CN105647972A - 一种重组pcgur慢病毒干扰载体、慢病毒、构建方法及应用 - Google Patents

一种重组pcgur慢病毒干扰载体、慢病毒、构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组PCGUR慢病毒干扰载体，该重组PCGUR慢病毒干扰载体，由慢病毒干扰载体PCGUR用内切酶AgeI和内切酶EcoRI双酶切后，连入带AgeI和EcoRI粘性末端的mmu-miR-199b-5p基因特异片段重组而得，本发明还公开了该重组PCGUR慢病毒干扰载体的慢病毒及其构建方法。本发明提供的重组PCGUR慢病毒干扰载体，具有转染效率高、慢病毒滴度高的优点。

Description

一种重组PCGUR慢病毒干扰载体、慢病毒、构建方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组PCGUR慢病毒干扰载体、慢病毒，本发明还涉及一种重组PCGUR慢病毒干扰载体、慢病毒的构建方法及应用。
背景技术
慢病毒(Lentivirus)是一种逆转录病毒，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，慢病毒目前可以在细胞或者体内实现长效的外源基因表达和基因沉默。
微小RNA(microRNA，miRNA)是目前研究最多的一类内源性非编码小分子RNA，长度约为19-23nt，miRNA能够在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的翻译抑制或降解，抑制蛋白质的合成，产生基因沉默效应。作为miRNA中的一员，mmu-miR-199b-5p是2003年由Lagos-Quintana首先从鼠细胞克隆得到，随着对其研究的不断深入，mmu-miR-199b-5P基因在子宫内膜癌、卵巢癌、子宫内膜异位症等多种疾病中都有异常的表达。mmu-miR-199b-5p通过影响细胞增殖、调亡、侵袭和血管形成，参与肿瘤形成发展的各个阶段。目前，miRNA在妇科常见疾病如子宫内膜癌、卵巢癌以及子宫内膜异位症中发挥作用的具体调控机制还不是十分清楚，但已有证据表明miRNA参与调控其发生发展。随着miRNA的深入研究，有望可能作为一种新的肿瘤生物学标记物，对其在癌前病变以及恶性肿瘤中的特异表达进行检测，有助于对妇科恶性肿瘤的早期诊断，尤其有助于对那些早期无明显临床症状的肿瘤患者进行筛选。
然而现有技术的缺点是，缺乏一种干扰mmu-miR-199b-5p基因表达的慢病毒干扰载体。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组PCGUR慢病毒干扰载体、慢病毒、构建方法及应用，解决了现有技术中缺乏一种干扰mmu-miR-199b-5p基因表达的慢病毒干扰载体的问题。
本发明的第一个目的是提供一种重组PCGUR慢病毒干扰载体，将购买的慢病毒干扰载体PCGUR，经内切酶AgeI和内切酶EcoRI双酶切后，得到一个长序列片段和一个短序列片段，然后在所述长序列片段内，连入改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段，得到重组PCGUR慢病毒干扰载体，所述改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，反义链的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。
本发明的第二个目的是提供一种重组PCGUR慢病毒干扰载体的构建方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，获得改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段
步骤1.1，化学合成改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
化学合成改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的反义链，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
步骤1.2，将步骤1.1中获得的正义链配置成正义链溶液，将步骤1.1中获得的反义链配置成反义链溶液，经退火反应，获得改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段；
步骤2，获得重组PCGUR慢病毒干扰载体
步骤2.1，购买慢病毒干扰载体PCGUR，并利用内切酶AgeI和内切酶EcoRI对慢病毒干扰载体PCGUR进行双酶切，得到一个长序列片段和一个短序列片段，然后将长序列片段进行回收，获得慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物；
步骤2.2，将步骤1.2中获得的改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段和步骤2.1中获得的慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物，经T4DNA连接酶连接，获得连接产物，然后将所述连接产物回收，获得重组PCGUR慢病毒干扰载体。
优选的，所述步骤1中，获得改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段，具体按照一下步骤实施：
步骤1.1a，化学合成mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，并在其5’端添加核苷酸序列ccgg，在3’端添加核苷酸序列ttttttg，形成改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链；
化学合成mmu-miR-199b-5p基因特异片段的反义链，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，并在其5’端添加核苷酸序列aattcaaaaaa，形成改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的反义链。
优选的，所述退火反应的反应体系为：正义链溶液17-18μL，反义链溶液17-18μL，10倍浓缩的退火缓冲液4-6μL，总体积40μL，将该退火体系混匀后置于95℃水浴10-20min，之后自然冷却至室温；
所述双酶切的酶切反应体系包括：1-2μL的慢病毒干扰载体PCGUR，10倍浓缩的内切酶缓冲液5-6μL，1-2μL的内切酶AgeI，1-2μL的内切酶EcoRI，38-42μL的双蒸水，总体积50μL，反应温度37℃，反应时间2h，其中，慢病毒干扰载体PCGUR的浓度为0.5-1.5μg/μL，内切酶AgeI的浓度为8-12U/μL，内切酶EcoRI的浓度为8-12U/μL；
所述改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段和步骤2.1中获得的慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物，经T4DNA连接酶连接的连接反应体系为：改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段4-5μL，慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物4-5μL，10倍浓缩的T4DNA连接酶缓冲液2-3μL，1-2μL的T4DNA连接酶，5-9μL的双蒸水，总体积为20μL，反应温度22℃，反应时间1h，其中，改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的浓度为90-110ng/μL，慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物的浓度为30-50ng/μL，T4DNA连接酶的浓度为380-420U/μL。
优选的，所述退火反应的反应体系为：正义链溶液18μL，反义链溶液18μL，10倍浓缩的退火缓冲液4-6μL，总体积40μL，将该退火体系混匀后置于95℃水浴10min，之后自然冷却至室温；
双酶切的酶切反应体系中，所述双酶切的酶切反应体系包括：2μL的慢病毒干扰载体PCGUR，10被浓缩的内切酶缓冲液5μL，1μL的内切酶AgeI，1μL的内切酶EcoRI，41μL的双蒸水，总体积50μL，反应温度37℃，反应时间2h，其中，慢病毒干扰载体PCGUR的浓度为1μg/μL，内切酶AgeI的浓度为10U/μL，内切酶EcoRI的浓度为10U/μL；
所述经T4DNA连接酶连接的连接反应体系为：改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段5μL，慢病毒干扰载体PCGUR的的长序列片段产物5μL，10倍浓缩的T4DNA连接酶缓冲液2μL，1μL的T4DNA连接酶，7μL的双蒸水，总体积为20μL，反应温度22℃，反应时间1h，其中，改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的浓度为100ng/μL，慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物的浓度为40ng/μL，T4DNA连接酶的浓度为400U/μL。
本发明的第三个目的是提供一种慢病毒，该慢病毒利用重组PCGUR慢病毒干扰载体为材料构建而成。
本发明的第四个目的是提供一种慢病毒的构建方法，以辅助质粒psPAX2、辅助质粒pMD2.G和含有mmu-miR-199b-5p基因特异片段的重组PCGUR慢病毒干扰载体为材料，在细胞中包装成慢病毒。
优选的，所述慢病毒的包装具体按照以下步骤实施：
步骤(1)，于细胞培养皿中培养293T细胞，使用的培养基为DMEM完全培养基，培养温度为37℃，直至获得细胞汇合度为60％的293T细胞；
步骤(2)，将细胞汇合度为60％的293T细胞，进行重组PCGUR慢病毒干扰载体转染，然后于37℃培养16h，然后将培养基更换为新的DMEM完全培养基，并继续于37℃培养48h，完成慢病毒的包装，获得含有慢病毒的293T细胞培养上清液；
步骤(3)，从从步骤(2)的293T细胞培养上清液中收集经重组PCGUR慢病毒干扰载体包装成的慢病毒。
优选的，所述转染的体系为：31.56mL的灭菌水、4.44mL的浓度为2M的CaCl2、252μg的重组PCGUR慢病毒干扰载体、168μg的质粒、psPAX284μg的质粒pMD2.G、2倍浓缩的HEPES-缓冲盐溶液36mL；
所述DMEM完全培养基的成分为：体积分数为88％的DMEM生长培养基，体积分数为10％的FBS，体积分数为1％的GlutaMAX溶液，体积分数为1％的青霉素-链霉素溶液。
本发明的第五个目的是提供一种重组PCGUR慢病毒干扰载体在诊断子宫内膜癌、卵巢癌中的应用。
本发明的有益效果是，提供了一种重组PCGUR慢病毒干扰载体及其慢病毒，解决了传统的慢病毒，存在质粒转染效率低、慢病毒滴度不高的问题。
附图说明
图1是本发明重组PCGUR慢病毒干扰载体及其慢病毒的构建流程示意图；
图2是本发明使用的慢病毒干扰载体PCGUR的结构示意图；
图3是本发明重组PCGUR慢病毒干扰载体的构建方法中菌落PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；
图4是本发明重组PCGUR慢病毒干扰载体的构建方法中菌落PCR鉴定的PCR胶回收产物与mmu-miR-199b-5p基因特异片段的序列对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供一种重组PCGUR慢病毒干扰载体，以慢病毒干扰载体PCGUR和mmu-miR-199b-5p基因特异片段为材料制备，所述mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，反义链的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
基于同一发明构思，本发明提供了一种重组PCGUR慢病毒干扰载体的构建方法，重组PCGUR慢病毒干扰载体的慢病毒及包装方法，但不应理解为对本发明的限制。
若未特别指明，本发明提供的一种重组PCGUR慢病毒干扰载体的构建方法中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且若本领域技术人员所熟知的常规手段包括一个以上可供选择的实施方案，则任何一个可供选择的实施方案都不会对本发明的结果造成影响，此外，本发明所使用的内切酶AgeI、内切酶EcoRI和PCGUR慢病毒干扰载体购自纽恩(上海)生物科技有限公司，内切酶缓冲液为NewEnglandBiolabs公司生产的能够同时作为两种内切酶公用的NEBuffer，293T细胞购自CCTCC，其他实验材料均购自Invitrogen公司。
需要说明的是，PCGUR为pLKD-CMV-GFP-U6-shRNA的缩写词语，2×HEPES-缓冲盐溶液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的缩写词语，退火缓冲液的英文名为annealingBuffer，双蒸水也记作ddH2O，化学合成mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链也记作mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义oligoDNA，化学合成mmu-miR-199b-5p基因特异片段的反义链也记作mmu-miR-199b-5p基因特异片段的反义oligoDNA，化学合成mmu-miR-199b-5p基因特异片段也记作mmu-miR-199b-5p基因特异片段的双链oligoDNA。
如图1所示，本发明提供的一种重组PCGUR慢病毒干扰载体的构建方法的一个实施例，包括以下步骤：
步骤1，设计mmu-miR-199b-5p基因特异片段
由于mmu-miR-199b-5p基因，通过碱基配对结合到SGK1基因的相关位点调控基因表达，针对mmu-miR-199b-5p基因与SGK1基因结合的相关位点，根据RNA干扰序列设计原则，CenterForBiotechnologyInformationDatabase中的BLAST软件对mmu-miR-199b-5p基因进行分析，设计mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链的序列和mmu-miR-199b-5p基因特异片段的反义链的序列，mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，为5’-gaacagatagtctaaacactggg-3’，所述mmu-miR-199b-5p基因特异片段的反义链如SEQIDNO.2所示，为5’-cccagtgtttagactatctgttc-3’。
步骤2，制备两端含AgeI和EcoRI酶切位点粘性末端的改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段
步骤2.1，化学合成mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链，并在其5’端添加核苷酸序列ccgg，在3’端添加核苷酸序列ttttttg，形成改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链，所述改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链的核苷酸序列如SEQIDNO.3所述，为5’-ccgggaacagatagtctaaacactgggttttttg-3’；
步骤2.2，化学合成mmu-miR-199b-5p基因特异片段的反义链，并在其5’端添加核苷酸序列aattcaaaaaa，形成改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的反义链，所述改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的反义链的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，为5’-aattcaaaaaacccagtgtttagactatctgttc-3’；
步骤2.3，将步骤2.1中获得的改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链配置成正义链溶液，将步骤2.2中获得的改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的反义链配置成反义链溶液，经退火反应，获得改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段，且改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的一端含有AgeI酶切位点粘性末端，另一端含有EcoRI酶切位点粘性末端。
优选的，所述退火反应的反应体系为：正链溶液18μL，反义链溶液18μL，10倍浓缩的退火缓冲液4μL，将该退火体系混匀后置于95℃水浴10min，之后自然冷却至室温。
步骤3，合成重组PCGUR慢病毒干扰载体
步骤3.1，本发明选用慢病毒干扰载体PCGUR，其结构如图2所示，利用内切酶AgeI和内切酶EcoRI对慢病毒干扰载体PCGUR进行双酶切，得到一个长序列片段和一个短序列片段，然后将长序列片段进行回收，获得慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物；
所述长序列片段回收时，采用琼脂糖电泳的方法。
优选的，所述双酶切的酶切反应体系包括：2μL的慢病毒干扰载体PCGUR，5μL的酶切缓冲液，1μL的内切酶AgeI，1μL的内切酶EcoRI，41μL的双蒸水，总体积50μL，反应温度37℃，反应时间2h；
其中，慢病毒干扰载体PCGUR的浓度为1μg/μL，内切酶AgeI的浓度为10U/μL，内切酶EcoRI的浓度为10U/μL。
步骤3.2，将步骤2.3中获得的改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段和步骤3.1中获得的慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物，经T4DNA连接酶连接，然后经琼脂糖电泳回收，获得重组PCGUR慢病毒干扰载体，且重组PCGUR慢病毒干扰载体中含有mmu-miR-199b-5p基因特异片段。
优选的，所述改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段和步骤3.1中获得的慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物，经T4DNA连接酶连接的连接反应体系为：改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段5μL，10倍浓缩的T4DNA连接酶缓冲液2μL，1μL的T4DNA连接酶，7μL的双蒸水，总体积为20μL，反应温度22℃，反应时间1h，其中，改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的浓度为100ng/μL，慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物的浓度为40ng/μL，T4DNA连接酶的浓度为400U/μL。
需要说明的是，步骤2中，所述退火反应的反应体系为：步骤2.1中的正义链溶液17-18μL，步骤2.2中的反义链溶液17-18μL，10倍浓缩的退火缓冲液4-6μL，总体积40μL，将该退火体系混匀后置于95℃水浴10-20min，之后自然冷却至室温的条件，均可获得重组PCGUR慢病毒干扰载体，由于只是一些物质的用量和浓度不同，此处不对具体的实施例步骤赘述。
需要说明的是，步骤3中，所述双酶切的酶切反应体系包括：1-2μL的慢病毒干扰载体PCGUR，10倍浓缩的内切酶缓冲液5-6μL，1-2μL的内切酶AgeI，1-2μL的内切酶EcoRI，38-42μL的ddH2O，总体积50μL，反应温度37℃，反应时间2h，其中，慢病毒干扰载体PCGUR的浓度为0.5-1.5μg/μL，内切酶AgeI的浓度为8-12U/μL，内切酶EcoRI的浓度为8-12U/μL；其中，慢病毒干扰载体PCGUR的浓度为0.5-1.5μg/μL，内切酶AgeI的浓度为8-12U/μL，内切酶EcoRI的浓度为8-12U/μL的条件，均可获得重组PCGUR慢病毒干扰载体，由于只是一些物质的用量和浓度不同，此处不对具体的实施例步骤赘述。
需要说明的是，步骤3中，所述改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段和步骤3.1中获得的慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物，经T4DNA连接酶连接的连接反应体系为：改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段4-5μL，慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物4-5μL，10倍浓缩的T4DNA连接酶缓冲液2-3μL，1-2μL的T4DNA连接酶，5-9μL的双蒸水，总体积为20μL，反应温度22℃，反应时间1h，其中，改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的浓度为90-110ng/μL，慢病毒干扰载体PCGUR长序列片段产物的浓度为30-50ng/μL，T4DNA连接酶的浓度为380-420U/μL的条件，均可获得重组PCGUR慢病毒干扰载体，由于只是一些物质的用量和浓度不同，此处不对具体的实施例步骤赘述。
步骤4，将重组PCGUR慢病毒干扰载体包装成慢病毒
于细胞培养皿中培养293T细胞，使用的培养基为DMEM完全培养基，培养温度为37℃，直至获得细胞汇合度为60％的293T细胞；将细胞汇合度为60％的293T细胞，进行重组PCGUR慢病毒干扰载体转染，然后于37℃培养16h，然后将培养基更换为新的DMEM完全培养基，并继续于37℃培养48h，完成慢病毒的包装，获得含有慢病毒的293T细胞培养上清液；从293T细胞培养上清液中收集经重组PCGUR慢病毒干扰载体包装成的慢病毒。
所述转染的体系为：31.56mL的灭菌水、4.44mL的浓度为2M的CaCl2、252μg的重组PCGUR慢病毒干扰载体、168μg的质粒、psPAX284μg的质粒pMD2.G和36mL的2×HEPES-缓冲盐溶液。
所述慢病毒的包装，具体按照一下步骤实施：
步骤4.1，于细胞培养皿中培养293T细胞
步骤4.1.1，预先准备3个于T150瓶培养复苏的293T细胞，且每瓶的细胞密度是8×106个/25mL所使用培养基为DMEM完全培养基，其成分为：DMEM生长培养基，体积分数为10％的FBS，体积分数为1％的GlutaMAX溶液，体积分数为1％的青霉素-链霉素溶液；
步骤4.1.2，在每个T75瓶中添加25μL的浓度为25mM的氯喹，使得氯喹的终浓度是25μM，得到复苏细胞与氯喹的混合液；
步骤4.1.3，将步骤4.1.2的混合液分到12个直径为150mm的培养皿中，于37℃培养，培养时间为16-18h，且培养箱中CO2的体积百分比为5％，培养后的细胞，轮廓饱满，贴壁良好，在细胞瓶中均匀分布。
步骤4.2，重组PCGUR慢病毒干扰载体转染
步骤4.2.1，取一个新的50mL离心管，在其中加入31.56mL的灭菌ddH2O，4.44mL的浓度为2M的CaCl2，252μg的重组PCGUR慢病毒干扰载体，168μg的包装质粒psPAX2和84μg的VSV-G表达质粒pMD2.G，盖上盖子，充分混匀；
步骤4.2.2，取步骤4.2.1中的混合液18mL到另一个50mL离心管中，然后加入18mL的2×HEPES-缓冲盐溶液，边滴加边轻轻震荡，最后混匀，形成转染液；
步骤4.2.3，将步骤4.2.2中的转染液分成六份，每份6mL，分别滴加到步骤4.1.3所述的其中6个150mm培养皿中，转染150mm培养皿中的细胞；
步骤4.2.4，将步骤4.2.1中另外的18mL混合液，按照步骤4.2.2至步骤4.2.3所述的步骤操作进行转染，其转染的对象为步骤4.1.3的另外6个150mm培养皿中的细胞；
步骤4.2.5，将步骤4.2.3和步骤4.2.4中的150mm培养皿全部返还到培养箱中，于37℃培养16-18h，且培养箱中CO2的体积百分比为5％，培养后的细胞汇合度为60-80％左右，状态良好，在细胞之间的空隙中有细小的沉淀；
步骤4.2.6，将步骤4.2.5中12个150mm培养皿的培养基吸走，然后添加17mL新鲜的DMEM完全培养基；
步骤4.2.7，将步骤4.2.6中的12个150mm培养皿返还到培养箱中，于37℃培养48-50h，且培养箱中CO2的体积百分比为5％.
转染24小时候观察转染效果，融合的多核细胞开始出现，大多数细胞仍然是贴壁的，如果载体质粒上带有荧光标记，并且其启动子能够在293T细胞中表达，那么可以看到超过95％细胞都会带有荧光；
步骤4.3，收集慢病毒
步骤4.3.1，将步骤4.2.7中12个150mm培养皿的培养上清液收集到一起，并分装至50mL离心管中，500g室温离心10min，收集上清液，以除去细胞和大的碎片；
步骤4.3.2，用0.45μMPESfilterflask过滤步骤4.3.1中收集的上清液；
步骤4.3.3，取步骤4.3.2中收集的细胞上清液32mL，分装至6个无菌的Hitachi40PA超速离心管中，并向每个超速离心管中加入12mL的蔗糖溶液，所述蔗糖溶液的质量百分比为20％，之后将超速离心管中的液体于100000g，4℃离心2h，弃去上清液，收集沉淀物；
步骤4.3.4，向步骤4.3.3中弃去上清液的每个超速离心管中加入200μL的Opti-MEM，并将超速离心管插入50mL尖底离心管中，盖上盖子，于4℃放置2h，之后于500g，室温离心1min，使病毒液集中到管底，弃去上清液，收集沉淀物；
步骤4.3.5，将步骤4.3.4获得的所有沉淀物收集到一起，并用0.22μM的滤头过滤，得到由重组PCGUR慢病毒干扰载体包装成的慢病毒。
需要说明的是，所述重组PCGUR慢病毒干扰载体的慢病毒包装时，外膜蛋白采用VSV-G，以它包裹的慢病毒宿主范围广，是基因转导的理想工具，并且VSV-G包裹的慢病毒可以进行超速离心，浓缩后滴度可以达到2×108-5×109transducingunits/L(TU/L)，能够满足绝大部分细胞水平或是整体动物水平的实验。
本发明使用293T细胞系来生产慢病毒，293T细胞衍生自常用的HEK293细胞系，但是能生产出更高滴度的病毒。HEK293细胞是用剪切过的5型腺病毒DNA转化人胚肾细胞得到的细胞系。在此基础上，转化了SV40T抗原的细胞称为293T细胞，它的生长速度更快，代谢更旺盛。
优选的，所述293T细胞的复苏步骤为：
(1)将10mL的DMEM生长培养基加入15mL锥底管中；
(2)将293T细胞冻存管放入37℃水浴中使之融化，从水浴中拿出冻存管，并通过用70％酒精擦拭管表面进行消毒；
(3)将上一步融解的细胞悬浮液移至锥底管中，并进行离心，离心转速为200g，离心时间为3min，弃掉上清液；
(4)向步骤上一步的锥形管中加入5mL的新鲜DMEM生长培养基，使细胞悬浮；
(5)步骤上一步中的细胞悬浮液移至CM2KB32-75-cm2组织培养瓶中，并向组织培养瓶中添加10mL的新鲜DMEM生长培养基，然后于37℃培养，培养时间为16-18h，且培养箱中CO2的体积百分比为5％；
(6)每天监视细胞密度，直至细胞达到50％汇合率，并以此细胞作为复苏的293T细胞。
优选的，所述293T细胞的传代方法为：
(1)将复苏的293T细胞培养液，经200g室温离心3min后，弃去上清液，并用10L的PBS(phosphate-bufferedsaline)清洗细胞沉淀物一次，再次经200g室温离心3min，弃去上清液，获得细胞沉淀物；
(2)用5mL的胰酶-EDTA溶液消化细胞，时间为1-3min；
(3)向上一步中添加5mL的DMEM生长培养基稀释细胞，从而使胰酶失活，然后将细胞悬浮液移至15mL的锥底管中，经200g室温离心3min后，弃去上清液，获得细胞沉淀物；
(4)用10mL的DMEM生长培养基，重悬上一步中的细胞沉淀物，然后取2mL的细胞悬浮液到CM2KB32-75-cm2组织培养瓶中，并向组织培养瓶中添加28mL的新鲜DMEM生长培养基，然后于37℃培养，培养时间为16-18h，且培养箱中CO2的体积百分比为5％；
(5)每天查看细胞密度，细胞汇合率要接近50％停止培养，并以此细胞培养液作为下一代传代培养的种子液.。
优选的，所述293T细胞的液氮贮存方法为：
(1)37℃水浴预热DMEM生长培养基，胰酶-EDTA溶液和冻存培养基；
(2)将复苏的293T细胞培养液，经200g室温离心3min后，弃去上清液，并用10L的PBS清洗细胞沉淀物一次，再次经200g室温离心3min，弃去上清液，获得细胞沉淀物；
(3)用5mL的胰酶-EDTA溶液消化细胞，时间为1-3min，所述胰酶-EDTA溶液预先经37℃水浴预热；
(4)向上一步中加入10mL的DMEM生长培养基稀释细胞，以阻止胰酶作用，然后对细胞悬浮液进行血细胞计数器计数，之后将细胞悬浮液经200g室温离心3min后，弃去上清液，获得细胞沉淀物；
(5)用冻存培养基再悬浮细胞，配置成细胞浓度为1×106个/mL的细胞悬浮液，然后分装细胞悬液到2mL的冷冻管；
(6)通过逐渐降温冷冻细胞至-80℃后，一直维持在-80℃冷冻过夜，然后将冻存细胞的小管转移到液氮中长期保存，并且第二天取一支细胞做复苏检测，以判断该批细胞的冻存质量。
步骤5，转化大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态细胞
步骤5.1，制备大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态细胞
步骤5.1.1，溶液配制
(1)配制浓度为0.1M的CaCl2溶液，并用无菌的0.45μm微膜过滤除菌；
(2)配制浓度为250mM的KCl2溶液；
(3)配制浓度为2M的MgCl2溶液，高压灭菌；
(4)配置SOB溶液：向1mL的250mMKCl2溶液中，加入100mL的LB培养液，并以浓度为5M的NaOH将溶液pH调至7.0，高压灭菌，临用前加入0.5mL的浓度为2M的MgCl2溶液。
步骤5.1.2，用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态细胞。
(1)将培养好的大肠杆菌细胞于4000r，4℃离心10min，回收细胞，弃去上清液，收集沉淀物；
(2)以10mL用冰预冷的0.1MCaCl2重悬沉淀物，并于4℃，以4000rpm离心10min，回收细胞弃去上清液，收集沉淀物；
(3)用2mL用冰预冷的0.1MCaCl2重悬每份细胞沉淀，并将细胞重悬液放置于冻藏管中，并于-70℃冻存，备用；
步骤5.2，转化293T感受态细胞
步骤5.2.1，取步骤5.1获得的感受态细胞冻藏管于冰上，待溶解后加入10μL的连接液，混匀，冰浴30min；
步骤5.2.2，将步骤5.2.1中冰浴后的混合液，放到于42℃热激90s，然后快速将冻藏管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3min；
步骤5.2.3，向步骤5.2.2的冻藏管中加900μL的LB培养液，并且所述LB培养液不含与表达载体相应的抗生素，然后将冻藏管转移到摇床，于37℃培养1h，使细菌复苏，获得转化菌液；
步骤5.2.4，取步骤5.2.3中的转化菌液适量，涂布于LB琼脂平板上，且LB琼脂平板上含有与表达载体相应的抗生素，于恒温培养箱中37℃培养，16h，获得转化菌株。
步骤6，菌落PCR鉴定
挑取平板上长出的转化子重悬于10μL的LB培养液中，从中取1μL做模板进行菌落PCR鉴定。
优选的，步骤6使用的引物为：正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，为5’-cctatttcccatgattccttcata-3’和反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.6，为5’-gtaatacggttatccacgcg-3’，；
PCR体系为：1μL的模板DNA、2μL的dNTP、2μL的正向引物、2μL的反向引物、2μL的10×Buffer、0.5μL的Taq酶、10.5μL的ddH2O，总体积20μL；
PCR程序为，第一步，94℃维持5min；第二步，包括30个循环，其中每一个循环的条件为95℃维持30s、之后55℃维持30s、之后72℃维持30s；第三步，72℃维持10min；第四步，温度降为4℃，并且PCR程序停止。
随机选取的10个转化子，进行菌落PCR鉴定，结果如图3所示，1、2、4、6、7、9、10、11、12、13、14、15为阳性克隆子，阳性克隆子的数量占总转化子数量的80％，将图3中鉴定为阳性克隆子的菌落的PCR产物进行胶回收，获得菌落PCR回收产物，然后对其进行基因测序，得到如SEQIDNO.7所述的核苷酸序列，采用DNAStar的MegAlign软件对插入片段与测序结果比对，结果如图4所示，“ccgggaacagatagtctaaacactgggttttttg”的核苷酸序列完全相同，从而可以得出，阳性的克隆子1、2、4、6、7、9、10、11、12、13、14、15，即为构建成功的，含有mmu-miR-199b-5p基因特异片段的重组PCGUR慢病毒干扰载体。使用本发明重组PCGUR慢病毒转染细胞的转染率可达80-90％，而未经改造的慢病毒PCGUR转染细胞的转染率只有50-70％。
另外，采用本发明PCGUR慢病毒干扰载体，对293T细胞进行转染，每个载体做三个平行试验，并对转染结果进行检测，结果表明，本发明MM-PUCG慢病毒干扰载体转染的293T细胞的平均滴度为8.43×108，高于一般未经改造的慢病毒干扰载体。
表1中，滴度(integrationunitsperml，IUml-1)的计算公式如下：
IUml-1＝(C×N×D×1000)/V
表1中：C表示平均每基因组整合的病毒拷贝数，N表示感染时细胞的数目(约为2×105)，D表示病毒载体的稀释倍数，V表示加入的稀释病毒的体积数(μL)。
表1未经改造的慢病毒干扰载体PCGUR转染的检测结果

Claims (10)

1.一种重组PCGUR慢病毒干扰载体，其特征在于，将购买的慢病毒干扰载体PCGUR，经内切酶AgeI和内切酶EcoRI双酶切后，得到一个长序列片段和一个短序列片段，然后在所述长序列片段内，连入改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段，得到重组PCGUR慢病毒干扰载体，所述改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，反义链的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。
2.根据权利要求1所述的重组PCGUR慢病毒干扰载体的构建方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1，获得改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段
步骤1.1，化学合成改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
化学合成改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的反义链，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
步骤1.2，将步骤1.1中获得的正义链配置成正义链溶液，将步骤1.1中获得的反义链配置成反义链溶液，经退火反应，获得改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段；
步骤2，获得重组PCGUR慢病毒干扰载体
步骤2.1，购买慢病毒干扰载体PCGUR，并利用内切酶AgeI和内切酶EcoRI对慢病毒干扰载体PCGUR进行双酶切，得到一个长序列片段和一个短序列片段，然后将长序列片段进行回收，获得慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物；
步骤2.2，将步骤1.2中获得的改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段和步骤2.1中获得的慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物，经T4DNA连接酶连接，获得连接产物，然后将所述连接产物回收，获得重组PCGUR慢病毒干扰载体。
3.根据权利要求2所述的重组PCGUR慢病毒干扰载体的构建方法，其特征在于，所述步骤1中，获得改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段，具体按照以下步骤实施：
步骤1.1a，化学合成mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，并在其5’端添加核苷酸序列ccgg，在3’端添加核苷酸序列ttttttg，形成改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链；
化学合成mmu-miR-199b-5p基因特异片段的反义链，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，并在其5’端添加核苷酸序列aattcaaaaaa，形成改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的反义链。
4.根据权利要求2所述的重组PCGUR慢病毒干扰载体的构建方法，其特征在于，所述退火反应的反应体系为：正义链溶液17-18μL，反义链溶液17-18μL，10倍浓缩的退火缓冲液4-6μL，总体积40μL，将该退火体系混匀后置于95℃水浴10-20min，之后自然冷却至室温；
所述双酶切的酶切反应体系包括：1-2μL的慢病毒干扰载体PCGUR，10倍浓缩的内切酶缓冲液5-6μL，1-2μL的内切酶AgeI，1-2μL的内切酶EcoRI，38-42μL的双蒸水，总体积50μL，反应温度37℃，反应时间2h，其中，慢病毒干扰载体PCGUR的浓度为0.5-1.5μg/μL，内切酶AgeI的浓度为8-12U/μL，内切酶EcoRI的浓度为8-12U/μL；
所述改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段和步骤2.1中获得的慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物，经T4DNA连接酶连接的连接反应体系为：改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段4-5μL，慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物4-5μL，10倍浓缩的T4DNA连接酶缓冲液2-3μL，1-2μL的T4DNA连接酶，5-9μL的双蒸水，总体积为20μL，反应温度22℃，反应时间1h，其中，改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的浓度为90-110ng/μL，慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物的浓度为30-50ng/μL，T4DNA连接酶的浓度为380-420U/μL。
5.根据权利要求4所述的重组PCGUR慢病毒干扰载体的构建方法，其特征在于，所述退火反应的反应体系为：正义链溶液18μL，反义链溶液18μL，10倍浓缩的退火缓冲液4-6μL，总体积40μL，将该退火体系混匀后置于95℃水浴10min，之后自然冷却至室温；
双酶切的酶切反应体系中，所述双酶切的酶切反应体系包括：2μL的慢病毒干扰载体PCGUR，10被浓缩的内切酶缓冲液5μL，1μL的内切酶AgeI，1μL的内切酶EcoRI，41μL的双蒸水，总体积50μL，反应温度37℃，反应时间2h，其中，慢病毒干扰载体PCGUR的浓度为1μg/μL，内切酶AgeI的浓度为10U/μL，内切酶EcoRI的浓度为10U/μL；
所述经T4DNA连接酶连接的连接反应体系为：改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段5μL，慢病毒干扰载体PCGUR的的长序列片段产物5μL，10倍浓缩的T4DNA连接酶缓冲液2μL，1μL的T4DNA连接酶，7μL的双蒸水，总体积为20μL，反应温度22℃，反应时间1h，其中，改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的浓度为100ng/μL，慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物的浓度为40ng/μL，T4DNA连接酶的浓度为400U/μL。
6.一种慢病毒，其特征在于，利用权利要求1所述的重组PCGUR慢病毒干扰载体合成。
7.根据权利要求6所述的慢病毒的构建方法，其特征在于，以辅助质粒psPAX2、辅助质粒pMD2.G和含有mmu-miR-199b-5p基因特异片段的重组PCGUR慢病毒干扰载体为材料，在细胞中包装成慢病毒。
8.根据权利要求7所述的慢病毒的构建方法，其特征在于，所述慢病毒的包装具体按照以下步骤实施：
步骤(1)，于细胞培养皿中培养293T细胞，使用的培养基为DMEM完全培养基，培养温度为37℃，直至获得细胞汇合度为60％的293T细胞；
步骤(2)，将细胞汇合度为60％的293T细胞，进行重组PCGUR慢病毒干扰载体转染，然后于37℃培养16h，然后将培养基更换为新的DMEM完全培养基，并继续于37℃培养48h，完成慢病毒的包装，获得含有慢病毒的293T细胞培养上清液；
步骤(3)，从步骤(2)的293T细胞培养上清液中收集经重组PCGUR慢病毒干扰载体包装成的慢病毒。
9.根据权利要求8所述的慢病毒的构建方法，其特征在于，所述转染的体系为：31.56mL的灭菌水、4.44mL的浓度为2M的CaCl2、252μg的重组PCGUR慢病毒干扰载体、168μg的质粒、psPAX284μg的质粒pMD2.G、2倍浓缩的2×HEPES-缓冲盐溶液36mL；
所述DMEM完全培养基的成分为：体积分数为88％的DMEM生长培养基，体积分数为10％的FBS，体积分数为1％的GlutaMAX溶液，体积分数为1％的青霉素-链霉素溶液。
10.如根据权利要求1所述的重组PCGUR慢病毒干扰载体在诊断子宫内膜癌、卵巢癌中的应用。
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