CN105611837A

CN105611837A - 用于植物抗微生物治疗的包装

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Publication number: CN105611837A
Application number: CN201480034993.2A
Authority: CN
Inventors: 吉洛拉·克里茨曼
Original assignee: NOBACTRA ISRAEL Ltd
Current assignee: NOBACTRA ISRAEL Ltd
Priority date: 2013-04-18
Filing date: 2014-04-10
Publication date: 2016-05-25
Also published as: AU2014255310A1; WO2014170894A1; RU2621919C2; US20150282491A1; IL225825A; US10674731B2; JP2016515646A; MA38525B2; AU2017221781A1; MX2015014638A; BR112015026208A2; RU2015149388A; CN105283073B; RU2614063C1; MA38486A1; JP6306687B2; IL225825A0; MA38486B1; AU2018200812A1; US9380788B2

Abstract

本发明提供了一种包装(200)，所述包装在孔(220)的形式中包括至少一个第一组分，所述第一组分包含颗粒物质，所述颗粒物质包含至少一种天然油；在多个第二孔(230)的形式中包含至少一个第二组分，所述至少一个第二组分包含微生物病原体的拮抗物；其中所述至少一个第一组分和所述至少一个第二组分被容纳在所述包装的分开的隔室内。本发明还提供了用于提供抗细菌剂的方法，所述方法包括混合包含运载至少一种天然油的颗粒物质的第一组分和包含微生物病原体的至少一种拮抗物的至少一个第二组分，以及允许所述混合物形成具有抗细菌活性的乳剂。本发明还提供了治疗或预防植物中的病原体感染的方法，所述方法包括向所述植物应用一定量的乳剂，所述乳剂包含颗粒物质、至少一种天然油和引起所述病原体感染的微生物病原体的至少一种拮抗物。又进一步地，提供了可用于尤其是本文公开的包装和方法中的一些分离的拮抗细菌。

Description

用于植物抗微生物治疗的包装

技术领域

本公开内容处于用于抗微生物用途并且特别是，植物保护和植物的生物防治的产品的领域。

现有技术

以下列出了被认为与本文公开的主题相关的作为背景的参考文献：

美国专利申请公布号US2011028500

美国专利申请公布号US2011014596

印度专利申请号IN03603CH2010

美国专利号7,485,451

AitBenAoumarA.等人，J.Med.PlantsRes.6(17):4332-4338,2011

PouvovaD.等人，Zemdirbyste-Agrucyktyre95(3):440-446,2008

LanteigneC,等人，Phytopathology.102(10):967-73,2012

SlusarskiC.VegetableCropResearchBulletin69:125-1342008

本文对以上参考文献的认可不意在被推断为意指这些参考文献以任何方式与本文公开的主题的专利性相关。

背景

农作物易受很多种微生物病原体的影响，其导致年度损失和经济损害。被开发以保护农作物免于植物病害的方法包括针对抗性的植物育种、栽培技术、应用化学剂和生物防治。

由于化学杀虫剂的应用导致严重的环境污染，并且很多病原体正对现有的化学品进化出抗性，所以现在很多杀虫剂被禁止使用，并且有机农业根本不被允许依赖此类物质。因此，主要目标是开发出新的、环境友好的手段来防治病原体，即生物防治技术。

美国专利号6,495,133描述了对植物病原体表现出拮抗效应的粉红粘帚霉(Glicladiumroseum)的菌株。生物防治剂被用于处理种子、土壤或植物以保护包含马铃薯的多种植物免于真菌病原体。

美国专利申请公布号US2011028500和US2011014596描述了包含植物提取物、抗植物病原性的剂的植物病原体抑制剂组合，所述植物提取物包含一种或更多种蒽醌，所述抗植物病原性的剂可包含具有杀真菌活性的天然油或油产品。

印度专利申请号IN03603CH2010描述了作为生物防治的真菌生物体的逆乳化制剂。所述制剂为逆乳化制剂的形式。描述的工艺包括通过固体状态或液体发酵产生真菌孢子；制备分生孢子悬浮液或细胞悬浮液；通过混合分生孢子悬浮液、水、乳化剂和丙三醇来制备水相；通过向温的植物油混合物添加植物脂肪混合物来制备油相；将水相与油相混合以利用均质器获得油包水混合物或逆乳化制剂。产物可被用于种子处理、土壤应用和叶面喷洒。

美国专利号7,485,451也描述了逆乳剂(油包水乳剂)，所述逆乳剂包含选自活的和/或休眠的原核细胞和组织和/或真核细胞和组织的细胞材料，所述细胞材料与油包水乳剂相容。细胞材料的实例包括真菌、水霉、海藻、酵母、细菌、植物、昆虫和动物细胞。逆乳剂还包含油，诸如植物油和/或鱼油以及油溶性非离子表面活性剂和水。任选地，组合物包含增稠剂，诸如煅制二氧化硅或膨润土。

具有拮抗效应的香精油也已被研究。例如，摩洛哥柑橘(Moroccan)植物提取物抵抗密执安棒杆菌亚种(Clavibactermichiganensissubsp.Michiganensis)(CBM)(番茄细菌性溃疡的原因)的抗细菌活性被描述[AitBenAoumarA.等人Med.PlantsRes.6(17):4332-4338,2011]。另外，来自34种芳香植物的植物香精油抵抗CBM的功效被检查[PouvovaD.等人，Zemdirbyste-Agrucyktyre95(3):440-446,2008]。

最近，发现通过假单胞菌(Pseudomonas)属种LBUM300同时产生DAPG和HCN有益于由密执安棒杆菌亚种(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)引起的番茄细菌性溃疡病的生物防治[LanteigneC,等人，Phytopathology.102(10):967-73,2012]。

另外，在CBM岩棉-栽培(Rockwool-grown)温室番茄的生物防治上的尝试被描述。特别地，用CBM细菌死亡植物人工接种两年龄和三年龄岩棉板减少植物的死亡率[SlusarskiC.VegetableCropResearchBulletin69:125-1342008]。

总体描述

植物病害的生物防治通常被定义为通过应用对病原体表现出拮抗活性的一种或更多种生物体来抑制病原体。充当拮抗物的生物体被认为是生物防治剂(BCA)并且拮抗效应的机制基于BCA的多种生物特性。这些特性包括抗生素化合物的产生、催化病原体的细胞组分的分解的酶的表达、对于空间和营养素的竞争、使病原体寄生的能力和植物防御的诱导。

本公开内容旨在为农作物抵抗微生物感染的生物防治以及预防此类感染免于发展提供易于使用的包装。如将从以下描述变得明显的，提供了这样的包装使得在长期储存期间使生物防治组分彼此分离并在需要时易于以预先确定的浓度混合，而没有由包装组分造成环境污染的任何风险。已经发现，该包装配置确保所述组分的化学稳定性，即在长期储存之后无任何损害。

相应地，并且根据其第一方面，本公开内容提供了一种包装，所述包装包括：

-至少一个第一组分，所述至少一个第一组分包含颗粒物质，所述颗粒物质包含至少一种天然油；

-至少一个第二组分，所述至少一个第二组分包含微生物病原体的至少一种拮抗物；

其中所述至少一个第一组分和所述至少一个第二组分被容纳在所述包装的分开的隔室中。

在一些实施方案中，隔室被界定为形成包装的一部分的运载体(carrier)元件内的孔。

根据一些实施方案，包装包括：

(i)一个或更多个第一孔(隔室)，所述一个或更多个第一孔(隔室)容纳包含颗粒物质的第一组分，所述颗粒物质包含至少一种天然油；

(ii)一个或更多个第二孔(隔室)，所述一个或更多个第二孔(隔室)容纳第二组分，所述第二组分包含微生物病原体的至少一种拮抗物；

所述一个或更多个第一孔和一个或更多个第二孔各自具有顶部开口和从所述顶部开口向下延伸的凹槽，所述孔在基本上平面的矩阵中被保持在一起；和

(iii)第一薄膜，所述第一薄膜密封所述一个或更多个第一孔的开口；和

(iv)第二薄膜，所述第二薄膜密封所述一个或更多个第二孔的开口。

根据其第二方面，提供了用于提供抗细菌剂的方法，所述方法包括将包含颗粒物质的一个或更多个第一组分与包含微生物病原体的至少一种拮抗物的一个或更多个第二组分混合，以及，允许如此获得的混合物(mixture)(混合物(cocktail))形成乳剂，所述颗粒物质运载至少一种天然油。如此形成的乳剂表现出抗细菌活性。通过本文公开的组分制备的乳剂是稳定的乳剂，即持续至少几个小时、持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和甚至多达24小时无明显的相分离。

在一些实施方案中，所述方法使用了本文公开的包装。在一些实施方案中，包装的应用提供了包含颗粒物质、表面活性剂、至少一种天然油、和植物病原体的至少一种细菌拮抗物的组合物或乳剂。在一些实施方案中，拮抗物具有能够在作为唯一碳源的芝麻油上生长的时间。

又根据其第三方面，本公开内容提供了治疗或预防植物中的病原体感染的方法，所述方法包括将一定量的乳剂应用在所述植物上，所述乳剂包含颗粒物质、至少一种天然油和引起感染的病原体的至少一种拮抗物。

根据其第四方面，本公开内容提供了分离的拮抗细菌，所述分离的拮抗细菌具有被保藏在CBS-KNAW研究所且具有选自由以下组成的组的登录号的代表性样品：CBS133252、CBS133254、CBS133255、CBS133256、CBS133257、CBS133258、CBS133259、CBS134566、CBS134567和CBS134568。在一些实施方案中，这些拮抗细菌用于在保护或治疗植物免于病原体引起的感染中使用。

附图简述

为了更好地理解本文公开的主题并示例其可如何付诸于实践，现将参考附图仅以非限制性实例的方式描述多个实施方案，其中：

图1A-1D从不同的视角显示了组成根据本发明的实施方案的包装的一部分的运载体元件，图1A提供了等距视图，图1B提供了顶视图并且图1C和1D提供了图1B的X侧和Y侧的视图。

图2A-2B显示了根据根据本发明的实施方案的图1A-1D的运载体元件的视图，包括密封运载体元件的不同孔的薄膜。

图3A-3E从不同的视图显示了根据本发明的实施方案的运载体元件，图3A提供了等距视图，图3B提供了顶视图并且图3C、3D和3E提供了图3B的Z侧、X侧和Y侧的视图。

图4A-4C显示了与对照(图4C)相比，所选择的两种拮抗物对CBM(图4A)和黄单胞菌(Xanthromonas)(图4B)的生长的影响。

图5A至5E显示了在存在或不存在拮抗细菌的情况下，用植物病原体处理之后的多种病原体的皮氏培养皿。

图6是显示在暴露于密执安棒杆菌亚种(CBM)之后番茄的死亡率的图，在用CBM接种之前用根据本公开内容的一些实施方案的组合或用对照处理植株。

具体实施方式

本发明旨在提供适于长期储存的包装，并根据需要提供用于制备用于多种应用的抗微生物组合物的安全且容易的方法，所述多种应用诸如用于农作物保护。为此，已开发出具有两个(或更多个)孔或一组孔的包装，每个孔或孔组运载不同的组分。特别是由于隔室中的物质的不同物理和化学特征，包装被配置以使得两个(或更多个)孔被分别且不同地密封，如下文将进一步讨论的。

通常，所述包装包括：

-至少一个第二组分，所述至少一个第二组分包含微生物病原体的拮抗物；

其中所述至少一个第一组分和所述至少一个第二组分被容纳在所述包装的分开的隔室中。换句话说，只要试剂盒是密封的，两种组分就不被混合或不与彼此接触。

在第一组分和第二组分混合后(即，将两种组分从其各自的隔室中取出)，获得稳定的乳剂，适于应用到待治疗或保护的农作物上。所述乳剂以细小液滴的形式被应用。

在本公开内容的上下文中，术语“颗粒物质”用于指多个微粒形式的物质。微粒可为任何颗粒形式，包含但不限于从细圆珠到无定形结构。颗粒物质包括任何粉末形式。

在一些实施方案中，颗粒物质包含二氧化硅(silicadioxide)(SiO₂，在本文中被简称为二氧化硅(silica))。二氧化硅可以是诸如膨润土珠的天然地存在的二氧化硅颗粒，以及合成的二氧化硅珠。

在一些实施方案中，颗粒物质包含合成的二氧化硅颗粒。有多种合成的二氧化硅微粒可被用于本公开内容的上下文。例如，颗粒物质可以包含沉淀的合成的无定形二氧化硅珠，诸如商业上可得的产品Tixosil和Aerosil200。

在一些其他的实施方案中，颗粒物质包含带有吸收天然油的能力的合成的或天然来源的珠。此类珠可包括但不限于乳胶珠；碳酸钙吸附剂微粒；纤维素珠；聚苯乙烯吸附剂珠例如，其是疏水交联的聚苯乙烯共聚物吸附剂树脂；木炭；Sepharose^TM珠；乳化剂-藻酸盐珠；壳聚糖珠；藻酸钠；苯乙烯-顺丁烯二酸共聚物珠和苯乙烯-二乙烯基苯珠；纤维素纸珠。

为了允许最终的乳剂的良好分布并根据一些实施方式，颗粒物质(微粒)具有在10-25μm范围内的尺寸分布。

颗粒物质还可以通过，但并不限于表面积和油容量的一个或更多个来表征，在一些实施方案中，所述表面积在400-500m²N₂/g的范围内，并且油容量在300-350DBP/100克颗粒的范围内。

第一组分包含容纳一种天然油或天然油的组合的颗粒物质。在本公开内容的上下文中，要理解“天然油”包括从自然界获得的任何有机油。

天然油优选地是源自植物的油。在一些实施方案中，天然油被称为香精油。香精油优选地是已知表现出抗微生物(例如，抗细菌的、抗真菌的、抗线虫的)特性的那些。

当提及抗微生物特性时，其要被理解为有效地抵抗如以下进一步讨论的任何微生物病原体。

虽并不限于以下所列，待使用的根据本公开内容的香精油可以是源自以下植物的那些：牛至(Origanumvulgare)和牛至属(Origanumspp.)(例如，牛至(Oregano))、薄荷属(Menthaspp.)(薄荷)、百里香属(Thymusspp.)(百里香)、香桃木属(Myrtusspp.)、罗勒属(Ocimunspp.)(例如，罗勒(Ocimunbasilicum)，也被称为罗勒(Basil))、薰衣草属(Lavandulaspp.)(例如，薰衣草)、姜味草属(Micromeriaspp.)、芫荽属(Coriandumspp.)(例如，芫荽/荷兰芹)、阿莱藤属(Aloysiaspp.)、Melissaspp.、鼠尾草属(Salviaspp.)、欧芹属(Petroselinumspp.)、迷迭香属(Rosmarinusspp.)(例如，迷迭香)、夏枯草属(Prunellaspp.)、孜然芹属(Cuminumspp.)(例如，孜然芹)。

在一些其他的实施方案中，天然油是被拮抗微生物用作碳源，例如用作养料/营养素的植物来源的油。在本文中这些被称为术语“碳-基础油”或“富含碳的营养油”。在一些实施方案中，碳-基础油是植物油。不限于此，碳-基础油选自由以下组成的组：芝麻油、橄榄油、花生(Peanut)油、棉花籽油、大豆油、棕榈油、葵花油、红花油、菜籽油、蓖麻油、椰子油、落花生(groundnut)油。

在一些实施方案中，当以复数使用时，术语“天然油”包括至少一种香精油和至少一种碳-基础油的组合，所述至少一种香精油和所述至少一种碳-基础油两者均是天然来源的。

在一些实施方案中，天然油至少包含牛至油与至少一种碳-基础油组合。有时，牛至油与至少芝麻油组合。

已意外地发现可以通过拮抗细菌在诸如芝麻油的碳基础油上生长的能力，将拮抗细菌从对至少CBM不表现出拮抗活性的其他细菌区分出。在一个实施方案中，所有的拮抗细菌在其上生长(而测试的非拮抗细菌不生长)的碳基础油是芝麻油。

取决于使用的天然油的类型、装载的量、颗粒物质的类型、将天然油装载到颗粒物质上的条件、用于装载的表面活性剂或溶剂等，第一组分内的(例如，由颗粒物质容纳的)天然油的量可以改变。

当提及将油装载到颗粒物质上时，要被理解为意指在油和颗粒物质(例如，二氧化硅颗粒)之间的任何形式的缔合。不限于此，油通过被吸收到颗粒上和/或被吸收进颗粒中而被颗粒物质容纳。颗粒和油之间的缔合是可逆的，即在合适的条件下，诸如当使与水接触时，油被容易地从颗粒释放，以形成乳剂。

在一些实施方案中，颗粒物质容纳按颗粒物质的总重量计(在装载之后)在20％至50％w/w之间的天然油。这通过常规技术诸如HPLC或GC色谱法来确定，如以下示例的。在一些其他的实施方案中，颗粒物质容纳约30％w/w的天然油(“约”包括在25-35％之间、有时在28％至32％之间或在30％周围的范围)。

在一些实施方案中，天然油仅包含香精油或包含至少一种香精油和至少一种碳-基础油的组合。像这样，当提及天然油时，要被理解为包含香精油以及碳-基础油。至少一种香精油和至少一种碳-基础油之间的比率在60:40和100:0的范围内，有时范围是约80:20。

当使用油的组合时，要理解它们可以一起被吸收到颗粒物质上，即相同的颗粒物质容纳超过一种类型的油。在一些实施方案中，为了易于操作，使每种油类型被分别地容纳在颗粒物质上，以使得形成不同类型的颗粒物质，每种通过其容纳的油的类型来表征。

因此，当提及以80：20的比率提供牛至和芝麻的颗粒物质时，要被理解为颗粒物质的两个群体的混合物，80％运载牛至油并且20％的类型运载芝麻油；或颗粒的单个群体，每个颗粒以定义的或期望的比率吸收两种油(即，油是预先混合的并且然后与吸收运载体/颗粒接触)。不考虑油的类型，在颗粒物质总重的20％至50％w/w之间的颗粒物质由在其上装载的油提供。

颗粒物质还可包含至少一种表面活性剂。如领会到的，表面活性剂是降低液体的表面张力以及同样地两种液体之间的界面张力的化合物，以允许形成例如乳剂。表面活性剂可以是在本领域被认为使用安全的(例如，对植物或动物无毒的)任何种类，包括离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂以及两性离子(或非离子)表面活性剂。

在一些实施方案中，表面活性剂是有机农业中可接受的类型。根据本公开内容待使用的可能的表面活性剂的非限制性列举包括聚乙烯乙二醇山梨醇酐三油酸酯(Tween，例如，Tween85、Tween65)、山梨醇酐脂肪酸酯(例如，Span40)。

在一些其他的实施方案中，表面活性剂包括脂肪酸的盐。盐可包括碱性的如钾盐、钙盐、钠盐以及铵盐。

在一些实施方案中，脂肪酸的盐包括脂肪酸的钾盐(也被称为肥皂盐)，有时被用作杀虫剂、除草剂、杀真菌剂和/或除藻剂。在一些实施方案中，可通过将氢氧化钾添加到天然的脂肪酸来获得脂肪酸的钾盐，所述天然的脂肪酸诸如在动物脂肪中和在植物油中发现的那些。可以从橄榄、棉籽、大豆、花生、向日葵、椰子、棕榈、油菜籽、芝麻油、苋菜、玉米、麻风树提取脂肪酸。

形成表面活性剂的脂肪酸还可以是合成的脂肪酸以及半合成的(例如，经过修饰的天然的脂肪酸)。

根据一些实施方案，至少一种表面活性剂为被识别为或标记为具有杀虫剂和/或杀真菌剂活性的表面活性剂。不限于此，杀虫的和/或杀真菌的表面活性剂可包括商用产品ZoharPT-50和ZoharLQ-215，两者均由ZoharDalia,Israel生产。

在一个特定的实施方案中，表面活性剂选自ZoharPT-50和ZoharLQ-215。

这些表面活性剂的成分是从ZoharDalia可得的。例如，已知ZoharPT-50具有以下成分：

本文提供的结果显示如本文公开的脂肪酸的盐在粉末的稳定性和/或乳化特性、和抗微生物活性方面具有超过其他已知的表面活性剂的一些优势，所述其他已知的表面活性剂诸如商业上已知的Tween20或Tween80。

第一组分中的表面活性剂的量可变化。但是，在一些实施方案中，颗粒物质包含在5％至10％w/w之间的表面活性剂或表面活性剂的组合。

包含颗粒物质的第一组分为基本上干燥的形式。当提及“基本干燥”时，要理解，第一组分可以包含低量的水，在一些实施方式中，不超过10％(w/w)。在一些其他或另外的实施方案中，第一组分中的水含量在1％至7％(w/w)的范围内。在仍然一些其他的实施方案中，“基本干燥”要被理解为不包含通过常规方法检测到的水(即，不可检测的量的水)。

第一组分可以包含一些痕量的有机溶剂。如以下将进一步讨论的，溶剂可以是制备颗粒物质所必需的并且一些残留量可以保留，只要溶剂是无毒的。在一些实施方案中，第一组分是无溶剂的(即，含有不可检测的量的有机溶剂)或包含微量即不超过5％、4％、3％或甚至2％w/w的有机溶剂。溶剂通常是有机挥发性的极性溶剂，诸如但不限于选自由以下组成的组的溶剂:丙酮、异丙醇、乙腈、乙醇和甲醇。

在一些实施方案中，在第一组分中检测到痕量乙醇。

一旦使颗粒物质与水接触，第一组分的颗粒物质在其形成稳定的乳剂的能力上是独特的。特别是由于第一组分中表面活性剂的存在，这点被实现。表面活性剂在使组分干燥之前被添加到带有油的颗粒中。

在本公开内容的上下文中，当提及稳定的乳剂时，要被理解为指在乳剂形成之后，油(被分散的相)在水(分散媒介物)中分散持续至少1小时、有时至少2、3、4、5、10或甚至24小时的时期。换句话说，稳定性通过不分离成油相和水相来确定。可以通过本领域已知的任何方式来确定不分离，包括可视检测。

不受理论束缚，发明人的立场是在颗粒物质中并入表面活性剂有助于形成的乳剂的稳定性。根据下文提供的非限制性实例这点也是明显的，其中脂肪酸的钾盐的使用显示出在稳定性和安全性方面优于其他类型的商业可得的表面活性剂的优势。

为了形成乳剂，颗粒物质混有水。水的量取决于颗粒物质的量。在一些实施方案中，对于每克颗粒物质(其30％是油)，添加水以提供一升乳剂。像这样，在1升乳剂中，0.1g颗粒物质提供0.03％(v/v)的油浓度。在一些实施方案中，在最终的乳剂中油的百分比在0.03％和2％v/v的范围内。

在一些实施方案中，将颗粒物质与水混合提供了具有在1μm至20μm之间的范围的液滴尺寸的乳剂并且在一些实施方案中，在3μm至10μm之间的范围。

在一些实施方案中，乳剂是抗微生物乳剂。

包装包括第二组分，所述第二组分包含微生物病原体的至少一种拮抗物。

在一些实施方案中，微生物病原体的至少一种拮抗物被容纳在凝胶或类凝胶运载体中。为了形成用于运载拮抗物的凝胶形式，可以使用多种材料。

例如，可以从多糖或多糖与其他物质的组合形成凝胶。

根据一些实施方案，凝胶选自由以下组成的组：琼脂凝胶(琼脂-琼脂)瓜尔胶、明胶、黄原胶、甲基纤维素凝胶(纤维素胶)、果胶基底凝胶、明胶凝胶、和本领域已知的其他凝胶。

在一些实施方案中，第二组分包含琼脂-琼脂，从而形成容纳微生物拮抗物的凝胶。

在本公开内容的上下文中，当提及微生物病原体的拮抗物或病原体拮抗物时，要被理解为抑制植物病原体(植物病原体(plantpathogen)也可被称为植物病原体(phytopathogen))的生物学实体。抑制，在本公开内容的上下文中要被理解为以至少50％、至少70％、至少90％地减少病原体的生长或甚至基本上消除病原体。在本发明的上下文中，植物病原体可以是任何原核或真核生物，包含但不限于细菌、真菌、原生动物、线虫或引起寄生虫的任何其他病害。因此，至少一种拮抗物的微生物活性可以是抗菌的、抗真菌的、抗原生动物的、抗线虫动物等的任何一种。

在一些实施方案中，第二组分包含至少一种拮抗物。在一些其他实施方案中，第二组分包含拮抗物的混合物。混合物要被理解为以相同的或不同的浓度组合在一起的两种或更多种、有时3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种拮抗物的组合。

在一些实施方案中，如以下表3所显示的，所述至少一种拮抗物是能在作为唯一碳源的芝麻油上生长的类型。此类拮抗物可通过以下来容易地鉴定：利用芝麻作为唯一碳源进行常规培养测定并鉴定实验生长期间存活的那些栽培品种。

在一些实施方案中，拮抗物可被称为抑菌剂，即其减慢生物体的生长，并且在一些其他的实施方案中，拮抗物可被称为杀菌剂(bactericide)，即其杀死生物体。

在一些实施方案中，微生物病原体的至少一种拮抗物是土传拮抗物。在该上下文中，要理解可从对微生物病原体显示出耐受性(例如，部分地抵抗)或抵抗的植物的根、土壤和/或根际获得和分离所述至少一种拮抗物。

在一些其他的实施方案中，微生物病原体的至少一种拮抗物是植物来源的拮抗物，例如，从植物的部分诸如叶、茎、花、维管系统分离的。

微生物病原体的至少一种拮抗物也可以是现存的并且因此源自土壤(即，土传的)和源自植物的部分(例如，维管系统)。

根据一些实施方案，拮抗物是引起番茄植株中的感染的病原体。

又在一些实施方案中，拮抗物是针对这样的病原体的：针对其的治疗是期望的。

第二组分可以包含一种或更多种拮抗物。在一些实施方案中，第二组分在相同的凝胶中包含若干种拮抗物的组合。但是，在一些其他的实施方案中，当使用拮抗物的组合时，它们各自通过分开的凝胶运载并且仅在使用之前混合。换句话说，第二组分是若干种“第二组分”的组合，其中每种拮抗物被分开地保持并取决于待处理的病原体的类型在暴露植物之前组合。

当使用拮抗物的组合时，可以以相同的量(CFU/ml)或以不同的量将拮抗物提供/应用至植物。

根据一些实施方案，第二组分中的拮抗物的量(作为单一的拮抗物或作为拮抗物的混合物)可在500CFU/ml至5000CFU/ml之间的范围内。当作为混合物使用时，取决于待处理的病原体的类型，拮抗物之间的比率可以改变，且可通过常规实验室方法提前确定，所述常规实验室方法例如，在培养皿中最好的抑菌/杀菌效果。

拮抗物的类型将取决于待由包装处理的病原体的类型。

在一些另外的实施方案中，病原体是密执安棒杆菌亚种(CBM)。在该实施方案中，已从对CBM表现出耐受性的番茄植株分离的一些拮抗物选自由以下组成的非限制性组：假单胞菌属的种(登录号CBS133252)、嗜碱性假单胞菌(登录号CBS133254)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)(登录号CBS133255)、Pseudomonascedrina(登录号CBS133256)、假单胞菌属的种(登录号CBS133257)、假单胞菌属的种(登录号CBS133258)、Pseudomonasspanius(登录号CBS133259)。

本领域已知的其他拮抗物，诸如在InternationalOrganizationforBiologicalandIntegratedControlofNoxiousAnimalsandPlants的报告的表4[由PhilippeC.Nicot2011编辑]中提供的那些，其内容通过引用被并入本文。

在一些其他的实施方案中，其他植物的拮抗物可以形成本文公开的包装的第二组分的部分。这些可以包括其他农作物，诸如但不限于源自茄科(Solanaceae)的那些，例如，番茄、胡椒、茄子、马铃薯；源自葫芦科(Cucurbitaceae)的那些，例如，西葫芦、甜瓜、葫芦、黄瓜、南瓜、丝瓜(luff)和西瓜，但是还包括其他的生种子的植物，包括园艺植物、树等。包装通常包括使用第一组分和第二组分形成待被应用至植物上的乳剂的说明。说明包括至少将第一组分与第二组分、任选地与另外的量的水混合，以形成乳剂。在一些实施方案中，乳剂中的至少一种拮抗物的浓度是最小1000CFU/ml、或在500CFU/ml至5000CFU/ml的范围内。

另外，可以在多个文献中发现拮抗物，诸如但不限于以下，通过引用将其并入本文。

如以上记录的，在一些实施方案中，拮抗物是能够在作为唯一碳源的芝麻油上生长的类型。

为了制备乳剂，有时可以添加水。当添加水时，水的量将取决于第一组分的量。在一些实施方案中，对于每克第一组分(例如，其30％是油)，添加水以提供一升乳剂。像这样，在1升乳剂中，0.1g颗粒物质提供0.03％v/v的油浓度。

在一些实施方案中，在最终的乳剂中的油的百分比在0.03％和2％v/v的范围内。

根据上述，可通过包括20克第一组分(其30％是油)的粉末、和120ml第二组分的拮抗物凝胶的包装来提供最终的制剂，并且说明书可以包括将第一组分和第二组分与水混合，以形成含有0.3％v/v油的20升乳剂。

相似地，包装可包括50克或100克第一组分的粉末、和120ml第二组分的拮抗物凝胶，并且说明书可包括将第一组分和第二组分与水混合，以形成50或100升乳剂。

在一些实施方案中，在包装中以分开的单位提供第二组分，每个单位在凝胶中运载不同的拮抗物。例如，含有总的120ml凝胶的包装，凝胶可组成若干个凝胶单位，每个凝胶单位运载相同的或不同的拮抗物，例如，8个凝胶，每个凝胶15ml。这允许根据需要选择待使用的拮抗物的类型并改变混合物中的组合，以提供更好的病原体生物防治。

本公开内容的包装适于提供新的乳剂。在这个方面，本公开内容还提供了包含颗粒物质、表面活性剂、至少一种天然油和至少一种细菌拮抗物的乳剂，均如作为包装组分而在本文中定义的，其中至少一种拮抗物是将在作为唯一碳源的芝麻油上生长的类型。

本文公开的包装特别地适于预防或治疗植物中的病原体感染。治疗可包括抑制病原体生长(抑菌效果)以及全部消除病原体感染(杀菌效果)。

在一些实施方案中，治疗或预防是对由密执安棒杆菌亚种(CBM)引起的感染的治疗或预防。

在一些实施方案中，治疗或预防是对由辣椒疮痂病菌引起的感染的治疗或预防。在一些其他的实施方案中，治疗或预防是对由疮痂链霉菌引起的感染的治疗或预防。

在一些实施方案中，治疗或预防是对属于茄科的植物中的感染的治疗或预防，所述茄科植物例如，番茄、胡椒、茄子、马铃薯。在一个实施方案中，植物是番茄植株。

在一些实施方案中，根据本公开内容的包装包括

-运载体元件，所述运载体元件包括使一个或更多第一隔室/孔和一个或更多个第二孔/隔室保持在一起的基本上平面的矩阵，所述一个或更多个第一隔室/孔用于运载包含颗粒物质的至少一个第一组分，所述颗粒物质包含至少一种天然油，所述一个或更多个第二孔/隔室用于运载包含微生物病原体的至少一种拮抗物的至少一个第二组分；所述一个或更多个第一孔和所述一个或更多个第二孔各自通过顶部开口和从顶部开口向下延伸的凹槽被界定；

-第一薄膜，所述第一薄膜密封一个或更多个第一孔的开口；和

-第二薄膜，所述第二薄膜密封一个或更多个第二孔。

如所领会的，每个孔是单独的实体并仅在打开密封薄膜之后，一个孔与另一个孔的内含物的混合才是可能的。

在图1A-1D中图示了运载体元件的非限制性实例，提供了元件100的等距视图(图1A)以及顶视图和侧视图(图1B至1D)，所述元件100包括平面矩阵110，所述平面矩阵110包括单个第一孔120和被间隔开的多个第二孔130。在该非限制性实例中，第一孔120可以可逆地安装在设置于平面矩阵110中的凹陷140中。在一些其他的实施方案中，可安装的孔诸如孔120可被安装在平面矩阵110(未图示)中的开口(洞)内。可选地，第一孔可形成为平面矩阵110的一个完整的部分(未图示)。

在该特定的实施方案中，多个第二孔130形成为平面矩阵110的一个完整的部分。在可选的实施方案中，任何一个第二孔130可以是可以可逆地安装在凹陷140中(如关于第一孔120所示的)或设置在平面矩阵中的开口中(未显示)的类型。根据该实施方案，第一孔120实际上是可在使用之前从平面矩阵的凹陷(以容纳孔的形式)移除的杯状类型。

运载体元件100还包括手柄形式的抓持单元150。抓持单元可具有其他形式和形状，以使当从包装拉去且移除密封薄膜以释放第一和第二孔的内含物时，便于稳定且牢固地握持运载体元件。

根据该非限制性实施方案，经配置用于容纳拮抗物细菌的第一孔110的内部直径A可以是80-300mm，并且有时在100mm-200mm、或120mm-150mm之间的范围内。经配置以容纳相同或不同的细菌拮抗物的第二孔130的内部直径B在20-40mm的范围内，有时在25-35mm之间的范围内。孔通常具有20-60mm、有时在20-30mm的范围内的深度。

在一些实施方案中，包装的总尺寸是500-550mm长，和30-40mm宽。

图1B的视图，图1C还显示了用于容纳第一孔120的凹陷(凹槽或容纳孔)140，凹陷140相对于运载体元件的顶侧160向下延伸。图1D是图1B的Y侧的元件100的另一个视图。

第一薄膜和第二薄膜可以各自单独地覆盖和密封各自的第一孔和第二孔。根据一些实施方案，并且同时如图2A和2B中所示，如在图1A至1D中所示的运载体元件100与部分地覆盖第一孔120的开口的第一薄膜170和叠加在第一薄膜170上且覆盖(密封)第二孔130的第二薄膜180结合。第一薄膜170和第二薄膜180可以固定地彼此附接，以使得在拉掉第二薄膜180后，第一薄膜170也被拉掉，从而允许基本上同时地打开第一孔120和第二孔130。但是，第一薄膜170可以相似的方式与第二薄膜180分隔开，以允许单独打开第一孔120和第二孔130。

现在转向图3A-3E，提供了用于在根据本公开内容的另一个实施方案的包装中使用的元件。因此，为了简化起见，像在图1A-1D中使用的参考数字，变化100后被用于标识图3A-3E中具有相似功能的组分。例如，图1A中的部件110是与图2A中的孔210具有相同功能的孔。

具体地，图2A是等距视图，图3B是顶视图且图3C至3E是元件200从Z侧、X侧和Y侧的侧面视图，元件200具有一般的长方形的(矩形的)形状，平面矩阵210包括可可逆地安装在设置于平面矩阵210中的凹陷240中的单个第一孔220和被间隔开的多个第二孔230。根据该非限制性实施方案，第一孔220和第二孔230的形状是多边形的，在该特定的实施方案中，是四边形的。

另外，根据该非限制性实施方案，第二孔230作为运载体元件200的一个完整的部分显示，但是所述第二孔230同样地可以是可拆卸的孔，如在图1A的非限制性实例中所显示的。

根据该实施方案的运载体元件的尺寸可以不同于元件100所提供的尺寸，并且在该特定的实施方案中，可具有以下总尺寸：200-300mm长、和150-250mm宽，具有较深，即具有在50-60nm之间的范围的深度的孔。

如所领会的，运载体元件的尺寸以及特别地从而提供的孔的尺寸可以取决于包装的特定应用和借以运载的材料而变化。本领域技术人员会容易地领会到在尺寸上所需要的改变，以使运载体适合特定应用。

如以上详述的，根据本公开内容的包装的第一孔容纳含油物质的成分。正因如此，至少所述一个或更多个第一孔由油相容性聚合物形成。当提及油相容性聚合物时，要被理解为指惰性的且不会改变包含天然油的复合材料的特性的聚合物。为了相同的原因，覆盖第一孔的第一薄膜包括油相容性聚合物。

在一些实施方案中，各自的第一孔的第一薄膜是或包含油相容性热塑性聚合物。

在一些实施方案中，需要使组合物材料保持干燥形式。为了这个目的，第一薄膜是流体不可渗透的聚合物。在本领域中，这被称为高阻隔(HB)薄膜。HB薄膜可通过以下来定义：对H₂O的渗透性在3-4g/m³/24hr的范围内，并且对O₂的渗透性在6-8cm³/m²/24hr的范围内。

可形成第一薄膜的HB聚合物的一些非限制性实例是源自聚烯烃类、聚乙烯类、聚酯类中的任一种的那些HB聚合物。

HB薄膜通常是能容易地从运载体剥离的类型的薄膜。

在一些实施方案中，第一密封薄膜是具有在40-100μm的范围内、有时在60-80μm之间的厚度的薄片制品。

转向一个或更多个第二孔，根据一些实施方案，因为第二孔运载活体物质，所以期望这些第二孔的密封薄膜即第二薄膜是气体可渗透的。根据一些实施方案，第二薄膜是对氧气或含氧气体可渗透的。为了这个目的，第二薄膜对H₂O的渗透性可以在8-10g/m³/24hr的范围内并且对O₂的渗透性为约1,200cm³/m²/24hr。

第一薄膜和第二薄膜可以包括热塑性薄膜，所述热塑性薄膜包含单一的聚合物或聚合物的共混物，所述聚合物选自由以下组成的组：双轴取向的聚乙烯对苯二甲酸酯(BOPET)、双轴取向的聚丙烯(BOPP)、聚偏二氯乙烯(PVDC)、聚乙烯丙纶、聚乙烯醇。

在一些实施方案中，薄膜包含双轴取向的聚丙烯(BOPP)。在一些其他实施方案中，薄膜是带有另外的聚合物诸如聚乙烯(PE)的BOPP的薄片制品。薄片制品可以包括两个、三个、或更多个薄片层。待使用的薄膜是例如从Glob-Plast(Plastart,Israel)商业上可得的，并且是在本领域中被广泛地使用的。

本公开内容还提供了用于治疗或预防植物中的病原体感染的组合物的方法，所述方法包括将包含颗粒物质的第一组分与包含微生物病原体的至少一种拮抗物的第二组分混合，所述颗粒物质包含至少一种天然油，以及允许所述混合物形成乳剂。在本文中得到的乳剂可被称为抗-微生物(例如杀细菌、杀真菌等)有效的乳剂。

根据该方法的方面，第一组分和第二组分如本文所定义。

混合还可需要添加水，以形成乳剂。在一些实施方案中，混合提供了具有在1μm到20μm之间的范围内的液滴尺寸的乳剂，并且在一些实施方案中在3μm至10μm之间的范围内。

本公开内容还提供了治疗或预防植物中的病原体感染的方法，所述方法包括向所述植物应用一定量的乳剂，所述乳剂包含颗粒物质、至少一种天然油和微生物病原体的至少一种拮抗物。根据本公开内容的这个方面，优选地紧接在应用之前，通过混合如本文定义的第一组分和第二组分来获得乳剂。

在一些实施方案中，治疗或预防的方法包括将乳剂应用到植物上。乳剂的应用可通过农业中已知的任何方式，包含但不限于喷洒植物，灌溉。

在仍然一些其他的实施方案中，治疗或预防可包括应用到植物块茎上，如喷洒马铃薯块茎(有时，被称为低位喷洒(lowspraying)块茎)。

可以将乳剂应用于植物一次，以获得抗-微生物效果，或者两次或更多次。当应用多于一剂时，可以以在一日间隔到多于一日(两日、三日和更多日间隔)之间的应用之间的时间间隔来提供剂。不同的剂在拮抗物的量、天然油的量或两者的量上可以是相同的或不同的，并且在提供的拮抗物和/或天然油的类型上可以是相同的或不同的。

在一些实施方案中，当应用多于一个剂量时，多次应用的间隔在2至10日之间、有时在3至8日之间。

在一些实施方案中，对植物提供至少2、3、4和有时至少5个剂量的根据本公开内容提供的乳剂。

处理的频率和剂量的量取决于感染的类型(例如，它是如何猛烈/有害/威胁死亡的)、感染的严重性(如果已经发展)、环境条件等。农业技术人员将能够基于通常使用的参数确定处理时间表。

为了预防感染的发展，根据一些实施方案，需要从植物的种植当天或从疑似感染的第一天将乳剂应用于植物。

为了治疗感染，根据一些实施方案，需要从检测疑似感染的当天将乳剂应用于植物。

本公开内容还提供了选自由以下组成的组的分离的拮抗细菌：假单胞菌属的种(登录号CBS133252)、嗜碱性假单胞菌(登录号CBS133254)、枯草杆菌(登录号CBS133255)、Pseudomonascedrina(登录号CBS133256)、假单胞菌属的种(登录号CBS133257)、假单胞菌属的种(登录号CBS133258)、假单胞菌属的种(登录号CBS134568)、Pseudomonasspanius(登录号CBS133259)、地中海假单胞菌(登录号CBS134566)、绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)(登录号CBS134567)和假单胞菌属的种(登录号CBS134568)。

在一些实施方案中，分离的拮抗细菌在运载体内。在一些实施方案中，所述运载体是如上文中定义的凝胶或类凝胶运载体。

分离的细菌可以具有多种应用。在一些实施方案中，单独的或作为细菌混合物的分离的细菌可以被用于治疗或保护植物免于由病原体引起的病害，所述病原体诸如以上公开的那些。以下是执行本发明的一些非限制性实例。如将被显示的，用于防治植物病害的制剂，油成分以及芝麻油或其替代品和牛至油及其替代品之间的比率为大约恒定的(1：0.25(w/w)比率的牛至油：芝麻油)，然而补充至油制剂的其他物质的量根据植物、害虫和环境条件而改变。除了可能的细菌之外的至少一种拮抗细菌与用于植物病害的防治的油制剂组合使用。

非限制性实施例的描述

研究由三部分组成：(i)病原体和潜在的拮抗物的分离和增殖；(ii)抵抗密执安棒杆菌亚种(CBM)的潜在的拮抗物的体外筛选，和(iii)用于防治番茄上的细菌性枯萎病的所选择的拮抗物的体内评价。

病原菌和潜在的拮抗细菌菌株的分离

使番茄植株(Daniela,Hazera,Israel)在具有滴灌系统的每个苗床上，以双排植株的方式在温室中生长。以每行每米约3株植物种植种苗并根据Dutch(Holland)方法栽培。对小块土地监视CBM感染的发展。感染后，鉴定经历所述感染而存活的植株，并将含有根部、土壤(在30cm的深度)和根际的样品放入无菌的袋内并运送至实验室。

在实验室中，将10克各自含有根部、土壤和根际的样品引入至含有90ml0.1％w/v的琼脂溶液的均质袋(stomacherbag)(用重蒸馏水(DDW)稀释、密封并在121℃、1atm的高压灭菌器内杀菌20分钟)中。在灭菌之后，在20rpm的速度和室温下振荡样品2小时。然后，将袋转移至均质器(stomacher)装置中以中速持续1分钟。

在使样品均质(stomaching)之后，通过无菌的剪刀打开每个袋，并在各自含有9ml琼脂溶液(0.1％w/v)的无菌管中制备样品的多种稀释液。第一次稀释是将1ml样品加到9ml琼脂中(xl0^-2稀释)，并继续直到xl0^-8稀释。

从每个稀释的样品中转移100μl到皮氏培养皿内，补充选自以下琼脂之一的培养基：马铃薯右旋糖琼脂(PDA,Difco)、营养琼脂、假单胞菌琼脂F(Difco)并在孵箱(28℃)内孵育5天。标记那些感兴趣的克隆并利用细菌针将其转移到新鲜的培养基中(与分离之前培养所使用的培养基相同)，以获得分离的单个类型的潜在的拮抗物的微生物克隆。

分离的拮抗物的增殖

从生长在层流罩下的琼脂平板上的微生物纯化怀疑具有拮抗效应的微生物克隆并再培养于锥形烧瓶中的含有蛋白胨(10g/升)、酵母提取物(20g/升)、丙三醇(10g/升)、MgSO₄(0.1g/升)、CaCO₃(2g/升)的培养液体培养基中。每个烧瓶接收单个分离的克隆用于作为纯的拮抗物培养并将每个烧瓶用塑料盖盖上、在高压灭菌器中在121℃下灭菌20min、并在室温下保持一天。

CBM和/或黄单胞菌属(Xanthomonas)的有效拮抗物的筛选

通过利用细菌针将每个疑似拮抗物转移到含有补充有0.1％酵母提取物和1％丙三醇的NA培养基(营养琼脂培养基)皮氏培养皿内，筛选显示出拮抗活性的有效地体外抑制病原体的培养物。将细菌置于培养皿上的直线上，并且然后在28℃下将培养皿孵育24小时。在孵育时间之后，将CBM病原体接种在垂直于细菌线的虚线上，并将培养皿恢复培养另外的3天的时间。如果细菌具有拮抗活性，在孵育日期间细菌线和病原体线之间形成间隙，具有较大的间隙形成的那些细菌被选择为潜在拮抗物。这些细菌由centerofCentraalbureauvoorSchimmelcultures,(FungalBiodiversityCentre,InstituteofRoyalNetherlandsAcademyofArtsandScience(CBS-KNAW))进一步鉴定。

表1提供了于2012年11月19日保藏在CBS-KNAW研究院并用于最终的组合/混合物的菌种的列表。这些菌种贮存在-80℃下的丙三醇溶液中(15％)。

表1：保藏的拮抗物

另外，图4A-4C显示了从与拮抗细菌相同的来源分离并在无芝麻油的培养基上生长的为非-拮抗细菌的对照(对照细菌，图4C)的影响相比，拮抗物Pseudomonascedrina(CBS1333256,"AN4")(图4A)和假单胞菌属的种(CBS1333258,"AN19")(图4B)对CBM和黄单胞菌属(平板上两个分开的扩散体/线)的生长的影响。特别地，在图4A和图4B中显示出非生长区，其中CBM和黄单胞菌属的病原体扩散体没有朝向拮抗线生长。在对照图4C中，CBM和黄单胞菌属的病原体扩散体到达对照细菌线。这些结果显示，AN4和AN9对至少CBM和黄单胞菌属具有拮抗活性。

对每个分离的细菌进行相同的实验，这产生了表1的拮抗细菌的列表。

制备拮抗微生物凝胶

分别将分离的拮抗物转移到锥形烧瓶内，所述锥形烧瓶含有用于增殖的培养基(蛋白胨(10g/升)、酵母提取物(20g/升)、丙三醇(10g/升)、MgSO₄(0.1g/升)、CaCO₃(2g/升))，补充有15％粒状琼脂(Difco)且每种拮抗物浓度在10⁷至10⁸CFU/ml之间，并在28℃下振荡72h。然后，在室温下，使得到的类凝胶混合物保持凝胶形式，直到使用。已显示拮抗物可以以这种形式储存多达12个月，细菌群体减少不超过2的对数级(logarithmicorder)。

确定用于保持拮抗物的培养基

为了确定用于贮存拮抗细菌的最适当的培养基，测试以下可能的贮存培养基：

测试的拮抗细菌：

测试的拮抗细菌是CBS133252；CBS133255和CBS134567。

使每种拮抗细菌在含有AN培养基的皮氏培养皿上生长48h。将每种细菌的克隆从生长培养基的表面收集到无菌蒸馏水中，至10⁹CFU/ml的最终浓度。

测试的贮存培养基：

a.蒸馏水(DW)

b.79％牛至油和19％芝麻油和2％DW。

c.DW中的4％牛至油和0.8％芝麻油。

d.包含以下的乳剂：DW中的4％牛至油、0.8％芝麻油+0.05％Tween80(表面活性剂80(产品号：P4780商标：Sigma))。

e.为软凝胶的拮抗培养基(“AN培养基”)，所述拮抗培养基包含酵母提取物(20g/升)、丙三醇(10g/升)、MgSO₄(0.1g/升)、CaCO₃(2g/升)，补充有0.15％粒状琼脂(Difco)。

制备贮存培养基：

在无菌条件下，将每种测试的贮存培养基(9ml)倒入15ml无菌管内。对于每种测试的贮存培养基，总共有120个管。

对于每个管，添加1ml预先制备的拮抗细菌制品(10⁹细胞/ml)，接种到每个管中，至每个管中测试的细菌的终浓度为10⁸CFU。在25℃左右的室温下，将接种过的管孵育300天的时期。

评估在多种贮存培养基中测试的细菌的存活:

在孵育的294天期间，定期地从每个管获取样品(每个5个重复)。从每个管制备1到10^-8的无菌蒸馏水中的十倍稀释。然后，从每个稀释液中，喷洒100微升到表面AN培养基上。在25℃下孵育持续5天之后，以特定时间处取的初始测试管的CFU/ml评价该群。结果是在每个时间处的5次重复的平均值。

结果：

存活结果被归纳于以下表2A-2E中。

表2A-拮抗细菌在蒸馏水中的存活

自接种起的天数	CBS133252	CBS133255	CBS133255
				1	3.1X10⁸	2.6X10⁸	1.8X10⁸
14	1.6X10³	lX10⁶	4X10³
				28	40	6X10³	10
42	0	2X10²	0
				56	0	20	0
70	0	0	0
				84	0	0	0
98	-	-	-
				112	-	-	-
126	-	-	-
				140	-	-	-
154	-	-	-
				168	-	-	-
189	-	-	-
				210	-	-	-
231	-	-	-
				252	-	-	-
273	-	-	-
				294	-	-	-

表2B-拮抗细菌在79％牛至油、19％芝麻油和2％DW中的存活

表2C-拮抗细菌在DW中的4％牛至油和0.8％芝麻油中的存活

表2D-拮抗细菌在乳剂(DW+0.05％Tween80中的4％牛至油、0.8％芝麻油)中的存活

表2E-拮抗细菌在凝胶(酵母提取物、丙三醇、MgSO₄、CaCO₃、粒状琼脂)中的存活

特别地，表2A至2E中展示的结果显示三种测试的拮抗细菌在四种先测试的贮存培养基中的存活显著地不同于基于凝胶的培养基。

特别地，只有凝胶(含有琼脂的)培养基支持拮抗细菌的长期的(294天)存活。在实验结束时，CBS133252和CBS133255的群体在5.0X10⁴CFU/ml以上，而存活的CBS133255达约8.0X10⁵的水平。在所有其他测试的培养基中，在约40天之后，拮抗细菌无存活。

拮抗细菌的进一步表征

为了进一步表征拮抗细菌，已研究了细菌(以及非拮抗物)在多种碳源材料上生长的差异。特别地，检查了10种拮抗细菌和6种非拮抗细菌在作为单独的碳源的芝麻油、葡萄糖或丙三醇上的生长。无碳源的培养基被用作对照。

材料

生长培养基包括：

细菌贮存溶液包括：

从24h细菌培养物收集细菌，从所述细菌制备用蒸馏水1:100稀释的在480nm下吸光度为0.65溶液。

方法

将含或不含测试的碳源的十毫升生长培养基倒入30ml锥形烧瓶内并用100μl选择的细菌溶液接种。将接种的烧瓶在26℃下孵育24h并且然后经受十倍稀释并计数。水用作对照。

表3提供了对于每种测试的碳源和细菌的菌落形成单位/ml。在表3中，将来自表1的分离并储存的细菌与如以上描述的从土壤分离的细菌比较，但是发现无拮抗活性，这些被称为Pseudomonasspp.12(P.spp12)、Pseudomonasspp.13(P.spp13)、Pseudomonasspp.14(P.spp14)、Pseudomonasspp.15(P.spp15)、Bacilusspp.36、大肠杆菌(E.coli)4。

表3中的结果显示，未鉴定到拮抗活性的细菌不能在作为唯一碳源的芝麻油上生长。

表3：细菌生长

检验香精油的抗菌效果

材料和方法

为了检验香精油的抗菌效果，进行以下测定。

油：具有以下详细信息的牛至油：原产地：保加利亚；植物部分(plantparts)：开花植物；培养方法：有机认证，提取方法：蒸汽蒸馏。

细菌菌株：从以色列的G.Kritzman教授的收集物获得大肠杆菌、金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙门氏菌(Salmonella)、棒形杆菌(Clavibacter)和野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)。

纸片扩散法：使细菌在27℃下的营养液体培养基测试管中生长24小时。通过高压灭菌器将纸片灭菌，为纸片扩散方法作准备。将每种细菌(100μl)置于营养琼脂(NA)板上并允许干燥3-5分钟。在100％浓度的牛至香精油(20μl)中使纸片饱和，并且然后置于刚用细菌涂布的每个NA板上。使用的阳性对照是3％H₂O₂溶液且阴性对照是DI水。将板在27℃下培养48小时。通过标准尺测量抑菌圈。

结果

商业有机油对细菌的抗菌效果被归纳于表4中，与对照相比，牛至油处理的细菌显示出较大的抑菌圈。

表4：牛至油的抗菌效果

测试的细菌	抑菌圈(mm)27 -->
		大肠杆菌	15
金黄色葡萄球菌	19
		沙门氏菌	21
棒形杆菌属	24
		野油菜黄单胞菌	22
阳性对照	8
		阴性对照	0

香精油粉末(EssentialOilPowder)的制备

材料

为了制备所述油粉末，使用以下材料：

天然油：

100％牛至油(香精油)和100％芝麻油(碳-基础油)，两者均购自MakesScentsNaturalSPAline,LancasterPA,USA。

表面活性剂：

百里香酚、香芹酚、Tween80、Tween65、TweenR85和蛋黄卵磷脂，都购自Sigma-Aldrich。

Span40，购自Fluka,Israel。

ZoharLQ-215(脂肪酸钾)和ZoharPT-50(脂肪酸钾)，购自ZoharDalia。二氧化硅珠：

Tixosil(SiO₂)，购自Rhodia集团。

Aerosil200和Sipernat50S(SiO₂，20μm)，购自EvonikIndustriesAG。溶剂：

丙酮和乙腈，购自J.T.Becker,Isopropanol(IPA),Gadot。

方法

粉末制备

对于实验室规模生产，含有天然油、表面活性剂和二氧化硅珠的粉末利用包括20-50ml容量的实验室瓶、刮刀、磁搅拌器和加热板的常见的实验室玻璃器皿装置来制备。通常，对天然油称重并在向其加入了溶剂的20ml小瓶中将每种天然油分别地与所选择的表面活性剂混合。混合每种油的混合物并加热至约40℃的温度，直到获得均一的溶液。向均一的溶液中添加二氧化硅珠，直到液体被珠吸收。将瓶留在通风橱中过夜，直到所有的溶剂被蒸发。

在最终的干燥粉末中每种油的载量是30-42％。干燥粉末含有2％-7％的水。

表5A-5D中提供了用于粉末制备的成分的所有比例。

表5A：基于牛至油的粉末

表5B:基于芝麻油的粉末

表5C:利用阴离子表面活性剂自乳化的基于牛至油的粉末

表5D:利用阴离子表面活性剂自乳化的基于芝麻油的粉末

对于更大的量，采用与工业中使用的机电装置相似的实验室机电装置。这些包括：

1.装备有推进器的垂直机械搅拌器DCHsiangtai；

2.蠕动泵4.4Carter4/6盒式稳压器和管道系统；

3.装备有带式搅拌叶片的DynamicExim5L粉末混合器

4.天平

5.1-2L烧杯和1-3L容器

制备包括称重油与表面活性剂并在1L烧杯中将其混合，向所述烧杯中添加异丙醇，同时混合，直到获得均一的溶液。将二氧化硅珠(Sipernat50S)添加到2L烧杯中，向所述烧杯中缓慢地添加(10ml/min的速率)均一的溶液，同时混合(30rpm)，直到所有的液体被吸收到珠内。

表6A和6B中提供了用于粉末制备的成分的所有比例。保持油的载量在约30％-42％的范围内。

表6A:基于牛至油的粉末

表6B:基于牛至油的粉末

另外，还制备了粉末(含有牛至油的粉末和含有芝麻油的粉末)的混合物。特别地，在DynamicExim5L粉末混合器中，在10rpm下，将400g制剂ORG-34(运载牛至油的珠)与100g制剂SES-35(运载芝麻油的珠)混合，产生混合物O&S-A。

在将两个群体混合在一起之前，将每种类型的基于油的粉末在真空干燥箱中在40℃下干燥24小时。

在不同的工艺中，将800g制剂ORG-38与200g制剂SES-39在DynamicExim5L粉末混合器中，在10rpm下混合，产生混合的珠制剂O&S-B。

照原样使用混合的珠粉末。

表征

确定粉末中的水含量

根据USP<921>方法，利用MettlerToledoDL-38KarlFisher滴定仪确定水含量。

确定粉末中的异丙醇含量

根据以下参数，利用Headspace分析法确定IPA含量：

利用HPLC测定干燥粉末中的牛至油

根据PharmacognMag.2010年6月-9月；6(23):154158中由H.Hajimehdipoor"AvalidatedhighperformanceliquidchromatographymethodfortheanalysisofthymolandcarvacrolinThymusvulgarisL.volatileoil"报道并被SoluBest采用的方法确定杂质特征谱。为了这个目的，使用Nucleosil100C18HD,3μ,150x3mm柱和带有光电二极管阵列(PDA)检测器和ChromeleonVersion6.80软件包的Ultimate3000Dionex(Germany)HPLC系统。流动相是乙腈：水(50:50，v/v)。香芹酚峰和百里香酚峰之间的最小分辨率是1.5。

如下一式两份制备标准溶液：

将约3mg百里香酚和20mg香芹酚称重到50mL容量瓶内，并溶于40mL稀释剂中，然后用稀释剂调整体积并混合。生成的百里香酚标准溶液的浓度是约0.06mg/mL且香芹酚标准溶液是约0.4mg/mL。

如下一式两份制备样品溶液：

将约70mg粉末状样品称重到25mL容量瓶内，然后用丙酮调整体积并混合。

利用GC测定制剂中的芝麻油

在60℃下，被吸收在二氧化硅珠上的芝麻油与甲醇HCl溶液发生反式-甲基化，过夜反应。在衍生化之前，将用作内部标准的十七烷酸添加至珠。在GC分析之前，用己烷萃取脂肪酸的甲酯并在无水硫酸钠上干燥。

从不同浓度的芝麻油和空白珠制备校准标准。衍生化的条件和内部标准的量与在样品制备中描述的相同。

利用装备有FID检测器的Agilent7890气相色谱仪对珠中的芝麻油进行定量分析。在DB-23毛细管柱上分离化合物。

结果

采用用于牛至油和芝麻油测定的常规HPLC和GC分析方法。

测试的粉末的色谱分析显示，在粉末制备和贮存期间没有引起油的降解(根据常规标志物，百里香酚和香芹酚芳香化合物)。以下表7基于百里香酚和香芹酚芳香化合物的HPLC分析，分别提供了粉末中牛至油和芝麻油的％。

表7-如通过HPLC测量的制剂中的牛至油含量

表8提供了通过GC色谱分析确定的制剂中芝麻油的％。

表8-通过GC色谱分析测量的制剂中芝麻油的含量

利用KarlFisher滴定法测量的水含量发现粉末含有5-7％的水。水的来源似乎是来自ZoharPT50表面活性剂，其含50％的水。

对于IPA含量，GCHeadspacepreciseanalysis展示了制剂中的IPA含量，其被归纳于表9中。

表9-粉末中的IPA含量

制剂编号	样品量(g)	IPA(μg/ml)	IPA(％)
				34	19.6	1,265	12.9
35	200	1,139	11.4
				38	20.3	1,117	11.0
39	19.8	492	5.0

如可从表9中看到的，IPA的量从5％到13％变化。但是，在实际应用中，制剂被稀释至少30倍，并且这样一来，IPA的含量减少到0.17-0.43％，这是可以忽略不计且非常安全的量。

所制备的不同类型的干燥粉末在长期(超过一年)贮存之后显示是稳定的。此外，要注意粉末具有特征性的气味。基于牛至油的制剂具有米白色，而基于芝麻油的粉末是白色的。

在与水接触后，所测试的制剂(ORG-28和SES-29)立即形成乳剂，其持续24h是稳定的。乳剂由3-10微米的液滴组成。乳剂的喷洒能力是良好的，不堵塞过滤器。

实际应用中的安全性研究显示，所测试的基于油的粉末是安全的。这通过常规植物毒性参数确定的植物上的烧伤的存在(或不存在)确定。

另外，确定了粉末的长期(8周)稳定性。特别地，分别将基于牛至和芝麻的粉末密封在铝箔袋中，并放置在加速的储存条件(acceleratingstoringconditions)下(40℃持续8周)。在稳定性研究开始时(起始点)，牛至油的测定通过两个主要成分-香芹酚和百里酚测量，并在8周之后利用HPLC-UV技术测量。将获得的值标准化成标志物在纯净的牛至油中的量。

在稳定性研究开始时(起始点)，芝麻油的测定通过两种主要成分-C16:0和C18:0测量，并在8周之后利用甲基化的脂肪酸的GC-FID分析测量。反式甲基化反应经酸性催化(用MeOH/HCl)进行，利用C17:0作为内部标准。将获得的值标准化成标志物在纯净的芝麻油中的量。

在两种制剂中均未观察到显著的改变：在稳定性研究之前和之后，牛至油和芝麻油的量是相似的。

利用KarlFisher方法测试水含量。在两种制剂中，于加速条件贮存8周之后，水的量减少42％。

利用GC方法测试异丙醇含量。在牛至制剂中，于加速条件贮存8周之后，IPA的量减少36％，但是在芝麻制剂中IPA的量被保持。

不被理论束缚地，容器似乎是漏的并且为了减少水或IPA损失，容器可被更加密闭地密封。

40℃下贮存8周的粉末显示出与初始粉末形成稳定乳剂的能力相似的良好的形成稳定乳剂的能力。下表10中归纳了稳定性测量。

表10：稳定性测定

不同的表面活性剂的增溶作用和抗细菌活性

为了形成稳定的水包油乳剂，需要具有8-20的HLB的表面活性剂(乳化剂)。因此，在下文中，测试了两种表面活性剂，Tween80具有15的HLB值，而从棕榈、椰子、橄榄、蓖麻和棉籽植株提取的脂肪酸的钾盐(油酸钾盐)具有20的HLB值。

已发现，对于脂肪酸的钾盐，获得牛至油的稳定乳剂所需要的油/表面活性剂的比是1:0.4，而对于Tween80，所需要的油/表面活性剂比是1:1。

在当前的牛至油实例中发现了HLB值和每种表面活性剂的增溶能力之间的关联性，即，脂肪酸的钾盐具有更好的增溶作用。异丙醇被用作工艺辅助化合物，其也为生产乳剂提供了额外的稳定性。

对于抗菌效果，用水中的牛至油和芝麻油测试了几种乳化剂。

测试的乳化剂包括：Tween20；Tween80；TritonX100；卵磷脂；SDS；硬脂酸钠和脂肪酸钾盐。针对含有25％牛至油与5％芝麻油的水的混合物，以以下浓度(百分比)1、5、10、15、20测试每种乳化剂。

确定每种乳剂的在第一个24小时(即，无相分离)期间的稳定性和抗菌活性。通过测量20μl乳剂对以下植物病原菌的抑菌圈：棒形杆菌、黄杆胞菌和Streptomycesspp.，以及通过将乳剂喷洒到作为测试植物的胡椒上以观察植物毒性症状来确定抗细菌活性。

结果显示，10％浓度的脂肪酸钾盐是在形成稳定的乳剂方面最稳定的材料；脂肪酸的钾盐的抑菌圈比其他测试乳剂大，并且对胡椒植株无植物毒性。所获得的数据(未显示)清楚地证明当乳化剂是Tween20、Tween80、TritonX100或SDS时对胡椒植株的植物毒性，因为用其形成的乳剂喷洒的植株死亡，而用硬脂酸钠脂肪酸钾喷洒时是非常有活力的。

在一组不同的实验中，牛至油和表面活性剂被吸收在二氧化硅珠上(伴随异丙醇辅助，如上述描述的)。当0.5％基于牛至的粉末散布在水中时，获得良好的抗细菌结果。这种粉末含有约25％的牛至油和10％的脂肪酸钾乳化剂，即，乳剂中0.125％牛至油的浓度足够有活性且只需要0.05％的表面活性剂从粉末形式溶解。

出人意料地，甚至更低的粉末浓度足够在温室研究中产生良好的作物保护。仅0.2％的粉末和因此0.05％的牛至油足够在水中分散(以便形成乳剂)且显示出出色的且可重复的抗细菌效果，与被感染但未处理的对照相比，用其处理的植株完全地保持活力。

生物防治混合物的制备

如下制备三种生物防治混合物：

含有以上表1中列出的细菌的混合物的拮抗凝胶各自使用10⁷-10⁸CPU/ml的量的每种拮抗物。

然后以两种浓度使用拮抗凝胶中的每一种，第一种，如所获得的，即，无需稀释(以每种拮抗物10⁷-10⁸CPU/ml的量)，与运载0.03％天然油的珠混合(等价于1升水中1g珠)，简写为NB，以及第二种制剂，用水稀释x2倍，以形成制剂NBx2，其中油的浓度是0.06％。

生物防治实验

在生物防治测定中，采用以下油粉末组成：

材料和成分

油：芝麻油100％(SPAlineLotsicPlAll/01)；牛至油100％(SPAline批0015181)

表面活性剂：ZoharPT-50(ZoharDalia，批次05511PM1142)；

SiO₂颗粒：Sipernet50S(20μm，EvonikIndustries，批次1462)

醇：异丙醇(IPA,Gadot)。

制剂

粉末的制备

首先，将牛至油和芝麻油混合，向其添加IPA，直到获得均一的溶液。通过混合向溶液中添加表面活性剂，直到获得非粘性的均一溶液。将溶液喷洒到SiO₂粉末上并利用低剪切力装置进行混合，直到所有的液体被吸收并继续持续另外的15-30min的时间段。然后，研磨粉末以破碎聚集物并通过1000μm网眼筛滤。对于贮存，密闭地密封含有粉末的袋并贮存。在15-30℃下，贮存至少2年。

生物防治实施例1-生物防治混合物对多种病原体的体外效应

测试的病原体：测试以下四种拮抗细菌(通过保藏登录号标识)：CBS133252、CBS133254、CBS134567和CBS133259。

从发明人的个人收藏获得棒形杆菌、野油菜黄单胞菌、疮痂病菌和酵母菌。

方法：

病原体制备-分别将测试的病原体的每一种平板接种到酵母提取物葡萄糖琼脂(YDC)上并使其在25±1℃下生长48h，之后，用无菌蒸馏水洗涤每个平板的表面。然后，将病原体收集到含有无菌蒸馏水的管中。组合两种测试的病原体并平板接种到皮氏培养皿上，用于测试。

拮抗物制备-通过将以上列出的测试拮抗物之一的样品(100μl)喷洒到含有YDC培养基的皮氏培养皿的表面上，并使拮抗物在25±1℃下在拮抗培养基上(本文公开的基于琼脂的凝胶)生长48h来制备拮抗物。然后，用软木塞刀具将包含拮抗物混合物的培养基块去除并置于运载用于组合孵育的两种病原体的平板的表面上。

在病原体连同每种拮抗物一起在25±1℃下孵育24h之后，拮抗物块周围的抑菌圈形成。抑菌圈通过克隆周围的晕圈呈现。图5A显示了未用拮抗物处理的病原体细菌的生长，图5B显示了CBS133252的效果，图5C显示了CBS133254的效果，图5D显示了CBS133567的效果且图5E显示了CBS133259的效果。

生物防治实施例2-生物防治混合物对番茄枯萎病的影响

在三个净温室中进行体内评价，以评价三种生物防治混合物对番茄Daniella植株的抗细菌活性。用棚架使番茄生长。

作为阳性对照，使用0.3％浓度的氢氧化铜(Kocide,MilchanBros)(铜对照)。

将未处理的植株用作阴性对照。

在种植之后，用50ml生物防治混合物、铜对照或无(阴性对照)对所有的植株连续浇水三日，之后每7天喷洒植株。对于喷洒，将香精油粉末(以各自的量)和拮抗凝胶混合在背负式机动喷雾器的容器中并喷洒整个植株，包括叶片和茎。

在2周之后，用CBM接种物感染温室中每个生长行中的第二株植株，其中CBM接种物包括从以色列的比瑟河区域生长的被感染的植株分离的两种CBM菌株。接种物包括2种CBM菌株，32号菌株(菌株名称189/1-1)和42号菌株(菌株名称189/6-1)[FridaKleitman等人，CharacterizationofClavibacterMichiganensisSubsp.MichiganensispopulationinIsraelEur.J.PlantPathol(2008)121:463-475]。

通过在植株的叶片中靠近茎处形成切口，并将叶片浸入CBM接种物来进行接种。

在生长期间，监视植株并观察被感染的植株。

统计学测试

利用学生T检验分析结果。

结果

将以上田间试验重复六次，并且六次重复的结果被归纳于表11A中，提供了番茄植株的死亡率，并且表11B提供了被CBM感染的水平，如利用针对CBM的Agria试剂盒(CmmImmunoStrip测试目录号STX44001AgdiaIncorporated30380CountyRoad6Eelkhart,Indiana46514USA)测试的。

表11A:番茄植株的存活率

处理	死亡率
		阴性对照	18％
铜对照	8％
		NB	2％
NBx2	1％

表11B:番茄植株中CBM感染的百分比

处理	CBM感染
		阴性对照	83.5±11
铜对照	58.8±15
		NB	50.5±14
NBx2	25.8±12

表12提供了表11A的结果之间的统计比较。

表12：处理组之间死亡率的统计比较

比较的组	P<0.05
		未处理与NBx2	是
未处理与NB	是
		未处理与铜制剂	否
铜制剂与NB	是
		NB与NBx2	是

在该表中，“是”指示有统计显著差异；而“否”指示无统计显著差异。表9显示了当将NB与任何其他处理组比较时，正面效应是统计上显著的。当将铜对照与阴性对照比较时，氢氧化铜处理的正面效应是不显著的。加倍剂量(NB与NBx2的浓度)也显示出统计学上显著的增加的效应。

另外，表13和图6显示了处理对植株死亡的影响。

表13：死亡率

处理	％死亡率
		阴性对照	18％
铜对照	8％
		NB	2％
NBx2	1％

具体地，表13显示出与处理组NB和NBx2相比，未处理、阴性对照组(对照)和铜组(Cu)具有较高的死亡百分比。在每个组中，边行比中间行更敏感(未示出)。边行和中间行之间的差异可归因于边行在温室中的位置，受到了外部参数的影响。

结果还显示出协同作用。表14显示在广泛的温度范围下，天然油(芝麻油珠和牛至油珠)与拮抗物的组合使植株的存活增加到比每种单独的成分的效果大得多的程度[(A+B)/C>1]。

具体地，结果显示仅(A)的拮抗物和仅(B)的油的组合效果除以对照(C)大于1，即协同作用。

表14-协同作用

生物防治实施例2-生物防治混合物对胡椒的影响

对于胡椒被辣椒疮痂病菌(XV)感染的预防，使用与在实施例1中使用的相同的生物防治混合物，用相同的处理方法。病原体为由发明人最初从患病的胡椒植株和胡椒种苗分离的。辣椒疮痂病菌(XV)的分离物由G.Kritzman收藏。

生物防治实施例3-生物防治混合物对土豆的影响

对于马铃薯被Streptomycesspp.，致病剂疮痂链霉菌感染的预防，使用包含按照以上提供的步骤获得的三种拮抗物分离物和前面列表的一些物质的生物防治混合物。下表15中提供了这三种拮抗物。

表15：用于马铃薯处理的贮存的拮抗物

拮抗物	登录号	名称
			地中海假单胞菌AN1	CBS134566	BN13-01
绿针假单胞菌AN10	CBS134567	BN13-02
			假单胞菌属的种AN21	CBS134568	BN13-03

以三种浓度，1％(未稀释)、0.5％(1:1稀释)和0.025％(1:4稀释)的活性组分(油制剂)与恒定浓度的细菌拮抗物按以上描述的制备生物防治混合物，细菌拮抗物在罐混合物中的最终浓度为10³CFU/ml。

在使用之前，在混合罐内将拮抗物与包含特别是组分牛至油干燥粉末和芝麻油干燥粉末的干燥制剂之一混合(按以上描述的80:20的比率)。通过在输送机上滚转，使马铃薯块茎进入喷洒单元。在该单元中，块茎穿过大量液滴(每个直径约80u)。在每个块茎围绕它的轴被滚转约8次之后，将处理的块茎作为干燥的处理的块茎收集在容器中。现在用一薄层完全制剂包被经处理的块茎，便于在不早于处理72h之后种植。

在马铃薯疮痂病的情况下，并非通过人工接种块茎而是通过选择每个种块上天然地高度布满很多典型症状的马铃薯种块批次来测试处理的效率。其可以是一般的疮痂病类型或深坑疮痂病症状。在两个程序中检查种块：

a)将60个块茎样品重复带入实验室。在实验室中，通过商业马铃薯削皮器对所有块茎削皮，在削皮程序期间，操作所述削皮器而不对块茎浇水。收集马铃薯皮的大样本。将十克放入到含有补充了0.05％(w/v)抗坏血酸的90ml0.1％(w/v)水琼脂的均质袋中。在旋转摇床上使该悬浮液混合2h，然后在均质器中混合1min。在这种均化作用之后，完成十倍稀释并将100μl的等份接种到含有用于分离链霉菌属的半选择培养基的皮氏培养皿的表面上。在28℃下孵育5天之后，对经处理的马铃薯种块计算CFU/g皮并与未处理的对照比较。

b)将处理的和未处理的马铃薯种块各自以至少4个重复种植在试验田中。在该实验中，评价收获时的生长和产量参数以及对子代块茎的疮痂病的防治。

计算每克果皮的链霉菌群并且结果在表16中：

表16：马铃薯疮痂病的治疗

另外的生物防治实验

为了测试其他病原体感染的治疗或预防，可以使用以下方案。

I.用于体外拮抗活性的方案

利用细菌转移环将每种拮抗细菌转移到单独的皮氏培养皿中(9cm)，以沿着培养皿的直径形成一条拮抗物线，并在28℃下对培养皿孵育48h。

沿垂直于拮抗物线的线转移测试的病原体，而不接触培养皿的壁。

在25℃和28℃之间的温度下，对培养皿孵育另外的5天的时间。

测量拮抗物抑制病原体的生长的区域(“抑菌圈”)。抑菌圈的大小指示细菌的拮抗活性的水平。

II.不含拮抗物的油制剂的影响

通过将油粉末以1％w/v的油的最终浓度溶于适于培养测试的病原体细菌的培养基(包含在37℃下是液体的琼脂的培养基)，形成油制剂的贮存溶液(如上所述，不含拮抗细菌)。用培养基由贮存溶液形成油制剂的一系列加倍稀释的浓度(1:1、1:2、1:4、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、和1:512稀释)。倒入皮氏培养皿中并允许含有培养基的油变硬。

在培养48h之后，通过用盐水稀释制备病原体悬浮液并校准悬浮液中的病原体浓度，以达到在480nm下0.6AU的吸光度。

将病原体细菌稀释直至10^-8/ml的浓度并在含有培养基的硬化油上平板接种100μl。

在25℃-28℃下对不同油浓度的每个平板孵育5天之后，确定克隆的数目。

III.杀菌或抑菌活性

用不同量的按以上所述得稀释的油制备拮抗物制剂，尽管含有无菌水和每种稀释的油制剂，拮抗物处于每ml10³拮抗物的恒定浓度。

在具有1ml等份的浓度为10⁸CFU/ml的测试的病原体悬浮液的管中孵育具有不同油稀释液的9ml量的拮抗物制剂。在培养72h之后由培养物制备病原体悬浮液。

在孵育3h之后，用无菌水在0.45mm网孔膜上过滤每个管的内含物，之后使用无菌水将病原体从膜洗下并涡旋。

然后，十倍系列稀释洗下的细菌，直至10^-8CFU/ml的浓度。从每种稀释液，将100μl等份平板接种到具有合适的培养基的皮氏培养皿上并培养。克隆的形成指示制剂的抑菌活性，而不存在克隆指示杀菌活性。

IV.植物测试：

在盆栽中或在温室中进行植物测试。具有至少5片叶的植株被用于测试。

在盆栽中：

在第1天，用多种浓度的测试的油/拮抗物制剂喷洒植株并在12h之后用约10⁶CFU/ml的浓度的病原体溶液喷洒植株。

在感染之后两个小时，再次用相同的油/拮抗物制剂喷洒植株并连续地每6天喷洒一次，持续6周的时期。在6周之后，评价并记录发病率。

在开放的试验田或温室中：

在温室田中，利用植物的常规种植和培养方法使该植物生长。

在种植之后，用约100ml油/拮抗物制剂/植物的量灌溉植株，然后用相同的制剂喷洒每株植株，连续地每5-6天喷洒一次。

评价并记录发病率。

毒理学测试

如下利用包含所有保藏的拮抗物(表1)的混合物的制剂执行多种毒理学测试，所述所有保藏的拮抗物各自浓度为10⁹：

(i)大鼠中的急性口服毒性：

方案：

将雌性Sprague-Dawley^TM(SD^TM)大鼠分成两组(n＝3)，以两组之间24小时的施用间隔，使每组接收2000mg/kg的测试制剂的单个剂(1.97ml/kg的剂量体积，口腔灌胃法(PO)施用)。

结果：

-贯穿14天观察周期，在任何测试的大鼠中无死亡发生。

-在给药时间之后即时或贯穿整个14天观察期间，在任何动物中，没有注意到对给药反应的明显临床迹象。

-发现在所有动物的14天研究时期结束时的体重增加在正常预期值的范围内。

-在预定的尸体解剖中，任何动物没有明显的肉眼病理所见(grosspathologicalfindings)。

-基于在以2000mg/kg的限制测试剂量水平对大鼠单次口服施用之后无不良反应，所测试的制剂可以被认为通过该施用途径不表现急性毒性风险，且急性口服半数致死剂量(LD50)大于2000mg/kg。

(ii)急性皮肤毒性

方案：

将2000mg/kg的测试制剂的单一剂量水平局部地应用到5个雌性和5个雄性Sprague-Dawley(SD^TM)大鼠，持续24h的暴露时间段。持续总共14天观察大鼠。

结果：

-贯穿整个14天研究时期，在任一大鼠中无死亡发生。

-在贯穿整个14天观察时期，在任一大鼠中没有注意到对给药反应的明显临床迹象。

-发现在14天研究时期结束时的体重增加在正常预期值的范围内。

-在大鼠的预定的尸体解剖中，在任一大鼠中没有明显的肉眼病理所见。

-基于在对大鼠单次皮肤应用后无不良反应，所测试的制剂被认为通过该施用途径不表现急性毒性风险，并且所评估的急性皮肤半数致死剂量(LD50)被确定为大于2000mg/kg。

在兔子中的急性皮肤刺激性/腐蚀性

方案：

根据被2002年4月24日正式通过的OECDGuidelinefortheTestingofChemicals,第4部分,第404号,"AcuteDermalIrritation/Corrosion"推荐的测试程序，在对3个雄性NZW兔子组单次皮肤应用之后，评价测试制剂的潜在皮肤刺激作用。

特别地，对兔子局部施用经测量2x3cm的各自被0.5ml测试制剂弄湿的脱脂纱布的单个样品，持续4小时的暴露时间段。用无刺激性胶带和合适的半封闭绷带(TUBIGRIP弹性织物)使每个纱布块与皮肤保持接触，以使纱布块和测试制剂贯穿暴露时期被保持。

在移除纱布块之后1、24、48和72小时的标准时间点时，对皮肤反应打分并记录。

结果：

-贯穿72小时研究时期，在任一兔子中未观察到红斑或水肿。

-贯穿研究时期，在任一兔子中未观察到其他皮肤反应。

-贯穿整个研究时期，在任一兔子中没有注意到的对处理反应的明显临床迹象。

-贯穿整个研究时期，在任一兔子中未观察到体重的异常变化。

-考虑所计算的初级刺激指数(PII)是0，形成结论：刺激响应被归类为可忽略的。

(iii)皮肤致敏(局部淋巴结测定)

方案：

根据被2010年7月22日正式通过的OECDGuidelinefortheTestingofChemicals,第4部分,第429号“SkinSensitization:LocalLymphNodeAssay”推荐的测试程序评价测试制剂引起皮肤致敏的可能性。

特别地，在生理盐水中制备测试制剂的三种稀释液。在应用之前，将L92(1％v/v)添加到每种给药溶液中。

为了确保测试程序的再现性和灵敏性，将熟知的弱至中等的接触性变应原，25％HCA纳入此研究，用所使用的阴性对照稀释。

使三组BALB/c雌性小鼠(n＝5)经受测试制剂(每组一种稀释液)的一天一次持续三个连续日的应用，以25μl的剂量体积应用于每个外耳的背部。在相同的条件下，使另外两个同等大小的组经受阴性对照(生理盐水)或阳性对照(25％HCA)的应用。

在第一次局部应用之后五天，通过静脉(IV)注射，对所有小鼠注射3H-甲基胸腺嘧啶。大约5小时之后，使所有的小鼠安乐死并切除耳淋巴结。制备来自个体动物的左淋巴结和右淋巴结两者的单一细胞悬浮液。

通过P-计数器测量3H-甲基胸腺嘧啶的掺入并表示成每分钟衰变(DPM)/动物。

对于用测试制剂稀释液和阳性对照处理的组计算刺激指数(SI)。对于所有的稀释液SI值小于3，且对于阳性对照SI值高于3。

结果：

-贯穿5天研究时期，在所有组的任一小鼠中无死亡发生。

-贯穿5天研究时期，在测试制剂或阴性对照处理的任一小鼠个中未观察到对处理反应的明显临床迹象。所有的阳性对照处理的小鼠在耳朵上显示红色。

-在5天研究时期结束时，所有的小鼠显示出体重增加。

-在该研究的条件下并且根据所计算的刺激指数值，得出结论：所测试的制剂不引起与皮肤致敏有关的反应。

(iv)兔子中的急性眼部刺激/腐蚀

方案：

根据由2012年10月02日正式通过的OECDGuidelinefortheTestingofChemicals,第4部分，第405,号"AcuteEyeIrritation/Corrosion"推荐的测试程序，在对3只雄性NZW兔子组单次眼睛滴注之后，评价测试制剂的可能的眼睛刺激/腐蚀作用。

首先，将0.1ml测试制剂的单个剂量应用于一只兔子的右眼(初步测试)并且随后应用于两只另外的兔子(证实性测试)。每只兔子的左眼未经处理并充当对照。

在应用之后的1、24、48和72小时的标准时间点时对眼睛反应打分并记录。

结果：

-贯穿72小时研究时期，在任一兔子中未观察到眼睛反应。

-贯穿整个研究时期，在任一兔子中未注意到对处理反应的明显临床迹象。

-在该研究的条件下，得出结论：所测试的制剂不引起与眼睛刺激/腐蚀相关的反应。

Claims

1.一种包装，其包括：

i)至少一个第一组分，所述至少一个第一组分包含颗粒物质，所述颗粒物质包含至少一种天然油；

ii)至少一个第二组分，所述至少一个第二组分包含微生物病原体的拮抗物

其中所述至少一个第一组分和所述至少一个第二组分被容纳在所述包装的分开的隔室内。

2.根据权利要求1所述的包装，其中所述第一组分包含基本上干燥的形式的颗粒物质。

3.根据权利要求1所述的包装，其中所述颗粒物质包含二氧化硅(SiO₂)。

4.根据权利要求3所述的包装，其中所述颗粒物质包含经沉淀的合成的无定形二氧化硅珠。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的包装，其中所述颗粒物质具有在10-25μm的范围内的尺寸分布。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的包装，其中所述颗粒物质表现出在400-500m²N₂/g的范围内的表面积和在300-350DBP/100克颗粒的范围内的油容量中的至少一个。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的包装，其中所述天然油是植物油。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的包装，其中所述天然油包括至少一种香精油。

9.根据权利要求8所述的包装，其中所述香精油是牛至油。

10.根据权利要求7所述的包装，其中所述植物油是富含碳的营养油。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的包装，所述包装包含颗粒物质的两个或更多个群体，颗粒物质的每个群体运载不同类型的天然油。

12.根据权利要求11所述的包装，所述包装包含运载香精油的颗粒物质的至少一个群体，和运载富含碳的营养油的颗粒物质的至少一个群体。

13.根据权利要求12所述的包装，其中所述香精油至少包括牛至油。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的包装，其中所述颗粒物质包含占所述颗粒物质的总重量的20％至50％w/w之间的天然油。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的包装，其中所述天然油被吸收在所述颗粒物质中。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的包装，其中所述颗粒物质包含至少一种表面活性剂。

17.根据权利要求16所述的包装，其中所述表面活性剂包括脂肪酸的钾盐。

18.根据权利要求16或17所述的包装，其中所述颗粒物质包含在5％至10％w/w之间的所述表面活性剂。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的包装，其中所述第一组分包含不超过10％(w/w)的水含量。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的包装，其中所述第一组分不含有机溶剂或包含不超过5％的有机溶剂。

21.根据权利要求20所述的包装，其中所述有机溶剂是极性溶剂。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的包装，其中所述第二组分为凝胶的形式。

23.根据权利要求22所述的包装，其中所述凝胶是基于多糖的凝胶。

24.根据权利要求23所述的包装，其中所述基于多糖的凝胶是琼脂凝胶。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的包装，其中所述微生物病原体的至少拮抗物是土传细菌或是从植物的部分分离的细菌。

26.根据权利要求25所述的包装，其中所述拮抗物分离自植物的土壤或对所述病原体表现出耐受性或抗性的植物。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的包装，其中所述至少一个第二组分包含在500CFU/ml至5000CFU/ml之间的浓度的拮抗物。

28.根据权利要求1至26中任一项所述的包装，其中所述至少一个第二组分包含约1000CFU/ml的浓度的所述拮抗物。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的包装，所述包装包括两个或更多个第二组分，每个所述第二组分运载不同类型的拮抗物或拮抗物的混合物。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的包装，其中所述至少一种拮抗物是选自由以下组成的组的细菌：假单胞菌属(Pseudomonas)的种(登录号CBS133252)、嗜碱性假单胞菌(Pseudomonasalcaliphila)(登录号CBS133254)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)(登录号CBS133255)、Pseudomonascedrina(登录号CBS133256)、假单胞菌属的种(登录号CBS133257)、假单胞菌属的种(登录号CBS133258)、假单胞菌属的种(登录号CBS134568)、Pseudomonasspanius(登录号CBS133259)、地中海假单胞菌(Pseudomonasmediterranea)(登录号CBS134566)、绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororahis)(登录号CBS134567)和假单胞菌属的种(登录号CBS134568)。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的包装，所述包装包括使用所述第一组分和所述至少一个第二组分形成乳剂的说明。

32.根据权利要求31所述的包装，其中所述说明包括将所述第一组分与所述第二组分混合。

33.根据权利要求1至32中任一项所述的包装，用于抑制植物中的病原体感染或消除植物中的病原体感染。

34.根据权利要求1至33中任一项所述的包装，其中所述感染是由选自以下的病原体引起的感染：密执安棒杆菌亚种(Clavibactermichiganensissubsp.Michiganensis)(CBM)、辣椒疮痂病菌(xanthomonasvesicatoria)(XV)、疮痂链霉菌(S.Scabies)。

35.根据权利要求34所述的包装，其中所述植物是来自茄科的植物。

36.一种包装，所述包装包括：

一个或更多个第一孔，所述一个或更多个第一孔容纳包含颗粒物质的第一组分，所述颗粒物质包含至少一种天然油；

一个或更多个第二孔，所述一个或更多个第二孔容纳第二组分，所述第二组分包含微生物病原体的至少一种拮抗物；

所述一个或更多个第一孔和所述一个或更多个第二孔各自具有顶部开口和从所述顶部开口向下延伸的凹槽，所述孔在基本上平面的矩阵中被保持在一起；和

第一薄膜和第二薄膜，所述第一薄膜密封所述一个或更多个第一孔的开口且所述第二薄膜密封所述一个或更多个第二孔的开口。

37.根据权利要求36所述的包装，其中所述一个或更多个第一孔的至少一个和一个或更多个第二孔整体地形成为所述平面矩阵。

38.根据权利要求36所述的包装，其中所述一个或更多个第一孔的至少一个和一个或更多个第二孔被可逆地安装在所述平面矩阵内的开口或凹槽中。

39.根据权利要求36至38中任一项所述的包装，其中所述一个或更多个第一孔的每个是油相容性聚合物孔。

40.根据权利要求36至39中任一项所述的包装，所述包装包括单个第一孔。

41.根据权利要求36至40中任一项所述的包装，其中所述第一薄膜是油相容性热塑性聚合物薄膜。

42.根据权利要求36至41中任一项所述的包装，其中所述第一薄膜是流体不可渗透的热塑性聚合物薄膜。

43.根据权利要求36至42中任一项所述的包装，所述包装包括多个第二孔，每个第二孔包含相同或不同的拮抗物或拮抗物的混合物。

44.根据权利要求36至43中任一项所述的包装，所述包装包括密封所述多个第二孔的单个第二薄膜。

45.根据权利要求36至44中任一项所述的包装，其中所述第二薄膜对于包含氧的气体是可渗透的。

46.根据权利要求36至45中任一项所述的包装，其中所述第二薄膜被叠加在所述第一薄膜上。

47.根据权利要求46所述的包装，其中所述第二薄膜被固定地附接至所述第一薄膜。

48.根据权利要求36至47中任一项所述的包装，所述包装包括手柄。

49.根据权利要求36至48中任一项所述的包装，其中所述第一组分和所述第二组分是权利要求1至35中任一项所定义的。

50.一种用于提供抗细菌剂的方法，所述方法包括将包含运载至少一种天然油的颗粒物质的第一组分和包含微生物病原体的至少一种拮抗物的至少一个第二组分混合，以及允许所述混合物形成具有抗细菌活性的乳剂。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述第一组分和所述至少一个第二组分是权利要求1至35中任一项所定义的。

52.根据权利要求50或51所述的方法，其中所述第一组分和所述至少一个第二组分的所述混合提供具有3μm至10μm范围内的液滴尺寸的乳剂。

53.一种治疗或预防植物中的病原体感染的方法，所述方法包括向所述植物应用一定量的乳剂，所述乳剂包含颗粒物质、至少一种天然油和引起所述病原体感染的微生物病原体的至少一种拮抗物。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述乳剂通过将包含颗粒物质的第一组分和包含微生物病原体的所述至少一种拮抗物的至少一个第二组分混合获得，所述颗粒物质包含至少一种天然油。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述第一组分和所述第二组分是权利要求1至35中任一项所定义。

56.根据权利要求53至55中任一项所述的方法，其中所述乳剂通过喷洒植物、灌溉或喷洒所述植物的块茎而被应用到所述植物上。

57.根据权利要求53至56中任一项所述的方法，所述方法包括以在数小时至数日之间的应用之间的时间间隔将所述乳剂以两个或更多个剂量应用至所述植物上。

58.根据权利要求53至57中任一项所述的方法，所述方法包括向所述植物应用所述乳剂至少5次。

59.根据权利要求53至58中任一项所述的方法，所述方法包括从种植日或从疑似感染的第一日向所述植物应用所述乳剂。

60.根据权利要求53至59中任一项所述的方法，所述方法用于治疗或预防由病原体引起的马铃薯植物感染，所述病原体选自密执安棒杆菌亚种(CBM)、辣椒疮痂病菌(XV)、疮痂链霉菌。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述第二组分包含CBM的拮抗物的混合物，所述CBM选自由以下组成的组：假单胞菌属的种(登录号CBS133252)、嗜碱性假单胞菌(登录号CBS133254)、枯草杆菌(登录号CBS133255)、Pseudomonascedrina(登录号CBS133256)、假单胞菌属的种(登录号CBS133257)、假单胞菌属的种(登录号CBS133258)、假单胞菌属的种(登录号CBS134568)、Pseudomonasspanius(登录号CBS133259)、地中海假单胞菌(登录号CBS134566)、绿针假单胞菌(登录号CBS134567)和假单胞菌属的种(登录号CBS134568)。

62.一种分离的拮抗细菌，所述分离的拮抗细菌选自由以下组成的组：假单胞菌属的种(登录号CBS133252)、嗜碱性假单胞菌(登录号CBS133254)、枯草杆菌(登录号CBS133255)、Pseudomonascedrina(登录号CBS133256)、假单胞菌属的种(登录号CBS133257)、假单胞菌属的种(登录号CBS133258)、假单胞菌属的种(登录号CBS134568)、Pseudomonasspanius(登录号CBS133259)、地中海假单胞菌(登录号CBS134566)、绿针假单胞菌(登录号CBS134567)和假单胞菌属的种(登录号CBS134568)，所述分离的拮抗细菌任选地在运载体内。

63.根据权利要求62所述的分离的拮抗细菌，用于在治疗或保护植物免于病原体诱导的病害中使用。