CN105647902B - 一种碳纳米管固定化漆酶及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种碳纳米管固定化漆酶，其制备方法为先将碳纳米管进行琥珀酰亚胺基的接枝和氨基三乙酸功能团的接枝，再进行铜离子鳌合修饰的表面功能化处理，然后与脱除铜离子的漆酶进行固定化反应；漆酶活性中心与碳纳米管表面功能基团的铜离子直接联接，从而可以实现真正意义的直接电子传递，克服了漆酶蛋白质外壳对电子由活性中心到碳纳米管的直接传递过程产生的屏蔽作用，本发明的碳纳米管固定化漆酶解决了碳纳米管固定化漆酶催化过程中电子传递速率受限的问题，可提高固定化漆酶在生物检测中的灵敏度，将酚类测定时的最低检测限降低85％～96％，在生物燃料电池应用中的电流密度提高80％～120％。

Description

一种碳纳米管固定化漆酶及其用途

技术领域

本发明涉及漆酶的固定化领域，具体为一种通过漆酶活性中心与碳纳米管连接实现直接电子传递的碳纳米管固定化漆酶及其用途。

背景技术

漆酶(苯二醇∶氧化还原酶，EC l.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白同属蓝色多铜氧化酶家族。漆酶是一种铜蛋白，一般含4个铜离子，根据光谱和磁性特征可将漆酶中的铜离子分为3类：I型Cu、II型Cu、III型Cu；其中I型Cu和II型Cu各1个，是单电子受体，呈顺磁性，可用电子顺磁共振(EPR)测定；III型Cu 2个，是双电子受体，呈反磁性，EPR检测不出来。根据X射线、光谱、磁性和实验事实推测，铜离子的配位结构为：I型Cu分别被与Cys、Phe的2个S，2个His中的N配位，形成变形的四面体；II型Cu是三核簇，分别与两个His中的N和1个O配位，氧化型的漆酶含氧配体可能是H2O或OH－；III型Cu的2个Cu分别与3个His中的N配位，又同时与Tyr中的O配位形成氧桥组成双核铜区。

现有的研究表明铜离子处于漆酶的活性部位，在漆酶的催化氧化过程中起着决定性作用。漆酶是单电子氧化还原酶，它催化不同类型底物氧化反应机理是一种产生自由基的单电子反应，主要表现在底物自由基的生成和漆酶分子中四个铜离子的协同作用。漆酶催化底物氧化反应是通过以下三个主要步骤完成：i)I型Cu从还原型底物接受电子被还原；ii)电子被传递到II型Cu和III型Cu形成T2/T3结构域的三核中心；iii)分子氧被激活并在T2/T3三核结构域被还原成水(Solomon EI,Chen P,Metz M,Lee SK,Palmer AE.Oxygenbinding,activation,and reduction to water by copperproteins.Angew.Chem.Int.Ed,2001,40:4570-4590)。

漆酶是最具有应用前景的氧化还原酶之一，主要用于有机合成、环境污染物的降解和染料脱色、生物检测和电化学分析、造纸工业中的纸浆漂白和废水处理、纤维原料的降解等。漆酶在催化过程中消耗氧气，使得这一过程很容易地被转化为电信号而高灵敏地得到检测，固定化漆酶技术的不断成熟为漆酶在生物检测和生物燃料电池中的应用提供了重要的条件。目前已有报道漆酶电极包括无反应物漆酶电极、双酶电极等。

碳纳米管是以碳原子杂化为主，混合杂化所构建成的理想结构，单壁碳纳米管是理想的分子纤维，可看成是片状石墨烯卷成的圆筒，因此它必然具有石墨级优良的特性，例如耐热性、耐腐蚀性、耐热冲击性、传热和导电性好、高温强度高、有自润滑性和生体相容性等一系列性能。碳纳米管的性能优于当前的任何纤维，它既具有碳纤维的固有性质，又具有金属材料的导电导热性，陶瓷材料的耐热耐蚀性，纺织纤维的柔软性，以及高分子材料的轻度易加工性，是一种一材多能以及一材多用的功能材料和结构材料。碳纳米管由于其唯一的结合立体结构、力学性质、电学和化学性质可作为一种优良的电极修饰材料(BaughmanRH,Zakhidov A,de Heer WA.Carbon nanotubes-The route towardapplications.Science,2002,297:787-792)。当利用碳纳米管对基础电极表面进行修饰时，除了可将材料本身的物理化学性质引入电极表面之外，同时也会获得纳米材料的大比表面积，粒子表面带有较多的功能基团的特性，从而对某些物质的电化学行为产生特有的催化效应。碳纳米管修饰电极的制备方法有碳纳米管糊电极、薄膜修饰电极、溶胶凝胶修饰电极、自组装法修饰电极等(Wang J.Carbon-Nanotubes Based ElectrochemicalBiosensors:AReview.Electroanalysis,2005,17:7-14)。

制约生物检测电极灵敏度和生物燃料电池输出功率密的最大因素是电子传递过程。按照Marcus和Sutin提出的理论，电子转移速率由电势差、重组能和电子供体与受体之间的距离决定，理论和实验均表明，随着传递距离的增加，电子传递速率呈指数级下降。因此，即使将酶固定在电极表面上，仅仅是酶分子蛋白质外壳的厚度就足以对电子由活性中心到电极的直接传递过程产生屏蔽作用。为打破屏蔽，研究者提出借助氧化还原介体，并进行了大量的研究。虽然介体有效地提供了电子迁移的途径，但也引入了新的问题，综合结果不令人满意。现在越来越多的研究者试图寻找一种新的电极材料或制作工艺，实现直接电子传递，借以提高电池功率密度。以酶电极为例，研究者们尝试的直接电子传递的方法主要有以下几种：(l)对酶分子的蛋白质外壳进行改造修饰,使得电子得以自由通过，然后把酶固定在电极上；(2)聚合物固定化酶，导电聚合物就像导线一样，穿过蛋白质外壳，将电极延伸到酶活性中心附近，大大缩短电子传递的距离，从而实现电子直接传递。聚苯胺、聚吡咯、聚丙烯胺、聚乙烯醇、聚醚酰亚胺、聚亚甲基蓝等等先后被各研究者尝试使用；(3)通过在电极表面进行贵金属纳米粒子、以及碳纳米管等物质的修饰，利用纳米粒子独特的尺寸效应、表面效应来实现直接、快速的电子传递(Demin S,Hall EAH.Breaking the barrier tofast electron transfer.Bioelectrochemistry,2009,76,19-27)。

基于漆酶在生物检测和生物燃料电池方面的广阔应用前景，碳纳米管已经被研究者应用于漆酶生物电极和生物燃料电池阴极的相关研究。为了实现直接电子传递，Kashyap等采用碳纳米管修饰的电极进行漆酶的固定化，同时与增加了导电聚合物聚苯胺的碳纳米管电极修饰电极进行比较，表明了导电聚合物能够加速电子传递，提高电流密度(KashyapD,Kim C,Kim SY,Kim YH,KimGM,DwivediPK,SharmaA,Goel S.Multi walled carbonnanotube and polyaniline coated pencil graphite based bio-cathode forenzymatic biofuel cell.International Journal of Hydrogen Energy,2015,40:9515-9522)；Guan等采用点击化学和基因工程的手段通过对酶的修饰实现小漆酶的定向固定化和直接电子传递(Guan DL,Kurra Y,Liu WS,Chen ZL.A click chemistry approach tosite-specific immobilization of a small laccase enables efficient directelectron transfer in a biocathode.Chem.Commun.,2015,51:2522-2525)；Aguila等采用氮掺杂碳纳米管固定化漆酶制备电极用于酚类的生物检测，在一定程度上提高了电极的灵敏度(Aguila SA,Shimomoto D,Ipinza F,Bedolla-Valdez ZI,Romo-Herrera J,Contreras OE,Farias MH,Alonso-Nunez G.A biosensor based on Coriolopsisgallica laccase immobilized on nitrogen-doped multiwalled carbon nanotubesand grapheme oxide for polyphenol detection.Sci.Technol.Adv.Mater.,2015,16:055004)。以上研究表明，单一依靠碳纳米管提高电子传递速率的效果有限；导电聚合物能够加速电子传递，但带来了导电聚合物泄漏的风险，增加了成本，综合效果并不令人满意；酶蛋白分子的修饰作用显著，但过程繁琐，对于不同来源的漆酶不具有普适性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的碳纳米管固定化漆酶的技术单一依靠碳纳米管提高电子传递速率的效果有限；导电聚合物能够加速电子传递，但带来了导电聚合物泄漏的风险，增加了成本，综合效果并不令人满意以及对酶蛋白分子的修饰作用显著，但过程繁琐，对于不同来源的漆酶不具有普适性的缺陷，提供一种基于直接电子传递的碳纳米管固定化漆酶。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种碳纳米管固定化漆酶，采用以下步骤制备：

一、碳纳米管的表面功能化

1)、将碳纳米管进行琥珀酰亚胺基的接枝；

2)、将步骤1)得到的琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管进行氨基三乙酸功能团的接枝；

3)、将步骤2)得到的碳纳米管进行铜离子鳌合修饰；

二、对漆酶进行脱铜离子处理；

三、将表面功能化的碳纳米管和脱除铜离子的漆酶混合，在室温条件下搅拌，进行漆酶固定化反应，然后经离心分离、洗涤后获得碳纳米管固定化漆酶。

进一步的，琥珀酰亚胺基接枝反应溶液包括卤代琥珀酰亚胺、丙酮、碳酸钾、焦亚硫酸钾、羧基化碳纳米管和水。所述卤代琥珀酰亚胺选自N-氯代琥珀酰亚胺，N-溴代琥珀酰亚胺，N-碘代琥珀酰亚胺中的任意1种或至少2种的组合，所述组合例如N-氯代琥珀酰亚胺/N-溴代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺/N-碘代琥珀酰亚胺、N-氯代琥珀酰亚胺/N-溴代琥珀酰亚胺/N-碘代琥珀酰亚胺等；进一步优选为N-氯代琥珀酰亚胺。

以卤代琥珀酰亚胺的重量为1重量份，丙酮的加入量10-50重量份，例如丙酮的重量份数为3、4、5、6、7、8、9等，优选15-45重量份；碳酸钾的加入量0.2-3重量份，例如碳酸钾的重量份数为0.4、0.6、0.8、1.1、1.5、2、2.4、2.8等，优选0.5-2重量份；焦亚硫酸钾的加入量0.5-5重量份，例如焦亚硫酸钾的重量份数为0.7、0.9、1.2、1.6、2.5、2.9、3.5、3.8、4.2、4.5等，优选1-2.5重量份。所述碳纳米管采用从中国科学院成都有机化学有限公司购买的表面羧基化的碳纳米管。以卤代琥珀酰亚胺的重量为1重量份，羧基化碳纳米管的加入量1-15重量份，例如羧基化碳纳米管的重量份数为2、3、5、7、9、11、12、13、14等，优选3-12重量份。

所述水为实验室用水，是本领域技术人员所熟知的实验试剂，本发明所述水优选去离子水、蒸馏水、二次蒸馏水中的任意1中。以卤代琥珀酰亚胺的重量为1重量份，水的加入量为10-100重量份，例如水的重量份数为14、26、37、49、51、65、77、89、90、98、99等，优选30-90重量份。

所述反应溶液采用分步混合，首先，将卤代琥珀酰亚胺溶于丙酮，将碳酸钾、焦亚硫酸钾、羧基化碳纳米管在水中充分混合至无机盐完全溶解；然后将丙酮溶液与水溶液混合用于后续反应。

优选的，所述琥珀酰亚胺基接枝反应溶液按重量份数包括如下组分：

所述的琥珀酰亚胺基接枝反应溶液的各组分的重量份数均以卤代琥珀酰亚胺为1重量份为基准计算得到的。

进一步优选地，所述琥珀酰亚胺基接枝反应溶液按重量份数包括如下组分：

所述的琥珀酰亚胺基接枝反应溶液的各组分的重量份数均以卤代琥珀酰亚胺为1重量份为基准计算得到的。

本发明步骤(1)所述琥珀酰亚胺基接枝反应为：将得到的琥珀酰亚胺基接枝反应溶液搅拌进行接枝反应，然后加入氯仿与水进行萃取分离，然后经洗涤、旋转蒸发得到琥珀酰亚胺基接枝碳纳米管。

优选地，步骤(1)所述琥珀酰亚胺基接枝反应的温度为20-40℃，例如21℃、26℃、28℃、31℃、32℃、37℃、39℃等，温度低于20℃反应速率太慢，温度高于40℃温度太高，反应物容易聚合；反应时间为20-40min，例如24min、26min、28min、31min、33min、37min、39min等，时间小于20min，反应不彻底，反应时间为40min后，基本达到反应平衡；反应搅拌速率300-1000r/min，例如350r/min、430r/min、550r/min、610r/min、680r/min、760r/min、820r/min、880r/min、940r/min、980r/min等，搅拌转速小于300r/min，反应速度慢，易团聚，搅拌转速大于1000r/min，不利于接枝反应的进行，降低接枝率。考虑到步骤(1)的接枝反应的反应温度，所述接枝化反应优选在装有回流装置的反应器中进行。

优选地，步骤(1)反应结束后的溶液中加入氯仿-水的混合物(2:1，v/v)，以卤代琥珀酰亚胺为1重量，氯仿和水混合物的加入量为80-300重量份，例如氯仿-水混合物的重量份数为90、100、120、150、180、230、250、270、290等，进一步优选150-200重量份。反应溶液与氯仿-水混合物充分混合后，静置分层，收集有机相层，用去离子水将有机相洗涤3-5次，去除有机相中的水溶成分，所述去离子水的用量为有机相层体积的1/2。经过洗涤的有机相层进一步旋转蒸发除去有机溶剂氯仿，优选地，旋转蒸发的温度为30-45℃，所获得反应产物即为琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管。

进一步的，所述步骤2)中碳纳米管进行氨基三乙酸功能团的接枝的方法为：

1)、接枝反应溶液的制备

将N,N-二(羧基甲基)-L-赖氨酸水合物和三乙胺加入到二甲基甲酰胺中，搅拌加热回流使其完全溶于二甲基甲酰胺中；优选地，以N,N-二(羧基甲基)-L-赖氨酸水合物为1重量份，三乙胺的用量为2-6重量份，例如三乙胺的重量份数为2.2、2.5、2.7、3.2、3.6、3.9、4.1、4.7、4.9、5.5、5.7、5.9等；二甲基甲酰胺的用量为20-60重量份，例如二甲基甲酰胺的重量份数为21、25、28、29、32、36、38、41、45、49、52、56、59等。

优选地，所述接枝反应溶液的制备在装有回流装置的反应器中进行；所述接枝反应溶液的制备温度为30-50℃，例如32℃、35℃、37℃、39℃、41℃、43℃、46℃、47℃、49℃等；所述接枝反应溶液的制备时间为80-120min，例如83min、88min、91min、95min、101min、105min、109min、112min、115min、117min、119min等；所述接枝反应溶液制备的搅拌速度为100-300r/min，例如120r/min、130r/min、150r/min、190r/min、210r/min、260r/min、280r/min、290r/min等。

2)、将琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管到接枝反应溶液中，搅拌加热回流，接枝反应结束后离心、洗涤、干燥，获得表面氨基三乙酸功能化的碳纳米管。所述接枝反应的温度为30-60℃，例如31℃、34℃、39℃、42℃、45℃、48℃、52℃、57℃、59℃等；所述接枝反应的时间为3-6h，例如3.1h、3.5h、3.7h、3.9h、4.1h、4.3h、4.6h、4.9h、5.2h、5.4h、5.7h、5.9h等；所述接枝反应的搅拌速度为300-600r/min，例如320r/min、330r/min、350r/min、390r/min、410r/min、460r/min、480r/min、490r/min、530r/min、550r/min、570r/min、590r/min等。

优选地，以N,N-二(羧基甲基)-L-赖氨酸水合物为1重量份，琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管的加入量为3-10重量份，例如琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管的重量份数为3.6、4.3、5.1、5.8、6.3、6.9、7.5、8.0、9.5、9.7等；

接枝反应结束后8000-15000r/min离心分离，将得到的沉淀用5-10倍沉淀物体积的二甲基甲酰胺洗涤，再按上述条件离心，重复以上操作3次。将洗涤后的沉淀物放入30-40℃的真空干燥箱干燥除去残留有机溶剂，获得的产物即为表面氨基三乙酸功能化的碳纳米管。

进一步的，步骤(3)所述铜离子螯合反应为：将步骤(2)得到的表面氨基三乙酸功能化的碳纳米管加入到铜离子溶液中，室温条件下振荡反应，经离心分离、水洗涤后获得铜离子鳌合修饰的碳纳米管。

本发明所述铜离子溶液是为了通过铜离子将表面氨基三乙酸功能化的碳纳米管进行螯合修饰，得到铜离子鳌合修饰的碳纳米管。所述铜离子溶液为可溶性的含有二价铜离子的溶液，例如氯化铜溶液、硫酸铜溶液或硝酸铜溶液中的任意1种或至少2种的组合，所述组合例如氯化铜溶液/硫酸铜溶液、硝酸铜溶液/氯化铜溶液、氯化铜溶液/硫酸铜溶液/硝酸铜溶液等。优选地，步骤(3)所述铜离子溶液优选氯化铜溶液。

优选地，步骤(3)所述铜离子溶液的浓度为6-10％(w/v)，例如6.1％、7.5％、8.0％、8.3％、9.2％、9.7％、9.9％等，例如浓度为6.3％(w/v)的硫酸铜溶液和/或浓度为8.25％(w/v)的氯化铜溶液。

优选地，步骤(3)所述表面氨基三乙酸功能化的碳纳米管的浓度优选为5-10％(w/v)，例如5.1％、5.7％、6.1％、6.9％、7.5％、8.0％、8.13％、8.89％、9.11％、9.35％、9.92％等。

进一步的，对漆酶进行脱铜离子处理的方法为：将漆酶加入到含有乙二胺四乙酸二钠的一元醇和水的混合溶液中，搅拌反应后离心，洗涤，收集沉淀，得到脱除铜离子的漆酶。

优选地，所述漆酶选自真菌漆酶中的1种或至少2种的组合，典型但非限制性的实例有Trametes漆酶、Rhizoctonia漆酶、Polyporus漆酶、Pholiota漆酶、Coriolus漆酶、Agaricus漆酶、Podospora漆酶、Neurosporus crassa漆酶或Plebia radiata漆酶等，所述组合例如Agaricus漆酶/Rhizoctonia漆酶、Trametes漆酶/Plebia radiata漆酶/Pholiota漆酶、Coriolus漆酶/Agaricus漆酶/Podospora漆酶等；所述漆酶的浓度为1-5g/L，例如1.1g/L、1.5g/L、1.9g/L、2.23g/L、2.78g/L、2.97g/L、3.2g/L、3.7g/L、4.1g/L、4.5g/L、4.7g/L、4.9g/L等。

进一步的，一元醇和水的混合物中的一元醇为C1-C4的直链或支链烷基一元醇中的任意1种或至少2种的组合，所述一元醇的实例有甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、异丙醇、叔丁醇等，本发明所述一元醇进一步优选自甲醇、乙醇、异丙醇中的任意1种或至少2种的组合，所述组合例如甲醇/乙醇、乙醇/异丙醇/甲醇、异丙醇/乙醇等；所述一元醇和水的混合物中水的含量为3-10％(v/v)，例如3.5％、3.7％、4.6％、5.7％、6.3％、7.1％、8.28％、9.79％等。

进一步的，脱除铜离子反应的温度为10-20℃，例如10.8℃、11.6℃、11.9℃、12.0℃、13.6℃、14.7℃、15.1℃、16.3℃、17.4℃、18.8℃、19.2℃等；所述脱除铜离子反应的搅拌速度为100-300r/min，例如120r/min、130r/min、150r/min、190r/min、210r/min、260r/min、280r/min、290r/min等；所述脱除铜离子反应的时间为60-120min，例如62min、71min、77min、85min、94min、103min、106min、118min、119min等；所述脱除铜离子反应的结束后的经10000-15000r/min离心分离；所述脱除铜离子反应洗涤步骤所用的液体为反应时所用的一元醇和水的混合物，洗涤后离心分离，重复洗涤步骤3次，离心后获得脱除铜离子的漆酶。

进一步的，脱除铜离子的漆酶与表面功能化的碳纳米管进行固定时，将步骤(3)制备获得的铜离子鳌合修饰的碳纳米管与脱除铜离子的漆酶所配置的溶液混合，在室温条件下搅拌，进行漆酶固定化反应，然后经离心分离、洗涤后获得碳纳米管固定化漆酶。

优选的，脱除铜离子的漆酶所配置的溶液为步骤(3)获得的脱除铜离子的漆酶分散一元醇与水的混合物中，所述一元醇与水的混合物的组成与步骤(3)相同；漆酶混合液的浓度为0.2-0.6g/L，例如0.21g/L、0.28g/L、0.32g/L、0.39g/L、0.42g/L、0.47g/L、0.49g/L、0.54g/L、0.58g/L、0.59g/L等；脱除铜离子的漆酶所配置的溶液的pH值范围为2-4，例如漆酶混合液的pH值为2.3、2.4、2.6、2.8、2.9、3.1、3.2、3.5、3.7、3.8、3.9等，pH值的调节通过添加无机酸或无机碱来完成。

优选地，进一步的，脱除铜离子的漆酶与表面功能化的碳纳米管进行固定时，所述铜离子鳌合修饰的碳纳米管的添加量为1-10g/L，例如1.5g/L、1.9g/L、2.1g/L、2.7g/L、3.5g/L、4.3g/L、5.2g/L、6.9g/L、7.4g/L、8.8g/L、9.0g/L、9.9g/L等。

优选地，进一步的，脱除铜离子的漆酶与表面功能化的碳纳米管进行固定时，所述漆酶固化反应的时间为30-60min，例如31min、33min、37min、42min、44min、46min、49min、53min、55min、58min、59min等。

优选地，进一步的，脱除铜离子的漆酶与表面功能化的碳纳米管进行固定时，洗涤所用洗涤液为pH3-4.5的缓冲液。本发明所述缓冲液均为本领域技术人员所熟知的缓冲液，其配制过程简单易操作，本发明中，选用何种缓冲液溶解漆酶，本领域技术人员可以根据自己掌握的专业知识和实际的实验条件进行选择。

本发明的碳纳米管固定化漆酶可以用于生物检测和电化学分析、生物燃料电池、环境污染物的降解和染料脱色、有机合成、废水处理等领域。

本发明中的碳纳米管为羧基化的碳纳米管，本领域技术人员能够获得的不同类型的碳纳米管均可用于本发明，例如单壁碳纳米管，多壁碳纳米管或双壁碳纳米管。同时，表面羧基化的碳纳米管的制备方法也有很多，本领域技术人员完全有能力获得表面羧基化的碳纳米管的制备方法，典型但非限制性的实例有：碳纳米管在H2SO4溶液中经KMnO4氧化而制备。此外，表面羧基化的碳纳米管也可以通过购买商业化的产品获得。

优选地，每克碳纳米管的漆酶负载量为40-80mg，例如46mg/g、50mg/g、53mg/g、61mg/g、68mg/g、73mg/g、78mg/g等。当碳纳米管的漆酶负载量小于40mg/g或大于80mg/g时，固定化漆酶的酶活回收率低，催化能力显著下降。尤其是碳纳米管的漆酶负载量为55-65mg/g时，所制备得到的碳纳米管固定化漆酶的酶活回收率较高。

本发明所述碳纳米管采用从中国科学院成都有机化学有限公司购买的表面羧基化的碳纳米管。

本发明所述的碳纳米管固定化漆酶，通过金属离子鳌和亲和修饰的碳纳米管与脱除铜离子的漆酶活性中心的结合，实现了真正意义的直接电子传递，克服了漆酶蛋白质外壳对电子由活性中心到碳纳米管的直接传递过程产生的屏蔽作用，解决了碳纳米管固定化漆酶催化过程中电子传递速率受限的问题，可提高固定化漆酶在生物检测中的灵敏度，增大固定化漆酶在生物燃料电池应用中的电流密度。该碳纳米管固定化漆酶制备工艺简单，易于放大。碳纳米管的漆酶负载量为55-65mg/g时，所制备得到的碳纳米管固定化漆酶的酶活回收率最高，效果更好。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的碳纳米管固定化漆酶可以实现催化氧化过程中电子在漆酶活性中心和碳纳米管之间的直接传递，解除了漆酶蛋白质外壳对电子直接传递过程产生的屏蔽作用；

(2)本发明提供的碳纳米管固定化漆酶可提高固定化漆酶在生物检测中的灵敏度，增大固定化漆酶在生物燃料电池应用中的电流密度，将酚类测定时的最低检测限降低85％～96％，在生物燃料电池应用中的电流密度提高80％～120％。

(3)本发明提供的漆酶脱除铜离子及活性中心定向固定化的方法，可以用于其他铜离子螯合载体的漆酶固定化，具有很好的应用前景；

(4)本发明提供的碳纳米管固定化漆酶的制备工艺简单，易于放大。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

(1)在室温(约25℃)条件下，将2g卤代琥珀酰亚胺溶于20g丙酮，将0.4g碳酸钾、1g焦亚硫酸钾、2g羧基化碳纳米管在20g水中充分混合至无机盐完全溶解，将丙酮溶液与水溶液混合，20℃，300r/min搅拌20min，加入160g氯仿-水的混合物(2:1，v/v)进行萃取分离，静置分层后取有机相层，用有机相层体积1/2的去离子水将有机相洗涤3次，洗涤过的有机相层30℃旋转蒸发除去氯仿，即获得琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管；

(2)在30℃、100r/min条件下，在装有回流装置的反应器中，加入2g N,N-二(羧基甲基)-L-赖氨酸水合物、4g三乙胺和40g二甲基甲酰胺，加热回流120min，在30℃、300r/min条件下，将6g琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管加入到反应器中，反应3h，将反应液15000r/min离心，沉淀用5倍沉淀物体积的二甲基甲酰胺洗涤3次，放入30℃真空干燥箱干燥即得表面氨基三乙酸功能化的碳纳米管；

(3)将步骤(2)获得的表面氨基三乙酸功能化的碳纳米管加入到6％(w/v)的氯化铜溶液中，碳纳米管浓度为5％(w/v)，室温条件下，100转/分搅拌反应60min，经离心分离、水洗涤后获得铜离子鳌合修饰的碳纳米管；

(4)将漆酶加入到含0.1g/L乙二胺四乙酸二钠的一元醇-水混合物中，漆酶的浓度为1g/L，一元醇-水混合物中含水3％，20℃、100r/min条件下，搅拌反应60min，反应液15000r/min离心20min，含水3％的一元醇-水混合物洗涤3次，所得产物即为脱除铜离子的漆酶；

(5)以步骤(3)得到的铜离子鳌合修饰的碳纳米管作为载体与分散于pH2含水3％的异丙醇-水混合物中的0.2g/L步骤(4)得到脱除铜离子漆酶混合，碳纳米管浓度1g/L，在室温条件下，100r/min搅拌反应60min，经离心、pH3的缓冲液洗涤后，获得碳纳米管固定化漆酶。

固定化酶特性的测试：

基于直接电子传递的碳纳米管固定化漆酶的漆酶负载量为40mg(漆酶)/g(碳纳米管)，酶活回收率为68％，与同等碳纳米管载体固定等量含铜天然漆酶相比，其他应用条件一致的情况下，其应用于酚类测定时的最低检测限降低85％，其应用于生物燃料电池时的电流密度提高85％。

实施例2

(1)在室温(约25℃)条件下，将2g卤代琥珀酰亚胺溶于100g丙酮，将6g碳酸钾、10g焦亚硫酸钾、30g羧基化碳纳米管在200g水中充分混合至无机盐完全溶解，将丙酮溶液与水溶液混合，30℃，1000r/min搅拌30min，加入600g氯仿-水的混合物(2:1，v/v)进行萃取分离，静置分层后取有机相层，用有机相层体积1/2的去离子水将有机相洗涤5次，洗涤过的有机相层45℃旋转蒸发除去氯仿，即获得琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管；

(2)在50℃、300r/min条件下，在装有回流装置的反应器中，加入2g N,N-二(羧基甲基)-L-赖氨酸水合物、12g三乙胺和120g二甲基甲酰胺，加热回流80min，在60℃、500r/min条件下，将6g琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管加入到反应器中，反应4h，将反应液8000r/min离心，沉淀用10倍沉淀物体积的二甲基甲酰胺洗涤3次，放入40℃真空干燥箱干燥即得表面氨基三乙酸功能化的碳纳米管；

(3)将步骤(2)获得的表面氨基三乙酸功能化的碳纳米管加入到10％(w/v)的氯化铜溶液中，碳纳米管浓度为10％(w/v)，室温条件下，200转/分搅拌反应30min，经离心分离、水洗涤后获得铜离子鳌合修饰的碳纳米管；

(4)将漆酶加入到含0.5g/L乙二胺四乙酸二钠的异丙醇-水混合物中，漆酶的浓度为5g/L，一元醇-水混合物中含水10％，10℃、300r/min条件下，搅拌反应120min，反应液10000r/min离心30min，含水10％的异丙醇-水混合物洗涤3次，所得产物即为脱除铜离子的漆酶；

(5)以步骤(3)得到的铜离子鳌合修饰的碳纳米管作为载体与分散于pH4含水10％的一元醇-水混合物中的0.6g/L步骤(4)得到的脱除铜离子漆酶混合，碳纳米管浓度10g/L，在室温条件下，200r/min搅拌反应30min，经离心、pH4.5的缓冲液洗涤后，获得碳纳米管固定化漆酶。

固定化酶特性的测试：

基于直接电子传递的碳纳米管固定化漆酶的漆酶负载量为80mg(漆酶)/g(碳纳米管)，酶活回收率为70％，与同等碳纳米管载体固定等量含铜天然漆酶相比，其他应用条件一致的情况下，其应用于酚类测定时的最低检测限降低82％，其应用于生物燃料电池时的电流密度提高80％。

实施例3

(1)在室温(约25℃)条件下，将2g卤代琥珀酰亚胺溶于30g丙酮，将1g碳酸钾、2g焦亚硫酸钾、6g羧基化碳纳米管在60g水中充分混合至无机盐完全溶解，将丙酮溶液与水溶液混合，40℃，550r/min搅拌40min，加入200g氯仿-水的混合物(2:1，v/v)进行萃取分离，静置分层后取有机相层，用有机相层体积1/2的去离子水将有机相洗涤4次，洗涤过的有机相层40℃旋转蒸发除去氯仿，即获得琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管；

(2)在35℃、250r/min条件下，在装有回流装置的反应器中，加入2g N,N-二(羧基甲基)-L-赖氨酸水合物、6g三乙胺和60g二甲基甲酰胺，加热回流90min，在50℃、600r/min条件下，将8g琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管加入到反应器中，反应3.5h，将反应液12000r/min离心，沉淀用6倍沉淀物体积的二甲基甲酰胺洗涤3次，放入35℃真空干燥箱干燥即得表面氨基三乙酸功能化的碳纳米管；

(3)将步骤(2)获得的表面氨基三乙酸功能化的碳纳米管加入到8％(w/v)的氯化铜溶液中，碳纳米管浓度为7％(w/v)，室温条件下，150转/分搅拌反应40min，经离心分离、水洗涤后获得铜离子鳌合修饰的碳纳米管；

(4)将漆酶加入到含0.2g/L乙二胺四乙酸二钠的一元醇-水混合物中，漆酶的浓度为2g/L，一元醇-水混合物中含水4％，12℃、180r/min条件下，搅拌反应100min，反应液11000r/min离心28min，含水4％的一元醇-水混合物洗涤3次，所得产物即为脱除铜离子的漆酶；

(5)以步骤(3)得到的铜离子鳌合修饰的碳纳米管作为载体与分散于pH3含水4％的一元醇-水混合物中的0.3g/L步骤(4)得到脱除铜离子漆酶混合，碳纳米管浓度3g/L，在室温条件下，150r/min搅拌反应40min，经离心、pH3.5的缓冲液洗涤后，获得碳纳米管固定化漆酶。

固定化酶特性的测试：

基于直接电子传递的碳纳米管固定化漆酶的漆酶负载量为48mg(漆酶)/g(碳纳米管)，酶活回收率为85％，与同等碳纳米管载体固定等量含铜天然漆酶相比，其他应用条件一致的情况下，其应用于酚类测定时的最低检测限降低90％，其应用于生物燃料电池时的电流密度提高95％。

实施例4

(1)在室温(约25℃)条件下，将2g卤代琥珀酰亚胺溶于90g丙酮，将4g碳酸钾、5g焦亚硫酸钾、24g羧基化碳纳米管在180g水中充分混合至无机盐完全溶解，将丙酮溶液与水溶液混合，25℃，800r/min搅拌30min，加入500g氯仿-水的混合物(2:1，v/v)进行萃取分离，静置分层后取有机相层，用有机相层体积1/2的去离子水将有机相洗涤3次，洗涤过的有机相层35℃旋转蒸发除去氯仿，即获得琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管；

(2)在35℃、280r/min条件下，在装有回流装置的反应器中，加入2g N,N-二(羧基甲基)-L-赖氨酸水合物、10g三乙胺和100g二甲基甲酰胺，加热回流105min，在40℃、350r/min条件下，将6g琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管加入到反应器中，反应6h，将反应液11000r/min离心，沉淀用9倍沉淀物体积的二甲基甲酰胺洗涤3次，放入33℃真空干燥箱干燥即得表面氨基三乙酸功能化的碳纳米管；

(3)将步骤(2)获得的表面氨基三乙酸功能化的碳纳米管加入到7％(w/v)的氯化铜溶液中，碳纳米管浓度为6％(w/v)，室温条件下，150转/分搅拌反应35min，经离心分离、水洗涤后获得铜离子鳌合修饰的碳纳米管；

(4)将漆酶加入到含0.3g/L乙二胺四乙酸二钠的一元醇-水混合物中，漆酶的浓度为3g/L，一元醇-水混合物中含水5％，15℃、260r/min条件下，搅拌反应70min，反应液12000r/min离心25min，含水5％的一元醇-水混合物洗涤3次，所得产物即为脱除铜离子的漆酶；

(5)以步骤(3)得到的铜离子鳌合修饰的碳纳米管作为载体与分散于pH2含水5％的异丙醇-水混合物中的0.55g/L步骤(4)得到脱除铜离子漆酶混合，碳纳米管浓度9g/L，在室温条件下，120r/min振荡反应50min，经离心、pH4的缓冲液洗涤后，获得碳纳米管固定化漆酶。

固定化酶特性的测试：

基于直接电子传递的碳纳米管固定化漆酶的漆酶负载量为69mg(漆酶)/g(碳纳米管)酶活回收率为88％，与同等碳纳米管载体固定等量含铜天然漆酶相比，其他应用条件一致的情况下，其应用于酚类测定时的最低检测限降低89％，其应用于生物燃料电池时的电流密度提高98％。

实施例5

(1)在室温(约25℃)条件下，将2g卤代琥珀酰亚胺溶于40g丙酮，将2g碳酸钾、3g焦亚硫酸钾、10g羧基化碳纳米管在100g水中充分混合至无机盐完全溶解，将丙酮溶液与水溶液混合，35℃，600r/min搅拌36min，加入300g氯仿-水的混合物(2:1，v/v)进行萃取分离，静置分层后取有机相层，用有机相层体积1/2的去离子水将有机相洗涤5次，洗涤过的有机相层30℃旋转蒸发除去氯仿，即获得琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管；

(2)在45℃、200r/min条件下，在装有回流装置的反应器中，加入2g N,N-二(羧基甲基)-L-赖氨酸水合物、8g三乙胺和80g二甲基甲酰胺，加热回流100min，在45℃、450r/min条件下，将13g琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管加入到反应器中，反应5h，将反应液10000r/min离心，沉淀用6倍沉淀物体积的二甲基甲酰胺洗涤3次，放入35℃真空干燥箱干燥即得表面氨基三乙酸功能化的碳纳米管；

(3)将步骤(2)获得的表面氨基三乙酸功能化的碳纳米管加入到9％(w/v)的氯化铜溶液中，碳纳米管浓度为8％(w/v)，室温条件下，130转/分搅拌反应55min，经离心分离、水洗涤后获得铜离子鳌合修饰的碳纳米管；

(4)将漆酶加入到含0.4g/L乙二胺四乙酸二钠的一元醇-水混合物中，漆酶的浓度为4g/L，一元醇-水混合物中含水7％，16℃、200r/min条件下，搅拌反应80min，反应液10500r/min离心28min，含水7％的一元醇-水混合物洗涤3次，所得产物即为脱除铜离子的漆酶；

(5)以步骤(3)得到的铜离子鳌合修饰的碳纳米管作为载体与分散于pH2含水7％的异丙醇-水混合物中的0.4g/L步骤(4)得到脱除铜离子漆酶混合，碳纳米管浓度7g/L，在室温条件下，180r/min搅拌反应35min，经离心、pH3.8的缓冲液洗涤后，获得碳纳米管固定化漆酶。

固定化酶特性的测试：

基于直接电子传递的碳纳米管固定化漆酶的漆酶负载量为55mg(漆酶)/g(碳纳米管)酶活回收率为91％，与同等碳纳米管载体固定等量含铜天然漆酶相比，其他应用条件一致的情况下，其应用于酚类测定时的最低检测限降低96％，其应用于生物燃料电池时的电流密度提高120％。

实施例6

(1)在室温(约25℃)条件下，将2g卤代琥珀酰亚胺溶于80g丙酮，将3g碳酸钾、4g焦亚硫酸钾、20g羧基化碳纳米管在160g水中充分混合至无机盐完全溶解，将丙酮溶液与水溶液混合，38℃，400r/min搅拌35min，加入360g氯仿-水的混合物(2:1，v/v)进行萃取分离，静置分层后取有机相层，用有机相层体积1/2的去离子水将有机相洗涤4次，洗涤过的有机相层36℃旋转蒸发除去氯仿，即获得琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管；

(2)在40℃、230r/min条件下，在装有回流装置的反应器中，加入2g N,N-二(羧基甲基)-L-赖氨酸水合物、9g三乙胺和90g二甲基甲酰胺，加热回流88min，在50℃、400r/min条件下，将15g琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管加入到反应器中，反应5h，将反应液9000r/min离心，沉淀用7倍沉淀物体积的二甲基甲酰胺洗涤3次，放入37℃真空干燥箱干燥即得表面氨基三乙酸功能化的碳纳米管；

(3)将步骤(2)获得的表面氨基三乙酸功能化的碳纳米管加入到8.5％(w/v)的氯化铜溶液中，碳纳米管浓度为7.5％(w/v)，室温条件下，180转/分搅拌反应32min，经离心分离、水洗涤后获得铜离子鳌合修饰的碳纳米管；

(4)将漆酶加入到含0.25g/L乙二胺四乙酸二钠的一元醇-水混合物中，漆酶的浓度为2.5g/L，一元醇-水混合物中含水8％，13℃、260r/min条件下，搅拌反应90min，反应液13000r/min离心23min，含水8％的一元醇-水混合物洗涤3次，所得产物即为脱除铜离子的漆酶；

(5)以步骤(3)得到的铜离子鳌合修饰的碳纳米管作为载体与分散于pH2含水8％的异丙醇-水混合物中的0.5g/L步骤(4)得到脱除铜离子漆酶混合，碳纳米管浓度9g/L，在室温条件下，190r/min搅拌反应30min，经离心、pH3.3的缓冲液洗涤后，获得碳纳米管固定化漆酶。

固定化酶特性的测试：

基于直接电子传递的碳纳米管固定化漆酶的漆酶负载量为65mg(漆酶)/g(碳纳米管)酶活回收率为92％，与同等碳纳米管载体固定等量含铜天然漆酶相比，其他应用条件一致的情况下，其应用于酚类测定时的最低检测限降低95％，其应用于生物燃料电池时的电流密度提高115％。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (4)

1.一种碳纳米管固定化漆酶，其特征在于，采用以下步骤制备：

一、碳纳米管的表面功能化

1)、将碳纳米管进行琥珀酰亚胺基的接枝；

2)、将步骤1)得到的琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管进行氨基三乙酸功能团的接枝；

3)、将步骤2)得到的碳纳米管进行铜离子鳌合修饰；

二、对漆酶进行脱铜离子处理；

三、将表面功能化的碳纳米管和脱除铜离子的漆酶混合，在室温条件下搅拌，进行漆酶固定化反应，然后经离心分离、洗涤后获得碳纳米管固定化漆酶；

所述碳纳米管进行琥珀酰亚胺基的接枝的方法为：

1)、将1重量份的卤代琥珀酰亚胺完全溶解于15～45重量份的丙酮；

2)、将0.5～2重量份碳酸钾、1～2.5焦亚硫酸钾、3～12份羧基化碳纳米管

在30～90重量份的水中充分混合至无机盐完全溶解；

3)、将1)与2)溶液混合，在20～40℃下，搅拌速率为300-1000r/min，反应20-40min；

4)、加入氯仿与水进行萃取分离，然后经洗涤、旋转蒸发得到琥珀酰亚胺基接枝碳纳米管；

所述碳纳米管进行氨基三乙酸功能团接枝的方法为：

1)、接枝反应溶液的制备

将N,N-二(羧基甲基)-L-赖氨酸水合物和三乙胺加入到二甲基甲酰胺中，搅拌加热回流使二者完全溶于二甲基甲酰胺中；

2)、将琥珀酰亚胺基接枝的碳纳米管放入接枝反应溶液中，搅拌加热回流，接枝反应结束后离心、洗涤、干燥，获得表面氨基三乙酸功能化的碳纳米管；所述接枝反应溶液包括1重量份的N,N-二(羧基甲基)-L-赖氨酸水合物、2～6重量份的三乙胺和20～60重量份的二甲基甲酰胺，接枝反应的温度为30～60℃；

对漆酶进行脱铜离子处理的方法为：将漆酶加入到含有乙二胺四乙酸二钠的一元醇和水的混合溶液中，搅拌反应后离心，洗涤，收集沉淀，得到脱除铜离子的漆酶；

所述的一元醇为C1-C4的直链或支链烷基一元醇中的任意1种或几种的组合；所述一元醇和水的混合物中水的含量为3-10％(v/v)；乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.1-0.5g/L；

脱除铜离子的反应温度为10～20℃，搅拌速度为100～300r/min，反应时间为60-120min。

2.如权利要求1任一项所述的一种碳纳米管固定化漆酶，其特征在于，接枝反应的搅拌速度为300～600r/min，反应时间为3～6h。

3.如权利要求1所述的一种碳纳米管固定化漆酶，其特征在于，所述的碳纳米管为羧基化的碳纳米管，每克碳纳米管上漆酶负载量为40～80mg。

4.如权利要求1所述的碳纳米管固定化漆酶用于生物检测和电化学分析、生物燃料电池、环境污染物的降解和染料脱色、有机合成、废水处理。