CN111705052A - 一种厌氧固定化菌剂、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于环境工程材料领域,具体涉及一种厌氧固定化菌剂、制备方法及其应用,选用四种不同的厌氧功能菌种,利用纯菌培养技术得到相应的培养菌液,然后按照一定体积比将四种培养菌液进行混合获得复合功能菌液,随后浓缩为功能菌群沉淀,再将功能菌群沉淀溶解在聚乙烯醇水溶液中,将该溶液滴入第一缓冲溶液中得到聚乙烯醇凝胶珠,得到的胶珠放入含有硫酸盐的第二缓冲溶液中得到硫酸盐改性聚乙烯醇凝胶珠,即厌氧固定化菌剂。本发明所提供的制备方法简单、能耗低,得到的厌氧固定化菌剂耐酸耐氨,可以显著增强厌氧消化反应器内部菌群对已积累有机酸的处理能力,解决了功能菌种流失和厌氧消化菌群自我恢复能力差的问题。
Description
技术领域
本发明属于环境工程材料领域,具体涉及一种厌氧固定化菌剂、制备方法及其应用。
背景技术
作为有效的生物处理技术之一,厌氧消化不仅可以控制易降解生物质废物的环境污染,也可以将其含有的有机物转化为以甲烷为主的能源气体。当进料为高含固率的生物质废物(如餐厨垃圾、禽畜粪便和污水厂污泥等)时,以乙酸为主的有机酸很容易在厌氧消化反应器中快速积累,引起对产甲烷菌的酸抑制现象,造成甲烷化过程不稳定,甚至反应器运行失败等问题。特别是当同时发生氨抑制的情况下,氨抑制会进一步加剧有机酸积累问题,形成氨和有机酸双重抑制。
针对上述有机酸快速积累的问题,生物强化措施通过外加菌群至厌氧消化反应器,以提高脂类降解速率、消耗过量有机酸、缩短甲烷化过程迟滞期,最终恢复反应器正常运行能力。目前,生物强化措施主要存在四大问题:1.悬浮培养模式易造成外加功能菌群的流失;2.外加菌群难以适应反应器内部的物化条件,会迅速死亡,或者其竞争优势被反应器内部的土著微生物超越;3.外加菌群结构不特异,单一菌种容易死亡,复合菌种缺乏协同代谢,导致效率不高,需要提高接种量和接种频率;4.厌氧纯菌种培养难度大,世代时间长,无法满足大型反应器的大规模需要;5.外加菌群不耐受高氨浓度,无法解除氨抑制条件下的有机酸积累问题。近年来,国内发展了一系列方法来解除厌氧消化反应器有机酸抑制,例如公开号为CN202089962U、CN110184171A、CN201644487U和CN201644487U的中国专利设计了新式厌氧消化反应器,但此类技术并不适用于已发生有机酸抑制的厌氧消化反应器。公开号为CN107475304A、CN109554402A和CN109182390A的中国发明专利投加了碳材料,但此类技术需不断补充碳材料来弥补碳材料的流失,同时碳材料浸出物对微生物也有潜在的毒害作用。公开号为CN102992478B的中国发明专利添加了离子交换树脂装置,但此类技术需对离子交换树脂进行再生,也需对再生废液进行处理,增加了处理成本。公开号为CN103014070B的中国发明专利制备了以液化酶、糖化酶、纤维素酶和脂肪酶为主的复合酶剂,公开号为CN106085926A的中国发明专利制备了以Pelotomaculum schinkii(施氏暗色厌氧香肠状菌)为主的复合菌剂,此类技术通过促进微生物代谢作用,进而缓解有机酸抑制,但此类技术均没有实现酶剂和厌氧菌剂的固定化,致使酶剂和菌剂流失,削弱作用效果。而利用固定化菌剂原位解除厌氧消化有机酸抑制的方法则未见报道。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的,目的在于提供一种厌氧固定化菌剂、制备方法及其应用。
本发明提供了一种厌氧固定化菌剂的制备方法,具有这样的特征,包括以下步骤:步骤1,在一定温度下对四种不同的厌氧功能菌种分别进行厌氧培养得到相应的培养菌液,按照一定体积比将不同的培养菌液进行混合获得复合功能菌液;步骤2,将复合功能菌液进行浓缩获得功能菌群沉淀;步骤3,将功能菌群沉淀溶解在聚乙烯醇水溶液中得到功能菌群聚乙烯醇溶液,然后将功能菌群聚乙烯醇溶液滴入第一缓冲溶液中,得到聚乙烯醇凝胶珠;步骤4,将聚乙烯醇凝胶珠放在含有硫酸盐的第二缓冲溶液中,得到硫酸盐改性聚乙烯醇凝胶珠,即厌氧固定化菌剂,其中,厌氧功能菌种分别为解蛋白嗜热粪杆菌、棕色嗜热产醋菌、巴氏甲烷八叠球菌以及热自养甲烷热杆菌。
在本发明提供的厌氧固定化菌剂的制备方法中,还可以具有这样的特征:其中,聚乙烯醇水溶液中聚乙烯醇的质量分数为10%-15%,步骤1中的复合功能菌液与步骤3中的聚乙烯醇水溶液的体积比为10:1-20:1。
在本发明提供的厌氧固定化菌剂的制备方法中,还可以具有这样的特征:其中,每升第一缓冲溶液中包含0.15mol-0.2mol的Na2HPO4,0.2mol-0.25mol的NaH2PO4,及50g-60g的H3BO3,每升第二缓冲溶液中包含1mol-1.5mol的Na2SO4,厌氧固定化菌剂的直径为0.5cm-1cm。
本发明还提供了一种厌氧固定化菌剂,由厌氧固定化菌剂的制备方法制备得到,其中,厌氧固定化菌剂为由薄膜包裹凝胶物形成的圆形凝珠,圆形凝珠的直径为0.5cm-1cm。
本发明还提供了一种厌氧固定化菌剂在厌氧消化中的应用。
在本发明提供的厌氧固定化菌剂在厌氧消化中的应用中,还可以具有这样的特征:其中,在一定温度下,利用纯菌培养技术将四种厌氧功能菌种分别培养得到相应的培养菌液,培养菌液的OD600为15-20,然后按照一定体积比将不同的培养菌液进行混合获得复合功能菌液,厌氧消化的具体操作为将厌氧固定化菌剂加入到厌氧消化反应器进行厌氧消化,厌氧功能菌种的培养温度与厌氧固定化菌剂在厌氧消化反应器中进行厌氧消化的温度相同,厌氧功能菌种包括解蛋白嗜热粪杆菌、棕色嗜热产醋菌、巴氏甲烷八叠球菌以及热自养甲烷热杆菌。
在本发明提供的厌氧固定化菌剂在厌氧消化中的应用中,还可以具有这样的特征:其中,复合功能菌液的最小用量由下式计算得到:
V0:复合功能菌液的最小使用量(L);
Ctotal:厌氧消化反应器内部有机酸总浓度(以乙酸根计,mM);
pH:厌氧消化反应器内部pH;
Cvs:厌氧消化反应器内部挥发性悬浮固体浓度(g/L);
V1:厌氧消化反应器有效工作体积(L)。
在本发明提供的厌氧固定化菌剂在厌氧消化中的应用中,还可以具有这样的特征:其中,当厌氧消化反应器内的氨氮浓度小于等于4g/L,温度为30℃-43℃时,复合功能菌液中的解蛋白嗜热粪杆菌:棕色嗜热产醋菌:巴氏甲烷八叠球菌及热自养甲烷热杆菌的体积比为2-1:3-1:5-1:2-1,当厌氧消化反应器内的氨氮浓度小于等于4g/L,温度为50℃-65℃时,复合功能菌液中的解蛋白嗜热粪杆菌:棕色嗜热产醋菌:巴氏甲烷八叠球菌及热自养甲烷热杆菌的体积比为3-1:4-1:2-1:4-1。
在本发明提供的厌氧固定化菌剂在厌氧消化中的应用中,还可以具有这样的特征:其中,当厌氧消化反应器内的氨氮浓度为4g/L-7g/L,温度为30℃-43℃时,复合功能菌液中的解蛋白嗜热粪杆菌:棕色嗜热产醋菌:巴氏甲烷八叠球菌及热自养甲烷热杆菌的体积比为2-1:2-1:5-1:3-1,当厌氧消化反应器内的氨氮浓度为4g/L-7g/L,温度为50℃-65℃时,复合功能菌液中的解蛋白嗜热粪杆菌:棕色嗜热产醋菌:巴氏甲烷八叠球菌及热自养甲烷热杆菌的体积比为3-1:3-1:4-1:5-1。
在本发明提供的厌氧固定化菌剂在厌氧消化中的应用中,还可以具有这样的特征:其中,将厌氧固定化菌剂干化后得到干化的凝珠,干化的凝珠在投入厌氧消化反应器前,进行活化12h-24h,活化时所用的营养液为利用纯菌培养技术培养厌氧功能菌种时所用的培养液。
发明的作用与效果
根据本发明提供的厌氧固定化菌剂的制备方法及应用,选用四种不同的厌氧功能菌种,利用纯菌培养技术得到相应的培养菌液,然后按照一定体积比将四种培养菌液进行混合获得复合功能菌液,随后浓缩为功能菌群沉淀,再将功能菌群沉淀溶解在聚乙烯醇水溶液中,然后将该溶液滴入第一缓冲溶液中得到聚乙烯醇凝胶珠,将该凝胶珠放入含有硫酸盐的第二缓冲溶液中进行改性,得到硫酸盐改性聚乙烯醇凝胶珠,即厌氧固定化菌剂。厌氧固定化菌剂由聚乙烯醇水溶液凝胶化形成,为由薄膜包裹凝胶物形成的直径为0.5cm-1cm的圆形凝珠。该凝珠能够直接加入到厌氧消化反应器中进行厌氧消化,无需对设备进行改造,既能够有效解除原位有效解除厌氧消化有机酸抑制又能够有效解除氨抑制条件下的有机酸积累。
解蛋白嗜热粪杆菌快速分解细胞碎屑、蛋白质和脂质;利用棕色嗜热产醋菌的同型乙酸氧化途径,将乙酸分解为二氧化碳及氢气;热自养甲烷热杆菌则进行氢营养型产甲烷过程,消耗氢气进而为棕色嗜热产醋菌创造有利的热力学环境;巴氏甲烷八叠球菌通过乙酸发酵型和氢营养型产甲烷途径,分别消耗乙酸和氢气。因此,混合菌群可以加速降低有机酸负荷,恢复厌氧消化反应器pH,进而解除有机酸抑制对反应器内部原有菌群的毒害作用,恢复原有菌群的功能活性;且避免了有机酸分离装置的使用、缓冲材料的添加和现有反应器的改造,降低了处理成本。并且解蛋白嗜热粪杆菌、棕色嗜热产醋菌、热自养甲烷热杆菌及巴氏甲烷八叠球菌均属于耐氨菌种,所以复合功能菌液能够解除氨抑制条件下的有机酸积累。由以上可知,该复合功能菌液不仅耐酸而且耐氨,适用范围广。
本发明利用硫酸盐作为改性剂进行改性,克服了传统聚乙烯醇-硼酸凝胶珠无法干化保存的缺点。硫酸盐-硼酸内核具有足够的结构柔性和结构强度来支撑凝胶珠,以维持固定化菌剂的结构完整和对外力冲击的抗性。
同时,对外加混合功能菌剂进行固定化处理,而不是以游离的细胞形态悬浮于反应器中,可以使外加菌剂更好地定殖于反应器内部原有菌群,避免了外加菌剂随着反应出水而大量流失,进而无需长期补充外加菌剂;也提高了外加菌剂的细胞密度,增强了处理效果。
此外,改性凝胶珠能够被干化处理后保存,因此能够进行大规模生产和长途运输,以应用于不同区域的厌氧消化反应器,克服了普通凝胶珠无法干化,所以必须在厌氧反应器附近进行制备,并立马投入使用的缺点。
由以上可知,本发明所提供的制备方法简单、能耗低,得到的固定化菌剂耐酸耐氨,可以显著增强厌氧消化反应器内部菌群对已积累有机酸的处理能力,且无需长期投加。与现有技术相比,效果稳定且成本低廉,无需对现有反应器进行大规模改造,解决了功能菌种流失和厌氧消化菌群自我恢复能力差的问题,可以有效解除有机垃圾和污水厌氧消化过程中的有机酸抑制以及氨抑制条件下的有机酸积累。
附图说明
图1是本发明的厌氧固定化菌剂的制备流程图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,以下结合实施例及附图对本发明一种厌氧固定化菌剂、制备方法及其应用作具体阐述。
除特别说明外,本发明的实施例所用的原料及试剂均通过一般商业途径购买得到。
本发明所用的厌氧功能菌种分别为解蛋白嗜热粪杆菌(Coprothermobacterproteolyticus,DSM 5265)、棕色嗜热产醋菌(Thermacetogenium phaeum,DSM 26808)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri,DSM 800)和热自养甲烷热杆菌(Methanothermobacter thermautotrophicus,DSM 1053),该四种厌氧功能菌种均通过一般商业途径购买得到。
图1是本发明的厌氧固定化菌剂的制备流程图,如图1所示,厌氧固定化菌剂的制备方法如下:
步骤1,在一定温度下对四种不同的厌氧功能菌种分别进行厌氧培养得到相应的培养菌液,按照一定体积比将不同的培养菌液进行混合获得复合功能菌液。
步骤2,将复合功能菌液离心浓缩获得功能菌群沉淀。
步骤3,将功能菌群沉淀溶解在聚乙烯醇水溶液中得到功能菌群聚乙烯醇溶液,然后将功能菌群聚乙烯醇溶液滴入第一缓冲溶液中,静置24h,得到聚乙烯醇凝胶珠。
步骤4,将聚乙烯醇凝胶珠放入含有硫酸盐的第二缓冲溶液中,静置48h,得到直径为0.5cm-1cm的硫酸盐改性聚乙烯醇凝胶珠,即厌氧固定化菌剂。
步骤1中,四种厌氧功能菌种分别为解蛋白嗜热粪杆菌、棕色嗜热产醋菌、巴氏甲烷八叠球菌以及热自养甲烷热杆菌。利用厌氧功能菌种的活化菌液,通过纯菌培养技术分别对该四种厌氧功能菌种进行厌氧培养,得到各自的培养菌液。培养菌液的氧化还原电位在-300mV以下,OD600为15-20。每种菌液的OD600相同。
纯菌培养技术的具体操作为:在厌氧无菌环境下,将活化菌液以2%-5%的接种量分别接种于发酵罐的培养液中,搅拌速度为150r/min。通过在发酵罐的培养液出口安装无菌聚醚砜中空纤维细胞回收模块,浓缩菌液,直至OD600达到15-20。发酵罐采用3.8L高硼硅玻璃罐体,注入2L液体培养基,罐体进出料口和进出气口均用0.22μm无菌滤膜封闭,在121℃下灭菌20min。
按照一定体积比对解蛋白嗜热粪杆菌、棕色嗜热产醋菌、巴氏甲烷八叠球菌和热自养甲烷热杆菌的培养菌液进行混合,获得复合功能菌液。
培养厌氧功能菌种的培养液为每升包含CH3COONa,乙酸钠,2g;NH4Cl,氯化铵,1g;K2HPO4 3H2O,三水合磷酸氢二钾,0.4g;MgCl2·6H2O,六水合氯化镁,0.2g;CaCl2·2H2O,二水合氯化钙,0.1g;Na2S·9H2O,九水合硫化钠,0.2g;FeCl2·4H2O,四水合氯化亚铁,4mg;H3BO3,硼酸,0.2mg;ZnCl2,氯化锌,1mg;CuCl2·2H2O,二水合氯化铜,0.2mg;MnCl2·4H2O,四水合氯化锰,1mg;Na2MoO4·4H2O,四水合钼酸钠,0.1mg;AlCl3·6H2O,六水合氯化铝,1mg;CoCl2·6H2O,六水合氯化钴,2mg;NiCl2·6H2O,六水合氯化镍,0.2mg;Na2SeO3·5H2O,五水合亚硒酸钠,2mg;EDTA-2Na,乙二胺四乙酸二钠,10mg;pyridoxine hydrochloride,盐酸吡哆素,0.5mg;thiamine hydrochloride,盐酸硫胺素,0.3mg;D-calcium pantothenate,D-泛酸半钙盐,0.3mg;folic acid,叶酸,0.1mg;riboflavin,核黄素,0.3mg;nicotinicacid,烟酸,0.3mg;P-aminobenzoic acid,4-氨基苯甲酸,0.3mg;vitamin B12,维生素B12,0.1mg的水溶液,pH=6.8-7.0。
步骤3中,聚乙烯醇水溶液中聚乙烯醇的质量分数为10%-15%,步骤1中的复合功能菌液与步骤3中的聚乙烯醇水溶液的体积比为10:1-20:1。
步骤3中,每升第一缓冲溶液中包含0.15mol-0.2mol的Na2HPO4,0.2mol-0.25mol的NaH2PO4及50g-60g的H3BO3,余量为无菌水。
每升第二缓冲液中包含1mol-1.5mol的Na2SO4,余量为无菌水。
厌氧固定化菌剂由聚乙烯醇水溶液凝胶化形成,形态为由薄膜包裹凝胶物形成的圆形凝珠,圆形凝珠的直径为0.5cm-1cm。其中厌氧功能菌种被包裹在凝珠内。
在本发明中,刚制备出的凝胶珠可以直接使用,也可以进行干化后得到干化的凝珠以便运输和保存。干化的凝珠在使用前需要进行活化,计作第一次干化-活化。第一次干化-活化后的凝胶珠还可以再进行一次干化-活化,并且第二次干化-活化后的活性保持在80-90%,提供了更大的使用灵活性。
在本发明的实施例中,所用的干化方法为:将凝胶珠放入80℃的环境中,干燥24小时得到干化的凝珠。
将该厌氧固定化菌剂应用到厌氧消化技术中,既能够有效解除有机酸抑制又能够有效解除氨抑制条件下的有机酸积累。在本发明的实施例中,具体操作为将其投入到厌氧消化反应器中,厌氧固定化菌剂的使用量由步骤1中的复合功能菌液的量决定,复合功能菌液的最小用量由下式计算得到:
V0:复合功能菌液的最小使用量(L);
Ctotal:厌氧消化反应器内部有机酸总浓度(以乙酸根计,mM);
pH:厌氧消化反应器内部pH;
Cvs:厌氧消化反应器内部挥发性悬浮固体浓度(g/L);
V1:厌氧消化反应器有效工作体积(L)。
四种厌氧功能菌的培养温度与厌氧固定化菌剂在厌氧消化反应器中进行厌氧消化的温度相同,也就是与厌氧消化反应器的运行温度相同。同时,复合菌液中的四种厌氧功能菌的体积比由厌氧消化反应器的物化参数决定,具体为:
1.当厌氧消化反应器内的氨氮浓度小于等于4g/L,温度为30℃-43℃时,复合功能菌液中的解蛋白嗜热粪杆菌:棕色嗜热产醋菌:巴氏甲烷八叠球菌及热自养甲烷热杆菌的体积比为2-1:3-1:5-1:2-1;
2.当厌氧消化反应器内的氨氮浓度小于等于4g/L,温度为50℃-65℃时,复合功能菌液中的解蛋白嗜热粪杆菌:棕色嗜热产醋菌:巴氏甲烷八叠球菌及热自养甲烷热杆菌的体积比为3-1:4-1:2-1:4-1;
3.当厌氧消化反应器内的氨氮浓度为4g/L-7g/L,温度为30℃-43℃时,复合功能菌液中的解蛋白嗜热粪杆菌:棕色嗜热产醋菌:巴氏甲烷八叠球菌及热自养甲烷热杆菌的体积比为2-1:2-1:5-1:3-1;
4.当厌氧消化反应器内的氨氮浓度为4g/L-7g/L,温度为50℃-65℃时,复合功能菌液中的解蛋白嗜热粪杆菌:棕色嗜热产醋菌:巴氏甲烷八叠球菌及热自养甲烷热杆菌的体积比为3-1:3-1:4-1:5-1。
在本发明的实施例中,使用的为干化的厌氧固定化菌剂,因此在投入厌氧消化反应器前,需要进行活化12h-24h,以恢复固定化菌剂中的微生物活性,活化时所用的营养液为利用纯菌培养技术培养厌氧功能菌种时所用的培养液。但在实际应用中,使用直接制备的凝胶珠可以达到同样的技术效果。
本发明的实施例出现的浓度单位mM为mmol/L。
本发明的实施例中,OD600通过分光光度计测得,挥发性悬浮固体浓度根据《水和废水监测分析方法(第四版)》测得,氨氮浓度通过凯氏定氮仪测得,挥发性有机酸通过气相色谱仪测得。
<实施例1>
本实施例对厌氧固定化菌剂的制备及应用做具体阐述。
在55℃条件下,分别利用纯菌培养技术培养不同的厌氧功能菌种,使其培养菌液OD600为15。分别取180mL、240mL、120mL和240mL的解蛋白嗜热粪杆菌、棕色嗜热产醋菌、巴氏甲烷八叠球菌和热自养甲烷热杆菌的培养菌液进行混合,然后离心浓缩,离心力5000g,离心温度4℃,离心时间5min,获得功能菌群沉淀。
将此功能菌群沉淀加入到50mL质量分数为15%的聚乙烯醇水溶液中搅拌均匀,得到功能菌群聚乙烯醇溶液,然后将该功能菌群聚乙烯醇溶液滴入每升包含Na2HPO4,0.15mol;NaH2PO4,0.2mol;H3BO3,50g的第一缓冲溶液中,静置24h,形成聚乙烯醇凝胶珠;将此聚乙烯醇凝胶珠放入每升包含1mol Na2SO4的第二缓冲溶液中,静置48h,形成直径为0.5cm的硫酸盐改性聚乙烯醇凝胶珠,此凝胶珠即为厌氧固定化菌剂。
选取四个16.3L的厌氧消化反应器作为处理对象,参数均为:有效工作体积10.5L,运行温度为55℃,挥发性悬浮固体浓度为5g/L,pH为6.0,有机酸浓度为104mM,氨氮浓度1.5g/L。
反应器停止进料后,根据固定化菌剂投加情况,分为对照组(未投加菌剂)和实验组(投加菌剂)。菌剂投加8天后,实验组开始恢复产甲烷能力,最大乙酸消耗速率为15.6mM/d;对照组则在20天后,开始恢复产甲烷能力,最大乙酸消耗速率为9.2mM/d。
对照组和实验组均为两个厌氧消化反应器,以上数据为两组数据的平均值。
<实施例2>
本实施例对厌氧固定化菌剂的制备及应用做具体阐述。
在55℃条件下,分别利用纯菌培养技术培养不同的厌氧功能菌种,使其培养菌液OD600为18。分别取150mL、150mL、200mL和250mL的解蛋白嗜热粪杆菌、棕色嗜热产醋菌、巴氏甲烷八叠球菌和热自养甲烷热杆菌的培养菌液进行混合,然后离心浓缩,离心力5000g,离心温度4℃,离心时间5min,获得功能菌群沉淀。
将此功能菌群沉淀加入到60mL质量分数为12%的聚乙烯醇水溶液中搅拌均匀,将搅拌后的聚乙烯醇水溶液滴入每升包含Na2HPO4,0.2mol;NaH2PO4,0.23mol;H3BO3,55g的第一缓冲溶液中,静置24h,形成聚乙烯醇凝胶珠;将此聚乙烯醇凝胶珠放入每升包含1.5mol的Na2SO4的第二缓冲溶液中,静置48h,形成直径为0.8cm的硫酸盐改性聚乙烯醇凝胶珠,此凝胶珠即为厌氧固定化菌剂。
选取六个8.2L的厌氧消化反应器作为处理对象,参数均为:有效工作体积5.6L,运行温度为55℃,挥发性悬浮固体浓度为3g/L,pH为5.5,有机酸浓度为96.5mM,氨氮浓度为4.5g/L。
反应器停止进料后,根据固定化菌剂投加情况,分为对照组(未投加菌剂)和实验组(投加菌剂)。菌剂投加15天后,实验组开始恢复产甲烷能力,最大乙酸消耗速率为9.9mM/d;对照组则在28天后,开始恢复产甲烷能力,最大乙酸消耗速率为6.8mM/d。
对照组和实验组均为三个厌氧消化反应器,以上数据为三组数据的平均值。
<实施例3>
本实施例对厌氧固定化菌剂的制备及应用做具体阐述。
在35℃条件下,分别利用纯菌培养技术培养不同的厌氧功能菌种,使其培养菌液OD600为20。分别取180mL、270mL、450mL和180mL的解蛋白嗜热粪杆菌、棕色嗜热产醋菌、巴氏甲烷八叠球菌和热自养甲烷热杆菌的培养菌液进行混合,然后离心浓缩,离心力5000g,离心温度4℃,离心时间5min,获得功能菌群沉淀。
将此功能菌群沉淀加入到100mL质量分数为15%的聚乙烯醇水溶液中搅拌均匀,将搅拌后的聚乙烯醇水溶液滴入每升包含Na2HPO4,0.2mol;NaH2PO4,0.23mol;H3BO3,60g的第一缓冲溶液中,静置24h,形成聚乙烯醇凝胶珠;将此聚乙烯醇凝胶珠放入每升包含1.2mol的Na2SO4的第二缓冲溶液中,静置48h,形成直径为1.0cm的硫酸盐改性聚乙烯醇凝胶珠,此凝胶珠即为厌氧固定化菌剂。
处理对象为45.2L厌氧消化反应器,有效工作体积30.2L,运行温度为35℃,挥发性悬浮固体浓度为1g/L,pH为6.5,有机酸浓度为50.3mM,氨氮浓度为3.6g/L。
反应器停止进料后,根据固定化菌剂投加情况,分为对照组(未投加菌剂)和实验组(投加菌剂)。菌剂投加10天后,实验组开始恢复产甲烷能力,最大乙酸消耗速率为12.3mM/d;对照组则在15天后,开始恢复产甲烷能力,最大乙酸消耗速率为7.9mM/d。
<实施例4>
本实施例对厌氧固定化菌剂的制备及应用做具体阐述。
在35℃条件下,分别利用纯菌培养技术培养不同的厌氧功能菌种,使其培养菌液OD600为20。分别取50mL、50mL、125mL和75mL的解蛋白嗜热粪杆菌、棕色嗜热产醋菌、巴氏甲烷八叠球菌和热自养甲烷热杆菌的培养菌液进行混合,然后离心浓缩,离心力5000g,离心温度4℃,离心时间5min,获得功能菌群沉淀。
将此功能菌群沉淀加入到20mL质量分数为15%的聚乙烯醇水溶液中搅拌均匀,将搅拌后的聚乙烯醇水溶液滴入每升包含Na2HPO4,0.2mol;NaH2PO4,0.23mol;H3BO3,50g的第一缓冲溶液中,静置24h,形成聚乙烯醇凝胶珠;将此聚乙烯醇凝胶珠放入每升包含1.2mol的Na2SO4的第二缓冲溶液中,静置48h,形成直径为0.7cm的硫酸盐改性聚乙烯醇凝胶珠,此凝胶珠即为厌氧固定化菌剂。
选取六个2.5L的厌氧消化反应器作为处理对象,参数均为:有效工作体积1.5L,运行温度为35℃,挥发性悬浮固体浓度为4g/L,pH为6.8,有机酸浓度为100.6mM,氨氮浓度为6.5g/L。
反应器停止进料后,根据固定化菌剂投加情况,分为对照组(未投加菌剂)和实验组(投加菌剂)。菌剂投加6天后,实验组开始恢复产甲烷能力,最大乙酸消耗速率为13.2mM/d;对照组则在10天后,开始恢复产甲烷能力,最大乙酸消耗速率为9.8mM/d。
对照组和实验组均为三个厌氧消化反应器,以上数据为三组数据的平均值。
实施例的作用与效果
根据本发明的实施例所提供的厌氧固定化菌剂的制备方法及应用,选用四种不同的厌氧功能菌种,利用纯菌培养技术得到相应的培养菌液,然后按照一定体积比将四种培养菌液进行混合获得复合功能菌液,随后浓缩为功能菌群沉淀,再将功能菌群沉淀溶解在聚乙烯醇水溶液中,然后将该溶液滴入第一缓冲溶液中得到聚乙烯醇凝胶珠,将该凝胶珠放入含有硫酸盐的第二缓冲溶液中进行改性,得到硫酸盐改性聚乙烯醇凝胶珠,即厌氧固定化菌剂。厌氧固定化菌剂由聚乙烯醇水溶液凝胶化形成,为由薄膜包裹凝胶物形成的直径为0.5cm-1cm的圆形凝珠。该凝珠能够直接加入到厌氧消化反应器中进行厌氧消化,无需对设备进行改造,既能够有效解除原位有效解除厌氧消化有机酸抑制又能够有效解除氨抑制条件下的有机酸积累。
解蛋白嗜热粪杆菌快速分解细胞碎屑、蛋白质和脂质;利用棕色嗜热产醋菌的同型乙酸氧化途径,将乙酸分解为二氧化碳及氢气;热自养甲烷热杆菌则进行氢营养型产甲烷过程,消耗氢气进而为棕色嗜热产醋菌创造有利的热力学环境;巴氏甲烷八叠球菌通过乙酸发酵型和氢营养型产甲烷途径,分别消耗乙酸和氢气。因此,混合菌群可以加速降低有机酸负荷,恢复厌氧消化反应器pH,进而解除有机酸抑制对反应器内部原有菌群的毒害作用,恢复原有菌群的功能活性;且避免了有机酸分离装置的使用、缓冲材料的添加和现有反应器的改造,降低了处理成本。并且解蛋白嗜热粪杆菌、棕色嗜热产醋菌、热自养甲烷热杆菌及巴氏甲烷八叠球菌均属于耐氨菌种,所以复合功能菌液能够解除氨抑制条件下的有机酸积累。由以上可知,该复合功能菌液不仅耐酸而且耐氨,适用范围广。
利用硫酸盐作为改性剂进行改性,克服了传统聚乙烯醇-硼酸凝胶珠无法干化保存的缺点。硫酸盐-硼酸内核具有足够的结构柔性和结构强度来支撑凝胶珠,以维持固定化菌剂的结构完整和对外力冲击的抗性。
同时,对外加混合功能菌剂进行固定化处理,而不是以游离的细胞形态悬浮于反应器中,可以使外加菌剂更好地定殖于反应器内部原有菌群,避免了外加菌剂随着反应出水而大量流失,进而无需长期补充外加菌剂;也提高了外加菌剂的细胞密度,增强了处理效果。
此外,改性凝珠能够被干化处理后保存,因此能够进行大规模生产和长途运输,以应用于不同区域的厌氧消化反应器,克服了普通凝胶珠无法干化,所以必须在厌氧反应器附近进行制备,并立马投入使用的缺点。
此外,根据厌氧消化反应器的主要物化参数,能够确定复合功能菌液的最小使用量;同时在明确的不同工况条件下,能够确定四种厌氧功能菌种的混合比例,可以经济有效地解除有机酸抑制。
厌氧消化反应器中的pH一般大于5,而本发明的实施例所制备的厌氧固定化菌剂适用于pH大于5(包含pH为5)的厌氧消化反应器,因此无需对厌氧消化反应器进行pH调整。
由于反应器中的有机酸的积累导致了酸抑制的形成,因此厌氧固定化菌剂与反应底物混合(即有机酸组分)均匀后,进行静置反应,降解有机酸,进而解除抑制。
每升第一缓冲溶液中包含0.15mol-0.2mol的Na2HPO4,0.2mol-0.25mol的NaH2PO4及50g-60g的H3BO3,每升第二缓冲溶液中包含1mol-1.5mol的Na2SO4,NaH2PO4有利于保持微生物细胞的稳态,H3BO3的加入形成了硼酸内核,而Na2SO4对硼酸内核进行改性,得到改性的凝胶珠。
当厌氧消化反应器内的氨氮浓度小于等于4g/L,温度为30℃-43℃时,复合功能菌液中的解蛋白嗜热粪杆菌:棕色嗜热产醋菌:巴氏甲烷八叠球菌及热自养甲烷热杆菌的体积比为2-1:3-1:5-1:2-1。当厌氧消化反应器内的氨氮浓度小于等于4g/L,温度为50℃-65℃时,复合功能菌液中的解蛋白嗜热粪杆菌:棕色嗜热产醋菌:巴氏甲烷八叠球菌及热自养甲烷热杆菌的体积比为3-1:4-1:2-1:4-1。当厌氧消化反应器内的氨氮浓度为4g/L-7g/L,温度为30℃-43℃时,复合功能菌液中的解蛋白嗜热粪杆菌:棕色嗜热产醋菌:巴氏甲烷八叠球菌及热自养甲烷热杆菌的体积比为2-1:2-1:5-1:3-1。当厌氧消化反应器内的氨氮浓度为4g/L-7g/L,温度为50℃-65℃时,复合功能菌液中的解蛋白嗜热粪杆菌:棕色嗜热产醋菌:巴氏甲烷八叠球菌及热自养甲烷热杆菌的体积比为3-1:3-1:4-1:5-1。这些比例的选择是通过实验数据得出,具体为通过模拟上述四种工况,并在每种工况条件下设置多组平行反应器,结合微生物测序分析,我们发现这四种微生物丰度较高,为优势微生物,因此我们选择这四种微生物的丰度比例作为混合体积比。如果某种微生物的体积低于这个比例,会导致菌剂中的互营关系被破坏,进而无法起到解除有机酸抑制的作用,例如:热自养甲烷热杆菌和巴氏甲烷八叠球菌的数量较低,则无法消耗解蛋白嗜热粪杆菌产生的氢气,改变热力学结果,进而对解蛋白嗜热粪杆菌造成热力学屏障,反应停止。高于这个比例,会造成菌剂的浪费,并且增加聚乙烯醇水溶液的使用量,经济性较差。因此,这些是根据菌群自身反应结果得到的,兼顾反应效果和经济性。
厌氧固定化菌剂在投入厌氧消化反应器前,进行活化12h-24h,活化可以恢复微生物菌剂的活性,以更好地解除酸抑制。
微生物反应对温度条件比较敏感,如果不预先在特定温度下培养厌氧功能菌种,则无法发挥固定化菌剂的作用,甚至造成菌剂中微生物的大量死亡。例如在35℃条件下培养的微生物菌剂,如果立马投放到55℃的反应器中,会造成更长的停滞期,以及菌剂中微生物的大量死亡,改变菌剂中的微生物比例,进而导致菌剂失效。因此,为达到最优处理效果,选择温度相同的培养条件,也就是厌氧功能菌种的培养温度与厌氧固定化菌剂在厌氧消化反应器的进行厌氧消化的温度相同。
由以上可知,本发明所提供的制备方法简单、能耗低,得到的固定化菌剂耐酸耐氨,可以显著增强厌氧消化反应器内部菌群对已积累有机酸的处理能力,且无需长期投加。与现有技术相比,效果稳定且成本低廉,无需对现有反应器进行大规模改造,解决了功能菌种流失和厌氧消化菌群自我恢复能力差的问题,可以有效解除有机垃圾和污水厌氧消化过程中的有机酸抑制以及氨抑制条件下的有机酸积累。
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种厌氧固定化菌剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1,在一定温度下对四种不同的厌氧功能菌种分别进行厌氧培养得到相应的培养菌液,按照一定体积比将不同的所述培养菌液进行混合获得复合功能菌液;
步骤2,将所述复合功能菌液进行浓缩获得功能菌群沉淀;
步骤3,将所述功能菌群沉淀溶解在聚乙烯醇水溶液中得到功能菌群聚乙烯醇溶液,然后将所述功能菌群聚乙烯醇溶液滴入第一缓冲溶液中,得到聚乙烯醇凝胶珠;
步骤4,将所述聚乙烯醇凝胶珠放入含有硫酸盐的第二缓冲溶液中,得到硫酸盐改性聚乙烯醇凝胶珠,即厌氧固定化菌剂,
其中,所述厌氧功能菌种分别为解蛋白嗜热粪杆菌、棕色嗜热产醋菌、巴氏甲烷八叠球菌以及热自养甲烷热杆菌。
2.根据权利要求1所述的厌氧固定化菌剂的制备方法,其特征在于:
其中,步骤3中,所述聚乙烯醇水溶液中聚乙烯醇的质量分数为10%-15%,
步骤1中的所述复合功能菌液与步骤3中的所述聚乙烯醇水溶液的体积比为10∶1-20∶1。
3.根据权利要求1所述的厌氧固定化菌剂的制备方法,其特征在于:
其中,每升所述第一缓冲溶液中包含0.15mol-0.2mol的Na2HPO4,0.2mol-0.25mol的NaH2PO4及50g-60g的H3BO3,
每升所述第二缓冲溶液中包含1mol-1.5mol的Na2SO4,
所述厌氧固定化菌剂的直径为0.5cm-1cm。
4.一种厌氧固定化菌剂,其特征在于,由权利要求1-3中任一项所述的厌氧固定化菌剂的制备方法制备得到,其中,所述厌氧固定化菌剂为由薄膜包裹凝胶物形成的圆形凝珠,所述圆形凝珠的直径为0.5cm-1cm。
5.一种如权利要求4所述的厌氧固定化菌剂在厌氧消化中的应用。
6.根据权利要求5所述的厌氧固定化菌剂在厌氧消化中的应用,其特征在于:
其中,在一定温度下,利用纯菌培养技术将四种厌氧功能菌种分别培养得到相应的培养菌液,所述培养菌液的OD600为15-20,然后按照一定体积比将不同的所述培养菌液进行混合获得复合功能菌液,
所述厌氧消化的具体操作为将所述厌氧固定化菌剂加入到厌氧消化反应器进行厌氧消化,所述厌氧功能菌种的培养温度与所述厌氧固定化菌剂在所述厌氧消化反应器中进行厌氧消化的温度相同,
四种所述厌氧功能菌种分别为解蛋白嗜热粪杆菌、棕色嗜热产醋菌、巴氏甲烷八叠球菌以及热自养甲烷热杆菌。
8.根据权利要求6所述的厌氧固定化菌剂在厌氧消化中的应用,其特征在于:
其中,当所述厌氧消化反应器内的氨氮浓度小于等于4g/L,温度为30℃-43℃时,所述复合功能菌液中的所述解蛋白嗜热粪杆菌:所述棕色嗜热产醋菌:所述巴氏甲烷八叠球菌及所述热自养甲烷热杆菌的体积比为2-1∶3-1∶5-1∶2-1;
当所述厌氧消化反应器内的氨氮浓度小于等于4g/L,温度为50℃-65℃时,所述复合功能菌液中的所述解蛋白嗜热粪杆菌:所述棕色嗜热产醋菌:所述巴氏甲烷八叠球菌及所述热自养甲烷热杆菌的体积比为3-1∶4-1∶2-1∶4-1。
9.根据权利要求6所述的厌氧固定化菌剂在厌氧消化中的应用,其特征在于:
其中,当所述厌氧消化反应器内的氨氮浓度为4g/L-7g/L,温度为30℃-43℃时,所述复合功能菌液中的所述解蛋白嗜热粪杆菌:所述棕色嗜热产醋菌:所述巴氏甲烷八叠球菌及所述热自养甲烷热杆菌的体积比为2-1∶2-1∶5-1∶3-1;
当所述厌氧消化反应器内的氨氮浓度为4g/L-7g/L,温度为50℃-65℃时,所述复合功能菌液中的所述解蛋白嗜热粪杆菌:所述棕色嗜热产醋菌:所述巴氏甲烷八叠球菌及所述热自养甲烷热杆菌的体积比为3-1∶3-1∶4-1∶5-1。
10.根据权利要求6所述的厌氧固定化菌剂在厌氧消化中的应用,其特征在于:
其中,将所述厌氧固定化菌剂干化后得到干化的凝珠,所述干化的凝珠在投入所述厌氧消化反应器前,进行活化12h-24h,活化时所用的营养液为利用纯菌培养技术培养所述厌氧功能菌种时所用的所述培养液。
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