CN109557341A

CN109557341A - 一种精准高通量单分子力谱方法

Info

Publication number: CN109557341A
Application number: CN201811400595.4A
Authority: CN
Inventors: 李宾; 刘文静; 张萍
Original assignee: Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Priority date: 2018-11-22
Filing date: 2018-11-22
Publication date: 2019-04-02
Anticipated expiration: 2038-11-22
Also published as: CN109557341B

Abstract

本发明提供一种精准高通量单分子力谱方法，包括以下步骤：1)以DNA折纸为基底，根据该DNA折纸的几何结构在该DNA折纸上分别选取若干修饰位点，在所选修饰位点的寡核苷酸链的5’端延伸一段目标DNA短链，所述目标DNA短链可与固定于AFM探针上的DNA短链互补配对；以及2)采用原子力显微镜单分子力谱的方法对位于DNA折纸和AFM探针上的两条互补DNA短链间的相互作用力进行测定，并收集特异性力‑距曲线数据。本发明提供了一种检测效率高，特异性和精准度均得到提高的精准高通量单分子力谱方法，这种简便，高效的高通量单分子力谱方法为单分子力学的定量测量提供了一种高效而精确的测量手段。

Description

一种精准高通量单分子力谱方法

技术领域

本发明涉及单分子力谱测量领域，更具体地涉及一种精准高通量单分子力谱方法。

背景技术

对于生物分子内及分子间的相互作用，如生物分子内部结构的变化及分子间相互识别作用，都可以用力学性质来定性和定量研究。单分子水平上的探测手段是研究上述作用力的必然要求。在过去的数十年中随着科学技术在世界范围内的快速发展，先后涌现了多种单分子力谱测量技术，如光镊技术、磁镊技术、以及基于原子力显微镜的单分子力谱技术等。但对于光镊技术的主要局限是：在测量时，光束在一定程度上会对生物样品造成光损伤和热损伤；光陷阱在捕获微球时具有非特异性，任何物体都有可能被捕获，并且任何对光造成的干扰都会影响光陷阱的稳定性，因此，要求待测生物样品具有非常高的纯度和非常低的浓度。而对于磁镊技术的主要缺点在于：在测量过程中对磁性微球的位移检测是通过相机拍照实现的，因此，对磁性微球位置检测的准确性和实时性受到相机像素和响应时间的限制。而对于原子力显微镜，除了众所周知的成像功能外，AFM还可以利用基于AFM的力谱技术在单分子水平上检测生物分子间的相互作用，并对分子间的相互作用力给出定量的描述，精度可达到pN量级，是研究单分子相互作用力的重要的方法。AFM-SMFS在单分子水平上测量力的操纵过程中，是将目标分子通过化学反应或物理吸附分别固定在基底和针尖上，通过针尖相对于基底在垂直方向运动，系统记录针尖靠近基底和从基底回退过程中微悬臂弯曲方向和弯曲程度的变化。根据Hooke定律F＝k x计算出针尖与基底分子间相互作用力的大小，得到力谱测量过程中的力-距曲线。但是，AFM单分子力谱研究中存在两大类问题，检测效率低，特异性和精准度较差。单分子力谱测量的关键在于有效控制所测量的单个分子内或单个分子间的作用力。为了实现单分子力谱的测量，现在多采用稀释法获得单个分子，或若干个单分子修饰的探针或衬底，此方法效率较低。生物分子在探针和衬底表面上的非特异性吸附也普遍存在以下缺陷：一是所修饰的分子的具体位置不能确定；二所修饰分子的空间取向无法确定；三是不能实现高通量检测。这些缺陷使得力谱数据的采集与分析变得比较困难。

在过去的三十年里，DNA是大多数活的生物体中遗传信息的载体，现作为构建纳米级物体的材料其作用日益扩大。尤其是一种被称为DNA折纸的技术，已经使得研究人员能够设计出任意形状的复杂的二维或三维纳米结构。DNA折纸术是从2006年起发展最迅猛的纳米技术，其分子折叠过程一般是：把一个长单链DNA(脚手架链)，通常是M13噬菌体基因组DNA(M13mp18)和数百条合成的DNA短寡核苷酸(通常20-60bp长，其被设计成与支架DNA的不同部分互补)，以合适的摩尔化学计量比在1xTAE缓冲液中混合，加热至高温，并缓慢冷却以使互补序列相互杂交形成预设形状的纳米结构。一般通过设计不同的寡核苷酸链，可使DNA组装成不同的结构；同时由于寡核苷酸链末端可被多种分子修饰，通过这种能力，DNA折纸能够构建定制仪器来执行分子相互作用和结构的精确测量，并可以对目标分子进行定位、定向的操纵。

但是，现有技术中并没有一种能够利用DNA折纸的定向定位功能进行单分子力谱测定的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种精准高通量单分子力谱方法，从而解决现有技术中单分子力谱方法存在检测效率低，特异性和精准度较差的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种精准高通量单分子力谱方法，包括以下步骤：1)以DNA折纸为基底，根据该DNA折纸的几何结构在该DNA折纸上分别选取若干修饰位点，在所选修饰位点的寡核苷酸链的5’端延伸一段目标DNA短链，所述目标DNA短链可与固定于AFM探针上的DNA短链互补配对；以及2)采用原子力显微镜单分子力谱的方法对位于DNA折纸和AFM探针上的两条互补DNA短链间的相互作用力进行测定，并收集特异性力-距曲线数据。

本发明的发明点主要在于利用具有可编程寻址功能的DNA折纸作为AFM-SMFS力学测定中的基底，以弥补一般基底中存在的位置和取向不可控的缺陷，提供了一种能够精准高通量定点做单分子力谱的方法。

所述DNA折纸图案可根据需要设计，应当知晓的是，适用于本发明的DNA折纸是具有任意一种形状的二维或三维纳米结构。

所述步骤1)可选地包括：以一条长链DNA为主链，与若干订书钉单链以及若干目标DNA短链混合进行杂交反应，实现目标DNA短链在DNA折纸上的修饰。

根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤1)具体包括：将脚手架链M13mp18DNA与若干订书钉单链以及目标DNA短链按1：10：10的摩尔比混合后置于1xTAE/Mg²⁺缓冲液体系中，再置于PCR仪上从95℃退火至20℃，退火速度为0.1℃/10s。

所述步骤2)包括：将合成的带有目标DNA短链的DNA折纸溶液滴加于衬底上吸附一定时间，之后置于原子力显微镜的样品台上，于液相Peak force Tapping模式下的Spotand Shoot对DNA折纸进行成像，然后利用单点Ramp功能在目标位点做特异性力-距曲线。

所述带有目标DNA短链的DNA折纸溶液的浓度优选为1～5nM，最优选为3nM。

所述带有目标DNA短链的DNA折纸溶液的用量优选为1～5μL，最优选为2μL。

吸附时间优选为2～5min，最优选为3min。

DNA短链在AFM探针上的固定是通过修饰在该DNA短链的3’端的巯基与AFM探针上的镀金表面在室温下反应1～3h完成。

所述DNA短链在AFM探针上的固定所采用的DNA短链的浓度优选为1～10nM，最优选为5nM。

所述DNA短链在AFM探针上的固定所采用的DNA短链的用量优选为50～150μL，最优选为100μL。

所述的修饰探针的DNA单链修饰探针的时间最佳为2h。

适用于本发明的原子力显微镜为本领域常规使用的一种仪器，例如，具有NANOscopeⅤ型控制系统的Bruker8型扫描隧道显微镜，NANOscope 8.15版本的软件(Bruker)用于数据收集。该原子力显微镜扫描头、原子力显微镜探针均为本领域常规使用，例如，原子力显微镜扫描头为J型扫描头，AFM探针为BL-TR400PB的全镀金的氮化硅探针(弹性系数0.06Nm^-1，Mikromash公司)。

所述步骤2)中所使用的衬底是新解离的云母片，云母片预先被黏附于铁片上，使用时将云母进行剥离以获得非常平整且干净的云母片，然后把样品滴于上面吸附2-5min，然后置于原子力显微镜的样品台上进行AFM成像。

根据本发明的一个优选实施方式，此处仅作为举例而非限制，以一种三角形DNA折纸为基底，在其三条边上分别选取六个修饰位点，所选修饰位点的寡核苷酸链的5`端伸出20个碱基，其中5’端的20个碱基可与固定于AFM针尖上的DNA短链互补配对，采用AFM单分子力谱的方法测定两条互补链间的相互作用力。

根据该优选实施方式，所述的DNA折纸的三条边上共18条短链的5`端所伸出的20个碱基能与修饰在探针上的DNA短链能互补配对形成DNA双链。

根据该优选实施方式，所述的5`端所伸出的20个碱基的18条链固定于折纸设定位点上的方式为本领域常规技术手段。

根据该优选实施方式，所述的修饰在针尖上的互补DNA短链，其3’端用巯基修饰并且与20个碱基间相隔30个T碱基和6个亚甲基，总长度约35nm。应当理解的是，该互补DNA短链仅为一种实施方式，实际并不仅限于此。

根据该优选实施方式，采用的是外部边长为120nm，内部边长为40nm的三角形图案。所述的DNA折纸为本领域常规使用，一般由脚手架链M13mp18DNA和订书钉单链组装形成，订书钉单链用于固定脚手架链形成目标图形。

根据本发明，成像操作为本领域常规技术手段，较佳的为将1xTAE/Mg²⁺的缓冲液滴于已固定在液体槽上的探针上面，然后将液体槽固定于载有样品的云母片上方，之后进行成像。所述的1xTAE/Mg²⁺缓冲液的用量较佳为30～50μL，更佳为50μL。其中所述的液体槽为本领域常规使用，较佳的为配有细口径导管的两孔液体槽。

根据本发明，提供了一种基于DNA折纸的精准高通量单分子力谱方法。该方法以DNA折纸为基底，依据其几何结构的不同，在DNA折纸界面选定不同位置，精确定位修饰寡核苷酸序列，该序列可与修饰于针尖上的短链互补配对，随后采用原子力显微术(AFM)单分子力谱的方法测定两条互补链间的相互作用力。

本发明提供的方法可解决AFM单分子力谱技术中存在的若干个关键问题，包括力谱检测效率低，特异性和精准性差等问题。通常，探针和衬底修饰繁琐而无法准确定量，导致单分子力谱解析困难，也难以开展高通量力谱研究。然而，本发明通过DNA折纸定位技术，在衬底上对单个分子进行纳米尺度定位，控制获得真正的单个生物分子力谱，简化数据分析，从而获得精准的单分子力谱。此外，常规实验中衬底表面固定分子中存在的非特异性吸附问题，也是影响实验效率的问题所在，采用DNA折纸阵列定位技术可精准调控分子间的位置，间距以及取向，达到对多个设定的特定位点的分子与针尖上功能化分子间作用力的精准测量。

综上所述，本发明提供了一种检测效率高，特异性和精准度均得到提高的精准高通量单分子力谱方法，这种简便，高效的高通量单分子力谱方法为单分子力学的定量测量提供了一种高效而精确的测量手段。

附图说明

图1为根据本发明的一个优选实施例设计的单分子力谱测量的示意图；

图2为根据该实施例获得的带有目标DNA短链的一个三角形DNA折纸位点示意图；

图3为根据该实施例获得的三角折纸的AFM形貌图，其中的圆圈是做定点力曲线所选定的位点；

图4为根据该实施例获得的典型力-延伸曲线及不同数量的破裂事件的比较；

图5为根据该实施例获得的两条互补链相互作用的破裂力及破裂发生距离的统计直方图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

下述实施例中，脚手架链M13mp18DNA(N4040S)购自NEB公司，订书钉单链以及目标DNA订书钉单链购自于上海生工生物工程技术服务有限公司。所述的M13mp18DNA于2016年购于New England Biolabs，所述的订书钉链购买于Sangon Biotech并参照于2010年3月17日发表在Am Chem Soc.第132卷第10期第3248-3249页的题为Gold nanoparticle self-similar chain structure organized by DNA origami的论文的Supporting OnlineInformation中的S11-S16页所记载的从A01到Loop的DNA序列的集合，其中的A、B、C的01、05、09、33、38、42位点的订书钉链被我们设计的目标DNA链所替换掉，具体地，我们设计的目标DNA链A 01、A 05、A 09、A 33、A 38、A 42依次如序列表中SEQ ID:1-6所示，B01、B 05、B09、B 33、B 38、B 42依次如序列表中SEQ ID:7-12所示，C01、C 05、C 09、C 33、C 38、C 42次如序列表中SEQ ID:13-18所示。

实施例1：

本实施例中采用的DNA折纸是一种三角形DNA折纸，利用M13mp18DNA和订书钉链以及目标DNA订书钉单链即可自组装成外部边长为120nm，内部边长为40nm的三角形图案，即一种修饰有目标DNA订书钉单链的DNA折纸。在该三角形DNA折纸的A、B、C三条边上，分别选取了六个修饰位点，具体如图2所示，在所选修饰位点的寡核苷酸链的5’端分别延伸一段目标DNA短链，该目标DNA短链可选为20个碱基，可与固定于AFM针尖上的DNA短链互补配对，然后利用原子力显微镜单分子力谱测定的方法测定两条DNA短链间的相互作用力。

1.1具体带有目标DNA短链的三角形DNA折纸的制备：

将M13mp18噬菌体环状单链DNA、190条未修改的订书钉链、18条5`端伸出不同长度的碱基的订书钉单链按照1：10：10的摩尔比进行混合，即加入体积分别为5μL、10μL、10μL，然后加入10μl 10xTAE/Mg²⁺缓冲液(Mg²⁺浓度为12.5mol/L)，补充超纯水至最终体积为100μL，震荡摇匀。应当理解的是，该DNA折纸的制备是在1xTAE/Mg²⁺缓冲液中进行，该1xTAE/Mg²⁺缓冲液包括以下组分：Tris 40mM，乙酸20mM，EDTA-2Na 2mM，MgAC₂·4H₂O 12.5mM，且pH值约为8。然后将混合液置于PCR仪中以0.1℃/10s的速率从95℃退火至20℃，反应后使用100kDa超滤管离心除去多余的订书钉单链，4℃放置待用。

1.2以上述带有目标DNA短链的三角形DNA折纸为基底实现单分子力谱的测定：

参见图1所示，首先将新的BL-TR400PB(弹性系数约0.09Nm^-1)的全镀金探针1固定于新清洗的液体槽上，防尘放置，然后将2μL带有目标DNA短链2的三角形折纸3滴于新剥离的云母片4上，吸附3分钟后，再把样品置于样品台5上，并将50μL的1xTAE/Mg²⁺缓冲液滴于针尖上，把带有液滴覆盖的针尖-液体槽安装在样品上方，调整针尖与样品界面的位置，并调整激光7位置，最后用多模式8型AFM(NANOscopeⅤ型控制器，Bruker公司)，采用J型扫描头，在液相Peak force Tapping模式下使用Thermol Tunne校正针尖的弹性系数在0.06～0.09Nm^-1范围内。针尖的弹性系数校准完毕后，将带有针尖的液体槽取下并用纯水清洗，然后用目标DNA短链2的互补链6修饰全镀金探针1约2h后AFM成像，修饰在针尖上的互补DNA短链的3’端用巯基修饰并且与20个碱基间相隔30个T碱基和6个亚甲基，总长度约35nm，具体为

GGTAGTGTAGGACTCCTACGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-(CH₂)₆-SH，成像参数：san rate为0.5Hz；lines为256；peak force setpoint为60～80pN；fedback gain为1.8～2.1；amplitude为100nm；frequency为0.5KHz。首先对一个较大的范围成像，然后选取折纸分散均匀且完整并且折纸上的标记非常清楚的区域进行成像，同时选取spot and shoot按钮，在此模式下成像完毕后，然后用point功能在折纸上选择目标分子位点，并对目标分子位点做定点力曲线。定点力曲线的参数设置如下：ramp size为150nm；ramp rate为0.1Hz；samples为4096；trigth reshold为800pN，设定完毕后点击capture and ramp，就会在选定的目标位点上按照设定的参数做定点力曲线。如图3所示。

得到的力曲线用离线软件NanoScope Analysis 1.8版本进行分析并将其Trace曲线的数据导出，然后用OriginPro9.0作图，如图4就是几种典型的力曲线的对比图。在力曲线的采集过程中，探针首先与云母上的折纸样品接触，使探针尖端所修饰的DNA分子与折纸表面上的目标DNA分子杂交。然后探针从折纸表面撤离，使两条杂交的DNA分子以确定的速度分离。在这个接触撤回的过程中就会获得一条完整的力曲线。图4所示即为几种典型力曲线的代表：a曲线中既没有粘滞力又没有断裂力，说明探针和样品间没有发生特异性相互作用；b曲线中在探针离样品比较远的距离处有一个断裂力，而且这个距离与探针上所修饰的分子的长度比较吻合，说明此处为一对互补链断开所产生的特异性断裂力；c曲线中在探针离样品比较远的地方有多个断裂峰说明探针上的多个DNA分子与折纸上的多个目标DNA分子发生了相互作用，但是此种力曲线在本实验中发生的概率仅为0.8％，并且，后续统计数据中会把此类力曲线摒弃，所以，多对分子相互作用的影响可以忽略不计；d曲线中是在探针离开样品表面的短距离处具有一个较大的力峰值，这是探针离开表面时的跳跃峰值，这种力曲线在实验过程中也十分少见，可以忽略不计；e曲线和f曲线是在探针远离样品过程中既出现了跳跃峰值，又出现了特异性断裂力，不同的是f中存在多对DNA分子断开的情况，在采集的所有力曲线中，只会对b和e这种只发生单对特异性分子断裂事件的力曲线进行分析，概率约14％。

使用相同的操作方法重复实验收集了近百条有效力曲线，对这些力曲线进行统计分析获得两条互补链相互作用的破裂力及破裂发生距离的统计直方图如图5所示。能从非特异性力中区分特异性相互作用力的主要依据是修饰在探针上的连接分子本身(本实施例中所指的是30个T碱基)。如a中所示，在跳跃峰值之后，是一个探针的悬臂尖端从向下弯曲的状态(②)恢复到平衡位置(③)的过程。然而，探针尖端和样品表面仍有DNA链连接，随着尖端进一步远离表面，DNA链逐渐被拉伸并且探针上的DNA与折纸上的目标DNA杂交体被加载一个恒定增加的力，随着DNA链被延伸至其极限并且加载力超过探针上DNA与折纸上目标DNA间的相互作用强度，探针上的DNA与折纸上的DNA杂交体会断开，探针会于表面分离并再次以零力重新回到其静止的位置(④)。显然，探针连接的DNA分子将发生特异性断裂事件的区域移离表面有助于区分特定的断裂力与非特异性粘滞力。因此，AFM探针离开样品表面直到特异性断裂事件发生的距离被定义为断裂长度(5b)，断裂事件的力被称为断裂力(5c)。断裂长度近似等于探针上所修饰分子的总长度。b是断裂长度的统计直方图。断裂长度以32.36为中心成高斯分布(图中的曲线为高斯拟合曲线)。这与探针上所修饰分子的总长度35nm基本一致。这是探针上DNA与折纸上DNA发生相互作用后又断裂的重要依据。c是在30nm/s的撤回速度下测得的探针上DNA与折纸上的目标DNA断裂力的直方图。最可能的断裂力来自高斯拟合所得到的最可及值，约为38pN。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院上海应用物理研究所

<120> 一种精准高通量单分子力谱方法

<160> 18

<210> 1

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 2

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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Claims

1.一种精准高通量单分子力谱方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以DNA折纸为基底，根据该DNA折纸的几何结构在该DNA折纸上分别选取若干修饰位点，在所选修饰位点的寡核苷酸链的5’端延伸一段目标DNA短链，所述目标DNA短链可与固定于AFM探针上的DNA短链互补配对；以及

2)采用原子力显微镜单分子力谱的方法对位于DNA折纸和AFM探针上的两条互补DNA短链间的相互作用力进行测定，并收集特异性力-距曲线数据。

2.根据权利要求1所述的精准高通量单分子力谱方法，其特征在于，所述DNA折纸是具有任意一种形状的二维或三维纳米结构。

3.根据权利要求1所述的精准高通量单分子力谱方法，其特征在于，所述步骤1)包括：以一条长链DNA为主链，与若干订书钉单链以及若干目标DNA短链混合进行杂交反应，实现目标DNA短链在DNA折纸上的修饰。

4.根据权利要求3所述的精准高通量单分子力谱方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：将脚手架链M13mp18DNA与若干订书钉单链以及目标DNA短链按1：10：10的摩尔比混合后置于1xTAE/Mg²⁺缓冲液体系中，再置于PCR仪上从95℃退火至20℃，退火速度为0.1℃/10s。

5.根据权利要求1所述的精准高通量单分子力谱方法，其特征在于，所述步骤2)包括：将合成的带有目标DNA短链的DNA折纸溶液滴加于衬底上吸附一定时间，之后置于原子力显微镜的样品台上，于液相Peak force Tapping模式下的Spot and Shoot对DNA折纸进行成像，然后利用单点Ramp功能在目标位点做特异性力-距曲线。

6.根据权利要求5所述的精准高通量单分子力谱方法，其特征在于，所述带有目标DNA短链的DNA折纸溶液的浓度为1～5nM，用量为1～5μL。

7.根据权利要求1所述的精准高通量单分子力谱方法，其特征在于，DNA短链在AFM探针上的固定是通过修饰在该DNA短链的3’端的巯基与AFM探针上的镀金表面在室温下反应1～3h完成。

8.根据权利要求7所述的精准高通量单分子力谱方法，其特征在于，所述DNA短链在AFM探针上的固定所采用的DNA短链的浓度为1～10nM，用量为50～150μL。

9.根据权利要求1所述的精准高通量单分子力谱方法，其特征在于，所使用的原子力显微镜扫描头为J型扫描头，AFM探针为BL-TR400PB的全镀金的氮化硅探针。

10.根据权利要求5所述的精准高通量单分子力谱方法，其特征在于，所述步骤2)中所使用的衬底是新解离的云母片，该云母片预先被黏贴于铁片上，使用时将云母进行剥离以获得平整且干净的云母片，然后把合成的带有目标DNA短链的DNA折纸溶液滴于所述云母片上吸附2-5min，之后置于原子力显微镜样品台上进行AFM成像。