CN105622924A - 一种组织蛋白酶b可裂解的嵌段聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种组织蛋白酶b可裂解的嵌段聚合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种组织蛋白酶B(CB)可识别并可降解的二肽及对氨基苄醇(PABOH)间隔基为连接键的嵌段共聚物的制备方法。(1)Fmoc保护的连接键Fmoc-Val-Cit-PABOH与长链脂肪胺共价结合制得Fmoc-Val-Cit-PABC-Cn；(2)脱去Fmoc的保护制得Val-Cit-PABC-Cn；(3)脱保护后的Val-Cit-PABC-Cn与甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物结合制得mPEG-Val-Cit-PABC-Cn所述嵌段共聚物，所述嵌段共聚物为两亲性的嵌段共聚物。其自组装形成的纳米载药胶束可实现增强的肿瘤细胞内的药物控制释放，细胞毒性较低，显示出了作为疏水性抗肿瘤药物载体的使用潜力。

Description

一种组织蛋白酶B可裂解的嵌段聚合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术、纳米医药及新材料领域，具体涉及以组织蛋白酶B(CB)可降解的嵌段聚合物的合成及其组装方法、以及应用于制备对肿瘤细胞具有增强的细胞内药物控制释放特性的智能纳米胶束载体的用途。
背景技术
通常细胞毒性药物是一类可有效杀伤免疫细胞并抑制其增殖的药物，可用于抗恶性肿瘤，也可用作免疫抑制剂，是化疗的主要用药，主要通过毒化某些快速增长和分裂的细胞来治疗癌症。这类药物因具有致癌、致畸、生殖毒性以及低剂量时致系列器官毒性等毒副作用，从而影响了其临床疗效的发挥。纳米药物载体为实现细胞毒药物在肿瘤组织内的定点和快速释放，减少对正常组织器官的损伤，避免有效药物剂量不足导致肿瘤细胞产生耐药性提供了一个有效途径。智能纳米药物载体系统主要是基于肿瘤组织与人体正常组织的微环境差异，如肿瘤组织具有乏氧、酸性pH值、温度稍高、有大量生长因子及水解蛋白酶等特点。利用实体瘤的高渗透和长滞留效应(EPR效应)，可使纳米载体药物在肿瘤组织富集，在肿瘤微环境作用下快速解体，迅速释放出抗肿瘤药物“杀死”肿瘤细胞。
CB是溶酶体内半胱氨酸蛋白水解酶，其催化作用由Cys，His实现，属于木瓜蛋白酶家族，在pH3.0-7.0都具有活性，碱性条件下会不可逆失活，其水解位点为-Arg-Arg-/-Xaa，且能够在羧基端按顺序水解二肽，因此也叫作羧基二肽酶。通常认为CB在溶酶体降解蛋白质过程中发挥着必不可少的作用，可以降解多种蛋白质。利用原位杂交、Westernblot及免疫组化等技术研究发现，胃癌、肺癌、肠癌、乳腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤组织中，CB的表达及CB活性均成倍甚至3-9倍高于邻近正常组织。利用CB可以选择性地降解一些多肽片段的特点，可以构建CB敏感的药物传递系统。
JanFeijen等利用CB敏感的四肽Gly-Phe-Leu-Gly为连接键合成了一种CB可降解的囊泡，并证明了在CB存在的条件下，由于四肽连接键的断裂使囊泡的外壳解体，从而导致了药物的快速释放。而没有CB存在时，囊泡保持稳定。本发明人也曾合成一种以CB可降解的二肽Val-Cit为连接键的嵌段聚合物，但实验表明其释药速率较慢。
发明内容
为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明提供了一种CB可裂解的嵌段聚合物，所述嵌段聚合物以二肽和PABOH为连接键。本发明制备的嵌段聚合物可以用于构筑纳米胶束，具有较好的释药性和较低的细胞毒性。
本发明提出了一种组织蛋白酶B(CB)可裂解的嵌段聚合物，所述嵌段聚合物是以CB敏感的二肽和PABOH作为连接键。优选地，以-Val-Cit-PABC-为连接键，其结构如式(I)所示：
mPEG-Val-Cit-PABC-R2式(I)；
式(I)中，mPEG为甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物，R2为直链脂肪胺。
优选地，所述嵌段聚合物的结构如式(II)所示：
mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn式(II)；
其中，mPEG甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物，平均分子量为1000-10000，Cn表示碳原子数，n为14-22。
本发明还提供了一种组织蛋白酶B(CB)敏感的嵌段聚合物的制备方法，该方法将连接键Val-Cit-PABC-PNP先与长链脂肪胺Cn-NH2反应制得Val-Cit-PABC-NH-Cn后再与甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物反应得到mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn。所述mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn的制备方法包括以下步骤：(1)Fmoc保护的连接键Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP与长链脂肪胺Cn-NH2在DMAP的催化作用下反应制得Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn；(2)在哌啶的作用下Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn脱去Fmoc的保护制得Val-Cit-PABC-NH-Cn；(3)脱保护后的Val-Cit-PABC-NH-Cn与甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物经过脱水缩合反应制得mPEG-Val-Cit-PABC-Cn。其中，mPEG为甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物，平均分子量为1000-10000，Cn表示碳原子数，n为14-22。
所述步骤(1)中，在二氯甲烷中室温下反应36小时。
所述步骤(2)中，反应溶剂为二甲基甲酰胺，反应温度为室温，反应时间为2小时。
所述步骤(3)中，脱保护后的Val-Cit-PABC-NH-Cn与甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物在二甲基甲酰胺中，在室温下条件下，与EDCI、HOBt和Et3N反应，经过脱水缩合反应24小时，制得mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn。
进一步地，本发明的mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn的制备方法，包括1)Fmoc保护的连接键Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP与长链脂肪胺Cn-NH2在DMAP的催化作用下，于二氯甲烷中室温下反应36小时，反应制得Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn；(2)将Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn溶解在二甲基甲酰胺中，加入哌啶，室温下反应2小时后，Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn脱去Fmoc的保护制得Val-Cit-PABC-NH-Cn；(3)脱保护后的Val-Cit-PABC-NH-Cn与甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物mPEG在二甲基甲酰胺中与EDCI、HOBt和Et3N反应24小时，经过脱水缩合反应制得mPEG-Val-Cit-PABC-Cn。其中，mPEG为甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物，平均分子量为1000-10000，Cn表示碳原子数，n为14-22。
本发明进一步提出了将所述嵌段聚合物用于制备药物载体的应用。所述嵌段聚合物以CB敏感的二肽和PABOH为连接键。所述嵌段聚合物包括式(I)、式(II)。
其中，所述药物为脂溶性药物；所述脂溶性药物包括抗肿瘤药物；所述抗肿瘤药物包括SN-38、喜树碱、紫杉醇、顺铂、阿霉素等。
其中，所述载体为纳米胶束载体，优选地，所述纳米胶束载体为CB敏感型。
本发明提出了以所述嵌段聚合物用于制备对肿瘤细胞具有增强的细胞内药物控制释放特性的智能纳米胶束载体的用途。本发明利用肿瘤细胞中CB的过表达，利用对CB敏感的二肽和间隔化合物PABOH为连接键，合成了式(II)mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn，进而构筑其载药胶束，研究胶束在模拟的溶酶体条件下的释药行为，评价其体外毒性。
在一具体实施方案中，以mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18为例，说明CB敏感的嵌段聚合物及其制备方法和应用。
(一)mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18嵌段聚合物的合成和表征
(1)Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-C18的制备；
(2)脱Fmoc保护的Val-Cit-PABC-NH-C18的制备；
(3)嵌段聚合物mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18的制备；
(4)合成用于对照研究的不含PABOH的嵌段聚合物mPEG-Val-Cit-NH-C18。
(二)嵌段共聚物纳米胶束系统的构筑及表征
用溶剂蒸发法制备mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18胶束及SN-38载药胶束，测定其临界胶束浓度；用透射电镜(TEM)观测其形貌，用动态光散射仪(DLS)测定粒径大小及分布；用芘荧光探针法测定其临界胶束浓度；用高效液相色谱测定载药胶束的包封率和载药量。
(三)嵌段共聚物纳米胶束的降解及释药性能
用DLS追踪mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18纳米胶束在模拟的肿瘤细胞溶酶体环境中降解的粒径变化情况；测定载药胶束mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18和mPEG-Val-Cit-NH-C18的释药性能。
(四)载SN-38的mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18和mPEG-Val-Cit-NH-C18胶束的细胞毒性研究
噻唑蓝(MTT)比色法检测两种空白胶束mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18和mPEG-Val-Cit-NH-C18对结肠癌细胞HCT-116的细胞毒性以及载SN-38的mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18和mPEG-Val-Cit-NH-C18载药胶束及阳性药SN-38对结肠癌细胞HCT-116的细胞毒性。
本发明有益效果包括：本发明所述嵌段聚合物可以用于构筑纳米胶束，可以增强细胞内的药物控制释放，并且在引入PABOH间隔基后具有更好的释药性能和较低的细胞毒性。本发明所述嵌段聚合物包含亲水性的甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物和亲脂性的脂肪胺，并通过组织蛋白酶B可降解的二肽Val-Cit及PABOH将其偶联，从而制得一种两亲性的嵌段共聚物。本发明聚合物自组装形成的纳米载药胶束可实现增强的肿瘤细胞内的药物控制释放，细胞毒性较低，其具有作为疏水性抗肿瘤药物载体的广泛应用前景。
附图说明
图1为嵌段共聚物mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18和对照物mPEG-Val-Cit-NH-C18的合成路线图。
图2为mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18胶束的粒径分布((A)为DLS图)及形貌图((B)为TEM图)。
图3为mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18胶束在模拟的肿瘤细胞溶酶体环境下的粒径变化图。
图4为载药的mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18和mPEG-Val-Cit-NH-C18胶束在模拟的肿瘤细胞溶酶体环境下的释药速率图。
图5为载药的mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18和mPEG-Val-Cit-NH-C18胶束及SN-38对HCT-116细胞的细胞毒性图(A)为两种载药材料mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18和mPEG-Val-Cit-NH-C18对HCT-116细胞的毒性，(B)为装载了SN-38的载药胶束对HCT-116细胞的细胞毒性。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn的制备，n为18
将Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP(110mg，0.14mmol)、硬脂胺(46mg，1.2equiv)和DMAP(21mg，1.2equiv)的混合物溶于20mL二氯甲烷中，氮气保护下于室温搅拌36小时后，浓缩反应液后加入30mL乙醚超声，过滤、干燥得到固体产物98mg，产率为76％。
实施例2
脱Fmoc保护的Val-Cit-PABC-NH-Cn的制备，n为182
将Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-C18(245mg，0.27mmol)溶于15mL二甲基甲酰胺中，加入哌啶(27μL，2equiv)后于室温下搅拌两小时。浓缩反应液，加入乙醚(40mL×2)超声后过滤，得到固体产物143mg，产率为78％。
实施例3
嵌段共聚物mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn的制备，n为18
mPEG-COOH(347mg，0.17mmol，平均分子量为2000)加入到10mL甲苯中，搅拌回流1h除水后蒸去甲苯并将mPEG溶解于10mL重蒸的二甲基甲酰胺中，氮气保护下加入EDCI(33mg，0.17mmol)、HOBt(23mg，0.17mmol)和三乙胺(24μL，0.17mmol)，搅拌1小时后加入Val-Cit-PABC-NH-C18并于室温下继续反应24小时。之后将溶剂除去，再加入10mL二氯甲烷。将该混合溶液用6mL×3的水洗，再用6mL的饱和食盐水洗之后用无水硫酸钠干燥，过滤之后将滤液旋干。剩余混合物通过柱层析(CH2Cl2:CH3OH＝40:1→30:1→20:1)纯化得到产物160mg，产率为45％。
实施例4
对照化合物mPEG-Val-Cit-NH-Cn的制备，n为18，第一步为Fmoc-Val-Cit-NH-C18的制备。
将Fmoc-Val-Cit(2.976g，6mmol)、EDCI(1.26g，1.1equiv)、HOBt(891mg，1.1equiv)和三乙胺(917μL，1.1equiv)溶于25mL二甲基甲酰胺中，室温下搅拌1小时后，加入硬脂胺(1.778g，1.1equiv)继续搅拌24小时。用油泵减压蒸馏除去溶剂，残留物中加入10％CH3OH/CH2Cl2(20mL×2)，超声，过滤，收集固体干燥后得产物2.976g，产率为63.8％。
实施例5
对照化合物mPEG-Val-Cit-NH-Cn的制备，n为18，第二步为Val-Cit-NH-C18的制备。
将Fmoc-Val-Cit-NH-C18(600mg，0.8mmol)溶于10mL二甲基甲酰胺中，加入哌啶(159μL，2equiv)后于室温下搅拌2小时，将溶剂旋干，用乙醚(20mL×2)打浆，过滤，干燥后得固体产物421mg，产率为80％。
实施例6
对照化合物mPEG-Val-Cit-NH-Cn的制备，n为18，第三步为mPEG-Val-Cit-NH-C18的制备。
mPEG-COOH(0.8g，0.4mmol)加入到10mL甲苯中回流1小时除水，然后减压蒸馏除去甲苯。之后将mPEG-COOH溶于10mL二甲基甲酰胺中，加入EDCI(77mg，0.4mmol)、HOBt(54mg，0.4mmol)和三乙胺(56μL,0.4mmol)。室温下搅拌1小时后加入Val-Cit-C18(168mg，0.32mmol)，继续搅拌24小时。之后，减压蒸馏除去溶剂，将残留物溶于10mL二氯甲烷中，水洗三次，再用饱和食盐水洗，收集有机层用无水硫酸钠干燥，过滤收集滤液，减压蒸馏除去溶剂，将剩余物通过柱层析(CH2Cl2:CH3OH＝40:1→30:1→20:1)分离得到固体产物250mg，产率31％。
实施例7
mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18胶束的组装
将2mgmPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18溶于0.5mL四氢呋喃中，滴加入搅拌速度为500r/min的10mL超纯水中，滴加完成后继续搅拌4h，用旋转蒸发仪减压蒸馏除去其中的四氢呋喃后，用0.45μm的针式过滤器过滤，得到mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18胶束的水溶液。动态光散射(如图2(A)DLS图所示)测得粒径为133nm，透射电镜(如图2(B)TEM图所示)观察其形貌为球形。芘荧光探针法测得其临界胶束浓度(CMC)为4.5×10-3mg/mL。
实施例8
载SN-38的mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18胶束的制备
取10mgmPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18和1mgSN-38溶于1mLDMSO中，超声溶解使混合均匀，冻干除去溶剂DMSO。将冻干后的粉末加入10mL去离子水中，超声20min，用0.8μm的针式过滤器过滤，冷冻干燥，制得载药胶束。
用高效液相色谱测定其载药量(DL％)和包封率(EE％)，与SN-38的标准曲线作对照，计算得载药量和包封率分别为6.2％和62％。
载药量(DL％)＝(胶束中SN-38的质量/聚合物的质量)×100％
包封率(EE％)＝(胶束中SN-38的质量/SN-38投料的质量)×100％
实施例9
通过动态光散射监测mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18在模拟的肿瘤细胞溶酶体环境中的粒径变化
预先将50μLCB的NaAc缓冲溶液(50UI/mL)用100μL的30mMDTT/15mMEDTA溶液对CB进行活化，之后将上述混合溶液加入到1mL0.2mg/mL的胶束溶液中，置于37℃的摇床中，每隔一段时间用DLS测定其粒径。如图3所示，结果表明，在第9天时，mPEG-Val-Cit-PABC-C18胶束粒径发生了明显的增加。
实施例11
两种SN-38载药胶束的释药行为研究
为研究包裹了SN-38的mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18胶束的释药行为，包裹了SN-38的mPEG-Val-Cit-NH-C18载药胶束被制备用于释药行为的对照试验。分别取4mg包裹了SN-38的mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18和mPEG-Val-Cit-NH-C18载药胶束溶解于10mLNaAc-HOAc缓冲溶液(25mM,pH5.0)中，分别取2mL以上溶液加入到分子量为10000的透析袋中，其中一组加入50μLCB的NaAc缓冲溶液(50UI/mL)，另一对照组不加。之后置于10mLNaAc-HOAc缓冲溶液(25mM,pH5.0)中于37℃摇床中透析，每过一天取出透析管中的10mL透析液并补充10mLNaAc-HOAc缓冲溶液(25mM,pH5.0)。分别对0.4mg/mL的载药胶束溶液和从透析管中取出的溶液进行高效液相分析，计算释药量。如图4所示，结果表明，mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18载药胶束的释药速率要明显快于mPEG-Val-Cit-NH-C18载药胶束。
实施例12
为研究mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18胶束和包裹了SN-38的载药胶束mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18的细胞毒性，空白胶束mPEG-Val-Cit-NH-C18和包裹了SN-38的mPEG-Val-Cit-NH-C18载药胶束用于对照试验。细胞培养方法为：将处于对数生长期的HCT-116细胞，接种密度为5×103个细胞/孔/100μL接种于96孔板内，经细胞接种的96孔板放置在培养箱(37℃、5％CO2浓度的潮湿环境)中培养24h。24h后分别加入100μL不同浓度的mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18和mPEG-Val-Cit-NH-C18空白胶束、包裹了SN-38的载药胶束mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18和mPEG-Val-Cit-NH-C18以及SN-38，每个浓度均为三个复孔(另设无细胞空白孔、含细胞无药物对照孔)。然后再次放入培养箱培养72h后，从每孔中去除100uL旧培养液后加入浓度为5mg/mL的MTT溶液10uL，继续培养4小时后，吸去培养基并加入100μLDMSO溶解甲瓒晶体。然后用酶标仪(检测波长为570nm)测定每孔中溶液的吸光度(OD值)。按下列公式计算癌细胞的相对存活率。
细胞存活率(％)＝(OD实验组-OD空白组/OD对照组-OD空白组)×100％
如图5(A)和(B)所示，结果表明两种材料对HCT-116细胞的毒性均较小，但载药胶束mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18的细胞毒性要高于载药胶束mPEG-Val-Cit-NH-C18，进一步证明了mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18的释药速度要快于mPEG-Val-Cit-NH-C18。

Claims (7)

1.一种组织蛋白酶B可裂解的嵌段聚合物，其特征在于，所述嵌段聚合物以二肽及PABOH为连接键，其结构式如式(I)所示：
mPEG-Val-Cit-PABC-R2式(I)
式(I)中，mPEG为甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物，R2为直链脂肪胺。
2.根据权利要求1所述的嵌段聚合物，其特征在于，所述嵌段聚合物的结构式如式(II)所示，
mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn式(II)；
式(II)中：mPEG甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物的平均分子量为1000-10000；Cn表示碳原子数，其中n为14-22。
3.如权利要求1或2所述嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，所述方法为：(1)Fmoc保护的连接键Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP与长链脂肪胺Cn-NH2在DMAP的催化条件下反应，制得Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn；(2)在哌啶的作用下Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn脱去Fmoc的保护制得Val-Cit-PABC-NH-Cn；(3)脱保护后的Val-Cit-PABC-NH-Cn与甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物经过脱水缩合反应制得mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn。
4.如权利要求3所述嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在二氯甲烷中，室温条件下反应36小时。
5.如权利要求3所述嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，反应溶剂为二甲基甲酰胺，反应温度为室温，反应时间为2小时。
6.如权利要求3所述嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，脱保护后的Val-Cit-PABC-NH-Cn与甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物在二甲基甲酰胺中，室温条件下，与EDCI、HOBt和Et3N反应，经过脱水缩合反应24小时，制得mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn。
7.如权利要求1所述的嵌段共聚物在制备胶束药物载体和/或实现药物在肿瘤细胞内的控制释放中的应用。
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