30～50μL，更佳的为50μL。其中，所述的液体槽为本领域常规使用。液体槽一般在使用时固定于载有样品的云母片上方，之后注入成像时的各种溶液随后即可进行液相下的成像操作，成像过程中可以讲其它反应物注入其中。本发明原子力显微镜成像的条件为本领域常规，一般影响不大，较佳的，成像温度控制在25℃左右，湿度在40-50％左右。本发明原子力显微镜成像参数为本领域常规，较佳的为扫描速率2Hz，驱动振幅400mV，电压0.3V，扫描线数256。本发明所述的原子力显微镜成像的各种溶液均按按本领域常规脱气处理。将修饰有生物素的DNA折纸溶液滴加于成像衬底上吸附的时间为本领域常规，较佳的为2～5min，更佳的为5min。

在本发明的一优选实例中，反应物II是链霉亲和素(Streptavidin，SA)。较佳地，在成像过程中待吸附修饰有生物素的DNA折纸的云母片成像稳定后加入链霉亲和素溶液。链霉亲和素溶液加入速度较佳的为以不影响成像为准。链霉亲和素溶液的浓度较佳的为7.6～76nM。所述的链霉亲和素溶液的用量较佳的为30μL～50μL，更佳的为50μL。所述的链霉亲和素市售可得，如可购自上海生工公司。修饰有生物素的DNA折纸溶液的浓度较佳的为3.2～1.6nM，更佳的为1.6nM。修饰有生物素的DNA折纸溶液的用量为本领域常规，较佳的为大于0且≤5μL，更佳的为2μL。

在本发明的一优选实例中，原子力显微镜具有纳米级的分辨率，但生物素分子量较小，在AFM图像中无信号；链霉亲和素的分子量约为6.5Kdolton，理论值大小为5nm×4nm×4nm。AFM图像中可见约4-5纳米凸起。折纸上的生物素修饰在特定位置的订书链上，当它与亲和素反应后，可在AFM图像观察到折纸形貌变化，由此可判断结合反应情况。

本发明所述DNA折纸的设计采用现有技术，如Rothemund的方法，用M13mp18DNA作为脚手架链、用约200条互补的短链作为订书钉单链。DNA折纸可以设计为各种形状，可以是二维，也可以是三维。较佳的设计成二维的DNA折纸，如构建约为70nm×100nm的长方形DNA折纸。此DNA折纸平面形成了反应物I、反应物II单分子反应的场所。

本发明反应物I修饰的二维DNA折纸形成了不对称图形。修饰有反应物I的一面称之为正面，而无反应物I修饰的一面称之为反面。DNA折纸是悬浮于溶液中的，当用原子力显微镜检测时，DNA折纸吸附于成像基板(衬底)之上。成像基板一般是云母片。二维DNA折纸在基板上的朝向包括正面朝上和反面朝上两种。反应物I与反应物II反应后，可以通过检测反应物II引起的在原子力显微镜成像中显示出来的前后的高度变化，来判断它们的结合情况，包括分布、数量、反应速率，以及正反面比例等。因此，本发明的方法较佳的，可以检测是吸附在固相界面上的二维DNA折纸，如吸附在AFM的基板上的二维DNA折纸。

本发明中所述的脚手架链(M13mp18 DNA)、订书钉单链(未修饰生物素)和生物素修饰的订书钉单链均市售可得，例如，脚手架链M13mp18 DNA(N4040S)可购自NEB公司、订书钉单链和生物素修饰的订书钉单链可购自上海生工公司。

本发明步骤1)所述的制备末端修饰反应物I的订书钉单链的方法中，将反应物I连接于订书钉链的末端的方法采用现有技术。例如订书钉链(未修饰生物素)和生物素修饰的订书钉单链均市售可得。也可以用化学法连接。其他种类的反应物I也按照现有技术订书钉单链核苷酸的5’末端。

本发明步骤2)将步骤1)所得的订书钉链和脚手架链进行自组装，是将脚手架链与订书钉单链(包括订书钉单链和生物素修饰的订书钉单链)混合，使它们进行自组装，形成DNA折纸。脚手架链与订书钉单链自组装形成DNA折纸的方法是现有技术。一般较佳的将脚手架链与订书钉单链混合后置于1×TAE/Mg²⁺缓冲液体系，再置于PCR仪上从95℃退火至20℃即可，其中退火速度为0.1℃/10s。本发明脚手架链与订书钉单链较佳的按摩尔比1∶10～1∶5混合，更佳的为1∶10。所述的1×TAE/Mg²⁺缓冲液一般包括如下组分：Tris 40mM，乙酸20mM，EDTA 2mM，MgCl₂12.5mM，且pH值为8。反应物I修饰的DNA折纸制备后可于4℃保存。

本发明还提供一种调控界面上DNA折纸反应位点的方法，包括将反应物I连接于DNA折纸订书钉链末端，然后和脚手架链进行自组装，再加入与能与反应物II特异性结合的反应物II，检测反应物I和反应物II结合的信息，其中，使反应物I与订书钉链间含有连接体。

其中，所述的连接体如上所述，可以是不同长度的寡聚核苷酸。

其中，所述的DNA折纸如上所述，较佳的是吸附在固相界面上的二维DNA折纸。

本发明还提供一种涉及DNA折纸的结构，包括自组装在一起的订书钉链和脚手架链，其中，订书钉链的末端连接着反应物I，并且该订书钉链末端和该反应物I之间含有一连接体。

其中，优选的，该结构还含有与反应物I结合的反应物II。

所述的订书钉链和脚手架链进行自组装形成的DNA折纸是二维折纸。

本发明还提供所述的涉及DNA折纸的结构在监测反应物I和反应物II的作用中的用途，或者在检测或研究反应物II中的用途。或者在基因芯片检测或者特异排布在DNA折纸术构造的基板上的小分子的检测中的用途。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

在符合本领域常识的基础上，本发明中上述的各技术特征优选条件可以任意组合得到较佳实例。

本发明的积极进步效果在于：本发明通过在反应物I与订书钉短链间加上连接体使反应物I在DNA折纸间的空间中处于易于与反应物II反应的位置。特别是对于吸附在固液界面上DNA折纸，可以精确控制功能性分子在DNA折纸上保持有效反应位点。本发明涉及DNA折纸的方法，可以是基因芯片的检测方法，用于各种靶物质的检测。也可以特异性排布反应物I，从而检测或者检测反应物I和II之间的相互作用或者它们的各种性质。由于本发明可以检测单分子反应，因此具有极高的灵敏度。由于本发明检测的反应物I和反应物II之间的反应是特异性反应，本发明的方法具有高度特异性。本发明还使反应物I精确的保持在有效的反应位点，因此，本发明高效，重复性好。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

脚手架链M13mp18 DNA(N4040S)购自NEB公司，链霉亲和素、未修饰生物素的订书钉单链和生物素化的订书钉单链购自上海生工公司。

本发明实施例中，生物素与订书钉链的连接方式包括三种。其一，生物素(biotin)通过化学方法直接修饰在订书钉链上，它们之间没有多余寡核苷酸短链，简称无dT。其二，订书钉链上在5’末端增加了若干个胸腺嘧啶，为biotin-nT形式，简称dT，用于控制生物素与折纸间的距离。其三，订书钉链上dT和无dT的形式同时存在。本发明中，如无特殊说明，dT长度为5个胸腺嘧啶，也就是说在生物素与订书钉链的中间含有5dT。

实施例1修饰生物素，无dT

滴2μL修饰有生物素(无dT)的DNA折纸(如图1a)于新解离的云母上，吸附5分钟后，在50μL 1×TAE/Mg²⁺缓冲液中，以AFM的液相轻敲模式成像，成像稳定后，向液体槽中缓慢注入50μL的7.6nM链霉亲和素溶液，连续扫描观测链霉亲和素与折纸术上的生物素位点结合过程，观测结果记录于图1b。其中，原子力显微镜为NanoScope IIIa系统(Digital Intrument，美国)，原子力显微镜扫描头为J型扫描头，AFM探针为NP-S氮化硅针尖(弹性系数0.58Nm^-1，Veeco公司)，成像条件为温度25℃，湿度40％～50％，成像参数为扫描速率2Hz，驱动振幅400mV，电压0.3V，扫描线数256，且使用设备最小力成像。

当无dT时(折纸设计图案见图1a)，折纸上生物素与亲和素反应出现两种情况(图1b)。反应前，吸附在云母上的折纸形貌一致，表面平坦，长、宽、高分别为100nm，70nm，2.5nm。加入亲和素后，随着时间的推移，一部分折纸表面逐渐出现变化，在生物素修饰的位置上有圆形突起，30分钟后，在每一片折纸上可出现1-4个圆点，其大小与亲和素分子类似，高度为2.8-3.3nm，直径为12nm左右。其圆点所构成图形、位置与设计的生物素朝向溶液的位置、图形一致，由此认为，此为亲和素分子结合在正面朝上的折纸上。当修饰有生物素DNA折纸正面朝上时，生物素也朝向溶液方向，从而有足够的机会与亲和素分子反应。而另一部分折纸，反应前后始终无变化，4个生物素修饰位点皆未见改变，这些折纸可能就是面朝下的折纸。修饰的生物素分子在折纸的下面，即折纸和云母之间，因此大部分亲和素分子被折纸阻挡而无法与亲和素分子相遇，所以面朝下的折纸几乎没有形貌的变化。

实施例2修饰生物素，含多个dT

实验步骤同实施例1，折纸设计图案如图2a，设计位点同实施例1，区别在于含5个dT。当含5个dT时，折纸上生物素与亲和素反应只有一种情况(图2b)。反应前，折纸形貌一样，长、宽、高分别为100nm，70nm，2.5nm。表面平坦。加入亲和素后，随着时间的推移折纸表面上出现变化，30分钟后，修饰有生物素的位点几乎全部出现圆形凸起。高度为2.8-3.3nm，此为结合的亲和素分子。从图2b上的亲和素结合位点图形可以清晰地判断出折纸在云母表面上的取向。图2b(1)为加入链霉亲和素反应5分钟后所得图像，图2b(2)为加入链霉亲和素反应30分钟后所得图像。图2b(1)中蓝色圈为正面朝上折纸，圆点高度为2.8-3.3nm，其位置和图形与折纸正面设计相符合；图2b(1)中其余为反面朝上折纸，圆点高度为2.8-3.3nm，其位置和图形也与折纸反面图案相符合。可见当生物素和订书钉短链间有5个T时，大部分反面朝上的折纸都会和链霉亲和素结合，而当没有T存在时，反面朝上的折纸就观察不到和链霉亲和素的结合。折纸网格的间隙在5nm左右，且不完全是贯通的，并不比链霉亲和素分子大，所以链霉亲和素不可能从折纸的网格间隙中钻到下面。

另一可能原因为折纸与衬底的结合力不够强，存在一定的空隙，导致链霉亲和素从折纸边缘钻到了折纸和云母衬底之间。一方面，通过实施例1，我们可以分析出，假如是因为折纸和衬底吸附不牢固，两者之间有空隙，当没dT存在时，链霉亲和素同样也可以钻到折纸和云母之间，和面向云母的生物素发生结合作用，实验证明这种情况下，绝大多数反面向上折纸是没有发生反应的。另一方面，针对这一问题，我们通过衬底修饰途径加以验证。采用APTES修饰云母方法，借此增加折纸与衬底的结合力。修饰云母表面的APTES因为氨基暴露在外带正电，而DNA双链在TAE溶液中带负电，通过正负电荷相互吸引，可增加相互间的吸附程度。从图2c中可以观察到APTES修饰的云母与折纸的牢固程度较强。扫描时，折纸无移动的痕迹。扫描过程中，裸云母上的折纸会出现位置运动的现象，也说明折纸与其结合力较弱。在APTES修饰的云母上，含dT的折纸与上面类似，反应完全后，每一折纸上都有亲和素的出现，且位点与设计的一致。且因为折纸与衬底结合较强，亲和素从边缘或直接钻入折纸与云母之间更加不太可能了。由此可以推测，5个dT的长度正好可使生物素分子通过绕或折的方式，转到折纸反面，使其朝向溶液的一侧。与生物素相连的5个dT约是DNA半个螺旋的距离，使生物素分子有可能转到折纸的正面，朝向溶液中。

带有5个dT的折纸中，几乎所有的修饰有生物素的一面朝下的折纸都发生了变化，每片折纸都有亲和素与生物素修饰结合的圆点出现，而且数量与正面朝上的折纸相当。其中可能有两方面的作用导致这样的结果的产生：一是衬底对其的挤压作用；二是连接生物素的分子长度较长，它具有一定的柔韧性、活动性，所以最终大多数采取朝向溶液方向，而不是停留在了衬底与折纸之间。

并且有趣的是，这些带有5个dT的折纸中，不同取向折纸上的反应速率不同。统计结果显示，正面朝上折纸上的反应速率比反面朝上的反应速率要快。如图2d，当亲和素浓度为7.6nM时，在反应最初的5分钟，正面朝上折纸的生物素与亲和素反应已经达到88-100％，而此时反面折纸的结合率约为50％，随着时间延长到30min，其结合率达到了近95％，依然略小于正面朝上折纸上的反应。我们认为有两方面原因：一方面反面折纸上的生物素有极少数的生物素并没有折返到折纸的正面；另一方面，折纸上的生物素与折纸面的距离较远，自由度相对较高；而反面折纸的生物素由于需要折返，穿出折纸网格后可能已经是紧贴在网格的表面上，基于空间位阻的原因，也可能是导致反应速度要慢于正面折纸的原因。

为了验证生物素自由度对反应的影响，我们对含5个，10个，20个dT修饰的生物素比较，没有发现显著的反应速率差别。它们自身反应差异较小，再加上多个dT的增加，使生物素在溶液中摆动较大，造成针尖不易成像等针尖效应，可能是差别没显现出来的原因。

实施例3无dT和5个dT共存于同一个折纸

为了进一步确定修饰有dT和无dT的衬底间相互作用力情况，在同一折纸上设计修饰了两种不同的订书钉链，如图3a。在近折纸边缘位置，三点组成的一直线无dT的生物素位点(蓝色)；另外一点为含dT的生物素位点(绿色)，它们组成了L型。若折纸正面朝向溶液，生物素构成的图形应为正L型；反之，若折纸反面朝上，生物素所构成图形应是」型。实验方法同实施例1，不同的是这里用的云母是用APTES修饰后的云母。实验结果表明(图3b)，只有完整正L图形出现，而没有」图形出现。也就是说正面朝上折纸上反应都可发生，而反面朝上折纸上的情况不同，在含有dT的生物素地方有链霉亲和素的出现，如图3b(1)红色箭头所示，无dT生物素的位置没有亲和素的出现。以上结果进一步表明，当反面折纸朝上时，含dT的生物素分子可转动到溶液方向，而无dT的则几乎不行。

有趣的是，我们发现有dT与无dT位点生物素与亲和素反应后图形有些差异，如图3b，当为正面L形状时，含dT位点亲和素大小与其他3个位点不同，直径8nm左右，高2.5-3.0nm，尺度较小；而无dT位点亲和素点大小为直径12nm左右，高2.8-3.3nm，尺度较含dT的大些。两者直径相差大于30％，高度相差也大于10％。而当折纸反面朝上时，其亲和素的高度又与正面无dT点的亲和素形状接近，直径12nm左右，高2.8-3.3nm。由此，也可推测含dT生物素折返到了正面，且此时与无dT的高度类似，在紧贴折纸面的位置，探针对它们(SA)的作用力比较接近，由此形状和大小也相似。

我们也注意到有极少数面朝下折纸在生物素修饰的位点也有亲和素的出现，占反面朝向下总数的3-8％。从图中3b(2)可以看到(蓝色箭头)，这种情况多出现在3个一排的最靠近边缘的两个分子。可能的原因是因为折纸并不完全是一个平坦的平面，存在稍许的卷曲，边缘处有一定角度的卷起所造成。因为设计的关系，边缘的弯曲度是最大的。

实施例4位于折纸同一面的有dT和无dT的生物素结合链霉亲和素的速率比较

在实施例2中我们提到，反面折纸的生物素由于需要折返，穿出折纸网格后可能已经是紧贴在网格的表面上，基于空间位阻的原因，也可能是导致反应速度要慢于正面折纸的原因。为了进一步证明此观点，我们设计了下面这个实验。在折纸上(如图4<a>)设计了四个生物素位点，折纸的右下角用伸出的DNA链作为标记，根据这个标记我们可以分析出四个位点分别代表哪条链。上面两个位点，用绿色球代表的是有5个dT的生物素；下面两个位点，用蓝色球代表的是无dT的生物素。实验方法同实施例1，图4b-图4g分别代表反应前到反应25min后生物素和链霉亲和素的结合情况，随着时间的延续，发生结合作用的生物素越来越多。统计生物素结合百分率随时间变化情况得到图4h。当生物素紧贴于折纸表面，由于空间位阻效应，它和链霉亲和素的结合相对于自由度更大的生物素要明显困难，所以红色曲线所代表的正面朝上且连有5个dT的生物素结合速率最快，黑色曲线所代表的正面朝上但没有dT的生物素结合速率明显稍慢。当折纸反面朝上时，绿色曲线所代表的连有5个dT的生物素折返到反面后，紧贴于折纸表面，结合速率理论上和黑色曲线所代表的正面朝上但没有dT的生物素接近，实验结果正是如此，但绿色曲线仍比黑色曲线稍慢些，这可能是因为在折纸下面的生物素折返到上面的效率达不到100％，并且这种折返也是会有反复的。最后，蓝色曲线代表的没有5个dT的生物素基本没有发生结合作用，这也是和以上实验结果相符合的。

实施例5位于折纸同一面的有n个dT和无dT的生物素结合链霉亲和素的速率比较(n为2，3，4，10)

实施步骤和实施例4相同，所不同的只是将实施例4中的5个dT分别换为2，3，4，10个dT。在折纸上(如图5<a>)设计了四个生物素位点，折纸的右下角用伸出的DNA链作为标记。上面两个位点，用绿色球代表的是有n个dT的生物素；下面两个位点，用蓝色球代表的是无dT的生物素。图5<b>-5<e>代表当n分别为2.3.4.10时，生物素结合百分率随时间变化情况的图像。这一组实验结果，最主要的差别体现在绿色曲线所代表的反面朝上连有n个dT的生物素的反应速率和效率上。当n＝2时，反应50分钟以后，绿色曲线的结合效率仍然很低，仅有10％左右；随着n数值的增加，结合效率和速率逐渐增加；n＝10时，绿色曲线的结合速率远远超过黑色曲线，和红色曲线接近，即10个dT反转过来后，生物素距离折纸表面仍有一定距离，具有比较高的自由度，所以结合情况和正面朝上连接有5个T的生物素的结合情况类似。这也进一步说明折纸吸附于云母表面后，原本位于折纸和云母之间，难以发生反应的生物素，可以在伸出的dT的帮助下，反转到折纸反面，面朝溶液，发生反应。但是想要得到比较好的反转效果，dT的个数要大于5。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.一种调控界面上DNA折纸反应位点的方法，其特征在于，包括将反应物Ⅰ连接于DNA折纸订书钉链末端，使反应物Ⅰ与订书钉链间含有连接体，所述的连接体是5-15个寡聚dT，然后将所得的订书钉链和脚手架链进行自组装，再加入能与反应物Ⅰ特异性结合的反应物II，检测反应物Ⅰ和反应物Ⅱ结合的信息，其中所述的反应物I和反应物II分别为生物素和链霉亲和素，所述的订书钉链和脚手架链进行自组装形成的DNA折纸是二维折纸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，检测反应物Ⅰ和反应物Ⅱ结合的信息的方法是原子力显微镜成像法。

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