CN103450496A

CN103450496A - 固定化漆酶微球载体及其制备方法及应用

Info

Publication number: CN103450496A
Application number: CN2012101766080A
Authority: CN
Inventors: 施汉昌; 白雪; 王青; 李冰
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2032-05-31
Also published as: CN103450496B

Abstract

本发明公开了一种固定化酶微球载体及其制备方法与应用。该制备固定化漆酶载体的方法，包括如下步骤：将聚乙烯醇微球进行磷酸化改性，得到所述固定化漆酶载体。本发明提供的固定化漆酶微球载体，可与漆酶发生化学偶联、螯合反应。本发明的固定化漆酶载体不仅可用于工业废水的处理，还可应用于环境监测领域，具有比表面积大、粒径小、生物相容性好、物理化学性能稳定、成本低廉等特点。

Description

固定化漆酶微球载体及其制备方法及应用

技术领域

本发明属于及环境监测领域，涉及一种固定化酶微球载体及其制备方法与应用。

背景技术

漆酶是一种结合多个铜离子的蛋白质，广泛存在于植物、真菌甚至昆虫体内。漆酶具有相当宽泛的底物专一性和较好的稳定性，能催化许多酚类、芳香胺类物质、羧酸类、甾体激素和生物色素、金属有机化学物等，且反应产物是水，绿色、环保。因而在废水处理、纸浆漂白、生物传感器和生物监测等方面具有较大的应用潜力。但是漆酶存在价格较高，易受各种环境因素的干扰变性失活，不可重复利用等缺点。

漆酶的固定化可以实现漆酶的重复性使用和稳定性使用。固定化漆酶主要有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法四种方法：1）吸附法固定漆酶具有吸附条件温和、简便，成本低，载体可反复使用的优点。但是这种方法固定的漆酶存在对离子强度、pH、温度等因子敏感的缺点。2）载体与漆酶共价偶联的方法有很多，且固定化的漆酶非常稳定，损漏少。但是偶联试剂对漆酶有一定毒性，易引起漆酶失效，成本较高。3）交联法可用的交联试剂多，技术简易；稳定性较高。但是交联条件较激烈，常出现扩散限制，使用有一定难度。4）包埋法可进行大量的固定化，并可做成任意大小。缺点是仅可用于低分子量的底物，不适用于柱系统，反应常受扩散限制。

近年来，不同类型载体固定化漆酶的方法和应用成为研究热点。国内外常采用的固定化载体包括壳聚糖、硅胶、活性炭、高分子滤膜、电纺纤维等材料。但现有的酶固定化材料不同程度存在酶的固定化效率低、可分离性差、操作工艺复杂、成本较高等问题。如此硅胶活性炭等材料作为载体，存在与水分离、亲水表面与酶链接不紧密等问题；而高分子滤膜、壳聚糖、电纺纤维等存在生物相容性不好、机械强度差、且操作过程复杂等问题。目前，各种漆酶检测仪反应器中的固定化酶载体大多为玻璃珠微球等无机载体。然而，玻璃珠表面功能化比较困难，且生物相容性不好。

发明内容

本发明的目的是提供一种固定化酶微球载体及其制备方法与应用。

本发明提供的制备固定化漆酶载体的方法，包括如下步骤：将聚乙烯醇微球进行磷酸化改性，得到所述固定化漆酶载体。

上述方法中，所述聚乙烯醇微球的粒径为10-1000μm；

所述聚乙烯醇微球的制备方法为反相悬浮交联法。

所述反相悬浮交联法包括如下步骤：将聚乙烯醇和水于沸水浴中混匀至溶解，冷却至30-80°C后再加入液体石蜡，室温搅拌后再加入酸溶液和戊二醛的水溶液搅拌离心分离后得到所述聚乙烯醇微球；

所述聚乙烯醇、水和液体石蜡的用量比为1g：7.5-15mL：15-50mL，优选1g：10mL：20mL；

所述室温搅拌步骤中，转速为200-2000rpm，优选500rpm；搅拌桨半径为2cm；时间为0.5-24小时，优选2小时；

所述酸溶液的浓度为0.1-1mol/L，优选1mol/L；所述戊二醛的水溶液的质量百分浓度为10-100%，优选50%；

所述搅拌离心分离的搅拌步骤中，转速为200-2000rpm，优选500rpm；搅拌桨半径为2cm；时间为10-60分钟，优选30分钟；所述离心分离步骤中，转速为1000-10000rpm，优选4000rpm，离心机半径为13.5cm。

上述固定化漆酶载体的方法中，所述磷酸化改性步骤包括：将所述聚乙烯醇微球浸于溶质为磷酸水溶液和脲、溶剂为水的溶液中，水洗至中性。

所述磷酸水溶液的质量百分浓度为80-98%；

所述聚乙烯醇微球、磷酸水溶液、脲和水的用量比为1g：5-50mL：1-10g：0.1-10L，优选1g：10mL：3g：1L；

所述浸泡步骤中，时间为10-3000分钟，优选30分钟。

按照上述方法制备得到的固定化漆酶载体，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种固定化漆酶的方法，该方法，包括如下步骤：将前述本发明提供的固定化漆酶载体、漆酶与缓冲溶液混合静置。

该方法中，所述缓冲溶液的pH值为2-8，优选4.5；所述缓冲溶液选自乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸氢二钠–柠檬酸和柠檬酸–柠檬酸钠中的至少一种；

所述静置步骤中，时间为1-48小时，优选24小时。

按照上述方法得到的固定化的漆酶及所述固定化的漆酶在环境监测或废水处理中的应用，也属于本发明的保护范围。

上述本发明提供的制备固定化漆酶载体和固定化漆酶的反应方程式如图1所示：

1.反相悬浮交联法制备聚乙烯醇微球及磷酸化方法（图1a）

2.聚乙烯醇微球的醛基与漆酶反应固定漆酶原理（注：漆酶内的2价铜离子可以转变成1价，以下同）（图1b）

3.聚乙烯醇微球的磷酸根基团与漆酶的铜离子活性中心发生螯合吸附（图1c）

本发明克服现有固定化漆酶载体的不足，提供了一种漆酶固定化载体，该载体是通过反相悬浮交联的方式制备PVA微球，能与漆酶发生化学偶联作用，经磷酸功能化之后可与漆酶发生螯合作用。其制备原理如下在PVA和漆酶的水溶液中加入液体石蜡，形成水油两相，搅拌后的水相以小液滴的形态悬浮于油相中。

本发明的优点在于：（1）本发明提供的固定化漆酶载体，制备工艺简单，成本低廉；（2）本发明提供的固定化漆酶载体固定漆酶时条件温和，只需静置；（3）本发明提供的固定化漆酶酶活高，受温度和pH影响较小；(4)本发明提供的固定漆酶载体可应用于环境监测领域。

附图说明

图1为本发明提供的制备固定化漆酶载体和固定化漆酶的反应方程式。

图2为实施例1中PVA微球的SEM图。

图3为实施例2中PVA微球的SEM图。

图4为固定化漆酶用于酶热仪中BPA浓度检测标准曲线。

图5为PVA微球固定化漆酶用于酶热仪检测水环境中ABTS浓度

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。

实施例1、固定化漆酶的制备

1）制备固定化的漆酶载体：

先将3g PVA（1799）在30ml水中溶解，在沸水浴中用机械搅拌1小时，撤离沸水浴，待反应物冷却至50°C，加入60ml液体石蜡。室温条件下，将混合液在500rpm（搅拌桨半径为2cm）下搅拌2小时使形成微球，然后在三颈圆底烧瓶中加入1ml 1mol L^-1的盐酸溶液和2ml质量百分浓度为50%的戊二醛水溶液，转速500rpm（搅拌桨半径为2cm），搅拌30分钟后，在转速4000rpm（离心机半径为13.5cm）下离心分离出微球，用石油醚洗三次，然后真空干燥48小时，得到聚乙烯醇微球，该聚乙烯醇微球如图2所示。由图2可知，用以上方法制备的微球表面光滑，球体形状规则，该微球的粒径为29.5μm。

再将10ml磷酸、3g脲溶于1L水中，加入1g前述所得PVA微球浸泡30分钟，离心，水洗直至载体被洗成中性，得到固定化的漆酶载体；

2）固定化漆酶

称取1g所得固定化的漆酶载体和20mg漆酶放入10mL HAC-NaAC缓冲液(pH值为4.5)中，放置24小时，用水洗干净后即可使用，得到本发明提供的固定化的漆酶。

该实施例制备所得固定化的漆酶的酶活性测试方法采用以3-乙基苯并噻唑-6-磺酸（ABTS）为底物，测定酶对其的氧化速度。取固定化漆酶0.1g，加入Hac-NaAc（pH4.5）缓冲液2.5ml，混匀，加入ABTS 0.4ml，放置30s，每15s读取一次420nm下吸光值。共读取6～7个数值。以经验判断，若吸光值增长迅速，则将固定化漆酶量降低2～5倍再次测定，直至吸光值数值变化不是太快，且数值均在0.2～0.8之间。酶活的计算：吸光度变化的斜率×4000×稀释倍数。得到该实施例制备所得固定化的漆酶的酶活性为154U/g。

实施例2、固定化漆酶的制备

1）制备固定化的漆酶载体：

先将3g PVA（1799）在40ml水中溶解，在沸水浴中用机械搅拌2小时，撤离沸水浴，待反应物冷却至80°C，加入80ml液体石蜡。室温条件下，将混合液在1000rpm（搅拌桨半径为2cm）下搅拌24小时使形成微球，然后在三颈圆底烧瓶中加入2ml1mol L^-1的盐酸溶液和3ml质量百分浓度为50%的戊二醛水溶液，转速1000rpm（搅拌桨半径为2cm），搅拌60分钟后，在转速10000rpm（离心机半径为13.5cm）下离心分离出微球，用石油醚洗三次，然后真空干燥48小时，得到聚乙烯醇微球，该聚乙烯醇微球如图3所示。由图3可知，用以上方法制备的微球表面光滑，球体形状规则，该微球的平均粒径为22.7μm。

再将15ml磷酸，5g脲溶于1L水中，加入1g PVA微球浸泡3000分钟，离心，水洗直至载体被洗成中性。

2）固定化漆酶

称取1g所得微球和2mg漆酶放入10mL HAC-NaAC缓冲液(pH 7.0)中，放置48小时，用水洗干净后即可使用，得到本发明提供的固定化的漆酶。

按照与实施例1相同的方法测定酶活性，得到该实施例制备所得固定化的漆酶的酶活性为133U/g。

实施例3、固定化漆酶的热稳定性

分别将实施例1制备所得固定化漆酶与游离漆酶置于30°C-70°C的水浴中保温6h，取样检测其酶活性，酶活性检测同实施例1。

结果表明，固定化漆酶的最适温度为40°C，比游离酶最适温度30°C有所升高，且在30°C-70°C内，固定化漆酶酶活高于游离漆酶酶活，特别在70°C时，固定化漆酶保留酶活仍能达到40.7%，而游离漆酶酶活仅为7.4%，显示漆酶经固定化后其热稳定性显著提高。

实施例4、固定化漆酶的pH稳定性

取适量实施例1制备所得固定化漆酶与游离漆酶，分别悬浮于不同pH的乙酸缓冲溶液中，室温条件下保存6小时，取样检测其酶活性。

结果表明，在pH 2.0—9.0范围内，固定化漆酶保留酶活在40%以上，而游离漆酶的酶活性受pH影响较大，在pH＝2.0时，酶活损失80%。

实施例5、微球载体在酶热仪中的应用

采用固定化漆酶降解双酚A（BPA）的酶反应热力学来检测分析BPA的浓度，仪器选用武汉欧米克生物科技公司开发的酶热生物分析仪（Enzyme Thermistor）。

在水样检测分析中，缓冲液通过流动泵连续注入，待测水样通过加样器定量进样，与缓冲液在进样阀混合后进入酶反应柱。水样进入固定化漆酶反应柱会与漆酶发生酶促反应，此时反应器内的温度会发生变化，温度变化（ΔT）遵循如下公式：

ΔT=-nΔH/Cs

其中，n为分析物的摩尔浓度，ΔH为热焓量，Cs为热容量。所用固定化漆酶为实施例1制备所得。

图4为PVA微球固定化漆酶用于酶热仪检测水环境中BPA浓度。由图4可知，BPA浓度与酶热仪检测到的热量信号有良好的线性关系，证明实施例1所得的PVA微球载体固定化漆酶在酶热仪中应用是可行的。

实施例6、固定化漆酶的热稳定性

分别将实施例2制备所得固定化漆酶与游离漆酶置于30°C70°C的水浴中保温6h，取样检测其酶活性，酶活性检测同实施例3。

结果表明，固定化漆酶的最适温度为40°C，比游离酶最适温度30°C有所升高，且在30°C-70°C内，固定化漆酶酶活高于游离漆酶酶活，特别在70°C时，固定化漆酶保留酶活为43.5%，而游离漆酶酶活仅为7.4%，显示漆酶经固定化后其热稳定性显著提高。

实施例7、固定化漆酶的pH稳定性

取适量实施例2制备所得固定化漆酶与游离漆酶，分别悬浮于不同pH的乙酸缓冲溶液中，室温条件下保存6小时，取样检测其酶活性。

结果表明，在pH 2.0-9.0范围内，固定化漆酶保留酶活在43%以上，而游离漆酶的酶活性受pH影响较大，在pH=2.0时，酶活损失80%。

实施例8、微球载体在酶热仪中的应用

采用固定化漆酶降解3-乙基苯并噻唑-6-磺酸（ABTS）的酶反应热力学来检测分析ABTS的浓度，仪器选用武汉欧米克生物科技公司开发的酶热生物分析仪（EnzymeThermistor）。所用固定化漆酶为实施例2制备所得。检测方法同实施例5。

图5为PVA微球固定化漆酶用于酶热仪检测水环境中ABTS浓度。由图5可知，ABTS浓度与酶热仪检测到的热量信号有良好的线性关系，证明实施例2所得PVA微球载体固定化漆酶在酶热仪中应用是可行的。

Claims

1.一种制备固定化漆酶载体的方法，包括如下步骤：将聚乙烯醇微球进行磷酸化改性，得到所述固定化漆酶载体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述聚乙烯醇微球的粒径为10-1000μm；

所述聚乙烯醇微球的制备方法为反相悬浮交联法。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述反相悬浮交联法包括如下步骤：将聚乙烯醇和水于沸水浴中混匀至溶解，冷却至30-80°C后再加入液体石蜡，室温搅拌后再加入酸溶液和戊二醛的水溶液搅拌离心分离后得到所述聚乙烯醇微球；

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述磷酸化改性步骤包括：将所述聚乙烯醇微球浸于溶质为磷酸水溶液和脲、溶剂为水的溶液中，再水洗至中性。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述磷酸水溶液的质量百分浓度为80-98%；

所述浸泡步骤中，时间为10-3000分钟，优选30分钟。

6.权利要求1-5任一所述方法制备得到的固定化漆酶载体。

7.一种固定化漆酶的方法，包括如下步骤：将权利要求6所述固定化漆酶载体、漆酶与缓冲溶液混合静置。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述缓冲溶液的pH值为2-8，优选4.5；所述缓冲溶液选自乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸和柠檬酸-柠檬酸钠中的至少一种；

所述静置步骤中，时间为1-48小时，优选24小时。

9.权利要求7或8所得固定化的漆酶。

10.权利要求9所述固定化的漆酶在环境监测或废水处理中的应用。