肺鳞癌转移诊治标志物
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及miR-3923在诊治肺鳞癌转移中的用途。
背景技术
肺癌是严重威胁人类生命和健康的重大疾病。2011年世界卫生组织(WHO)国际癌症研究机构IARC公布的2008全球统计资料结果显示:肺癌是发病率和死亡率都高居榜首的恶性肿瘤。每年全球新发病例数160.8万,死亡病例数137.7万,占全部恶性肿瘤的12.7%和18.2%。美国癌症协会公布的统计结果显示:预计在2012年,美国新发肺癌病例数将达到22.6万,因肺癌死亡病例数将达到16万。在我国,由卫生部主持的全国第三次死因回顾抽样调查结果显示:肺癌为样本地区恶性肿瘤死亡原因之首,粗死亡率为30.83/10万,其中男性41.34/10万,女性19.84/10万;在男性、女性中均为首位癌症死亡原因。随着全球老龄化的加速和环境污染加剧等因素,肺癌发病必将继续呈上升趋势,因此,对肺癌的诊断治疗研究的进展需求,必定越来越强烈。
人微小核糖核酸,英文名为microRNA,是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子。它们在进化上高度保守,并与动物的许多正常生理活动,如生物个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等密切相关,同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。最近的研究发现慢性淋巴细胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中的几种微小核糖核酸的表达水平均有不同程度的下调(LawrieCH,GalS,DunlopHMetal.Detectionofelevatedlevelsoftumor-associatedmicroRNAsinserumofpatientswithdiffuselargeB-celllymphoma.BrJHaematol2008;141:672-675);分析比较人肺癌、乳腺癌组织中的微小核糖核酸表达时,发现有若干组织特异性微小核糖核酸的表达水平相对于正常组织发生了变化(GarofaloM,QuintavalleC,DiLevaGetal.MicroRNAsignaturesofTRAILresistanceinhumannon-smallcelllungcancer.Oncogene2008)。也有研究证明微小核糖核酸影响了心肌肥厚、心衰、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生和发展,并且与II型糖尿病等代谢性疾病有密切关联(TryndyakVP,RossSA,BelandFA,PogribnyIP.Down-regulationofthemicroRNAsmiR-34a,miR-127,andmiR-200binratliverduringhepatocarcinogenesisinducedbyamethyl-deficientdiet.MolCarcinog.2008Oct21)。这些实验结果提示微小核糖核酸表达及特异性变化与疾病发生和发展之间存在着必然联系。
由于微小核糖核酸在基因转录后的表达调控中起着超乎想象的重要作用,因此它与疾病存在以下的关联性:首先,微小核糖核酸的变化可能是病因,这是因为疾病的抑制因子以及促进因子都可能是微小核糖核酸的靶位点,当微小核糖核酸本身先发生了紊乱表达,比如本来抑制疾病促进因子的微小核糖核酸表达量降低了,或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表达量升高了,其最终结果都会导致下游一系列基因表达的变化以及某些通路的整体紊乱,进而诱发疾病发生;其次,微小核糖核酸的变化也可能是疾病的结果,这是因为当疾病发生时,会导致染色体片段的丢失、基因的突变或者染色体片段的剧烈扩增,若微小核糖核酸正好位于这一变化区段内,那么其表达量将发生极其显著的变化。
因此,理论上微小核糖核酸分子完全可以作为一类新的疾病标记物,它的特异性变化必然与疾病产生发展相关联。同时微小核糖核酸还可以作为潜在的药物作用靶点,通过抑制疾病过程中上调的微小核糖核酸或过表达下调的微小核糖核酸,将有可能极大地缓解疾病的发生和发展。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种可用于早期诊断肺鳞癌转移的微小RNA标记物。
本发明的目的之二在于提供上述微小RNA的用途。
为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:
本发明提供了一种微小RNA在制备肺鳞癌转移诊断工具中的应用,所述微小RNA选自以下组:初始miRNA、前体miRNA、成熟miRNA;初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA;前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA;所述微小RNA是miR-3923。
应当知道,本发明的微小RNA包括组成型核酸分子的功能等同物,即变体,其显示完整微小RNA核酸分子相同的功能,尽管它们通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。
本领域人员应该了解,为了保证微小RNA的稳定性,可以在微小RNA的一端或者两端增加保护性碱基,如TT,也可对微小RNA碱基进行修饰,但是上述修饰不影响微小RNA的功能。因此,本领域技术人员熟知,在不影响miR-3923功能的条件下,对miR-3923进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
在本发明的一些具体的实施方式中,所述miR-3923是成熟miR-3923。
虽然在某些具体实施方式中所使用的是成熟miRNA,但是本领域技术人员可以预期,初始miRNA、前体miRNA将可以获得与成熟miRNA同样的技术效果,因为细胞有能力进一步将初始miRNA、前体miRNA加工为成熟miRNA。
本发明的微小RNA核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟miRNA主要呈单链形式,而前体miRNA是部分自互补的,以形成双链结构。本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
进一步,上述诊断工具包括但不限于,芯片、试剂盒、试纸、高通量测序平台。所述诊断工具包括用于检测miR-3923的表达水平的试剂。
进一步,所述试剂盒包括针对miR-3923的引物和/或探针;所述芯片包括固相载体;以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miR-3923的部分或全部序列;所述试纸包括针对miR-3923的引物和/或探针;所述高通量测序平台包括针对miR-3923的引物和/或探针。
本发明提供了一种肺鳞癌转移的诊断工具,所述诊断工具包括检测miR-3923表达水平的试剂。
进一步,所述诊断工具包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。
进一步,所述试剂盒包括针对miR-3923的引物和/或探针;所述芯片包括固相载体;以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miR-3923的部分或全部序列;所述试纸包括针对miR-3923的引物和/或探针;所述高通量测序平台包括针对miR-3923的引物和/或探针。
进一步,所述试剂盒中的针对miR-3923的引物和/或探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于检测前面所述的微小RNA表达水平的引物和/或探针。将多种微小RNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种微小RNA指标联合诊断肺鳞癌的情况也包含在本发明的保护范围之内。
进一步,所述芯片上固定的所述寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于检测miR-3923的表达水平的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断肺鳞癌也包含在本发明的保护范围之内。
进一步,所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料,例如但不限于尼龙膜,经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法,例如,如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片,探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串,可将寡核苷酸探针配制成溶液,然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上,排列成预定的序列或阵列,然后通过放置过夜来固定,就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰,则其制备方法也可参照:王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》;J.L.erisi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploringthemetabolicandgeneticcontrolofgeneexpressiononagenomicscale.Science,1997;278:680和马立人,蒋中华主编.生物芯片.北京:化学工业出版社,2000,1-130。
本发明的miR-3923可以是天然的或是人工合成的,或者使用可以表达miR-3923的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核载体。
病毒载体可以是任何适当的载体,包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。
真核表达载体可以是任何适当的表达载体,包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEFBos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体,比如pBin438、pCAMBIA1301等。
可以表达微小RNA的DNA片段可以通过如下方式获取:从miRNA数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找微小RNA在基因组上的位置及具体序列信息,根据基因组序列确定初始miRNA的位置,在初始miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物,扩增引物中间的序列即可获得表达微小RNA的DNA片段。
药物筛选:在得知了前面所述的miR-3923与肺鳞癌的密切相关性后,可以基于该特征来筛选促进miR-3923表达的物质。之后,可从所述的物质中找到对于治疗肺鳞癌转移真正有用的药物。
因此,本发明还提供了一种筛选治疗肺鳞癌转移的潜在物质的方法,所述的方法包括:用候选物质处理肺鳞癌相关细胞体系,若所述候选物质可促进前面所述的miR-3923的表达或活性,则表明该候选物质是治疗肺鳞癌转移的潜在物质。所述细胞体系可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型,优选非人哺乳动物的动物模型,如鼠、兔、羊、猴等)等。优选地,对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验,以进一步选择和确定对于治疗肺鳞癌转移真正有用的物质。
本发明还提供了miR-3923在制备治疗肺鳞癌转移的药物中的应用。
进一步,所述药物组合物包括有效剂量的促进剂。所述促进剂能够促进miR-3923的表达、或能够促进miR-3923的活性、或能够促进miR-3923的有效作用时间、或能够促进miR-3923的稳定性。所述促进剂的靶标不限于miR-3923本身,还包括miR-3923的上下游,例如:编码miR-3923的基因组序列,miR-3923的靶基因、调控miR-3923的蛋白或者基因。
进一步,miR-3923促进剂包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物、寡核苷酸表达载体。
所述用于寡核苷酸表达的载体包括病毒载体、真核载体。
病毒载体可以是任何适当的载体,包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。
真核表达载体可以是任何适当的表达载体,包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEFBos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体,比如pBin438、pCAMBIA1301等。
优选地,所述miR-3923促进剂是miR-3923本身或者miR-3923序列的表达载体。
本发明的治疗肺鳞癌的药物还包含药物学上可以接受的载体,所述载体包括但不限于:稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
所述药物可以单独施用;或者与其他能够治疗肺鳞癌转移的药物进行组合施用。
所述药物可以离体施用:将miR-3923的表达载体在体外导入或转染人体自身或异体细胞(或异种细胞),经体外细胞扩增后,输回人体。
所述药物可以体内施用:将miR-3923的表达载体直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒性,甚至是裸DNA或RNA。
所述的受试者可以是人类或者其他哺乳动物。更具体地,受试者是器官、组织、细胞。
本发明使用的“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本发明所述的miR-3923的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述miRNA促进剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等;患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
分析miRNA表达谱的方法包括但不限于以下几种:反转录聚合酶链式反应方法(RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链式反应方法(Real-timePCR)、Northern印迹杂交方法(Northernblotting)、核糖核酸酶保护分析方法(RNaseprotectionassay)、Solexa测序技术(Solexasequencingtechnology)和生物芯片。在本发明的具体实施方式中,采用了Solexa测序技术。
本发明中使用的“微小RNA”与“miRNA”、“miR”通用。
本发明中使用的“诊断肺鳞癌转移”包括对肺鳞癌转移的预判,即判断受试者是否存在患有肺鳞癌转移的风险,也包括对肺鳞癌转移的诊断,即判断受试者是否已经患有肺鳞癌转移,也包括对肺鳞癌转移预后的判断,即判断受试者是否存在复发的可能性或者判断受试者已经复发。
本发明中使用的“治疗肺鳞癌转移”包括疾病的治愈、疾病的好转。
本发明的优点和有益效果:
本发明首次发现了miR-3923与肺鳞癌转移相关,通过检测受试者miR-3923的表达,可以判断受试者是否患有肺鳞癌转移、或者判断受试者是否存在患有肺鳞癌转移的风险,从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种新的分子标记物-miR-3923,相比传统的检测手段,微小诊断更及时、更特异、更灵敏,能够实现肺鳞癌转移的早期诊断,从而降低肺鳞癌转移的死亡率。
附图说明
图1显示利用Solexa测序检测miR-3923在肺鳞癌组织中的表达情况;
图2显示利用QPCR检测miR-3923在肺鳞癌细胞株中的表达情况;
图3显示利用QPCR检测miR-3923过表达情况。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述,有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中,若非特意表明,所用的试剂均为分析纯,所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件,或按照制造商所建议的条件。除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例1Solexa测序筛选与肺鳞癌相关的miRNA
1、样本收集
收集40例肺鳞癌组织(包括20例有转移样本和20例无转移样本)上述样本为肺鳞癌患者的手术切除标本。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。组织样本的临床资料包括:性别、年龄、肿瘤大小、病理分级(Edmonson)、转移与否、复发与否等。
2、RNA提取:将碾杵和匀浆器等器皿在200℃干烤4h,去除RNA酶,冷却;加入液氮中预冷,将组织从液氮中迅速取出,碾成粉末;用刮匙将组织放入预先加入TRIzol试剂的匀浆器中,匀浆数分钟;将匀浆后的液体转入无RNA酶的离心管中,加入氯仿后,4℃离心分层;将上层水相转入一无RNA酶的离心管中,加入氯仿后,4℃离心分层;将上层水相转入一无RNA酶的离心管中,加异丙醇,4℃离心沉淀RNA;用75%乙醇洗涤沉淀2次;用无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提的RNA进行质量鉴定(用安捷伦2100测定RNA浓度、纯度和完整性)。质量鉴定好的RNA存放在-80℃冰箱待用。
3、反转录:利用TaKaRa公司的反转录试剂盒(OneStepPrimeScriptmiRNAcDNASynthesisKit)构建两种组织的cDNA文库,根据试剂盒的说明进行反转录。
4、将反转录后的样品利用Solexa方法测序(Solexa测序由华大基因公司完成)。
5、结果:
分析Solexa方法测序结果可知miRNA-3923在已发生转移的肺鳞癌组织中和未发生转移的肺鳞癌组织中的表达存在显著差异,与未发生转移的肺鳞癌组织相比,在已发生转移的肺鳞癌组织中miRNA-3923的水平显著下调(如图1所示)。
实施例2miR-3923在肺鳞癌细胞株中的表达
1、细胞培养
将肺鳞癌细胞株NCI-H520,NCI-H596,NCI-H2170、NCI-H226于DMEM培养基和10%胎牛血清中培养,将人肺上皮细胞株BEAS-2B于BEGM培养液和10%胎牛血清中培养,置于37℃、5%CO2培养箱中。
2、QPCR
2.1细胞总RNA提取:利用QINGEN公司的RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取,按照说明书指示进行。
2.2逆转录:
采用TAKARA公司的反转录试剂盒(DRR047),对1μgRNA进行反转,该试剂盒较传统反转录试剂盒增加了去除基因组DNA的步骤,可在最大程度上保证RNA的纯度和扩增的特异性。反应体系和反应条件参照试剂盒说明书进行。
2.3QPCR反应:
以cDNA为模板,使用针对目标miRNA的PCR引物及Takara的SYBR(R)PremixExTaqTM荧光定量PCR体系,在stratagenMX3000P定量PCR仪上进行扩增,并测得样品的Ct值。将所得Ct值通过代入测定标准曲线得出的公式,采用绝对定量的计算方法得出样品中的目标miRNA的含量。U6基因作为内照对miRNAqPCR检测结果进行标准化校正。
针对miR-3923的引物如下:
正向引物为5’-AACTAGTAATGTTGGATTAGGG-3’(SEQIDNO.1),
反向引物为通用反向引物(购自北京旷博生物技术有限公司)。
针对U6的引物如下:
正向引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(SEQIDNO.2),
反向引物:5’-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQIDNO.3)。
3、结果
如图2所示,与人肺上皮细胞株相比,肺鳞癌细胞株NCI-H520,NCI-H596,NCI-H2170、NCI-H226中miR-3923表达水平显著下调。
实施例3研究miRNA-3923对肺鳞癌细胞粘附能力的影响
1、miRNA合成
由上海吉玛公司合成对照miRNA(miRNA-NC)、miR-3923,其中miR-3923的序列如SEQIDNO.4所示。
2、细胞转染
2.1细胞培养:NCI-H596细胞培养方法同实施例2。
3、细胞转染
将NCI-H596细胞分为两组,分别为对照miRNA-NC组、miRNA-3923组。将两组分别转染miRNA-NC和miRNA-3923,运用转染试剂LipofectamineTM2000进行转染,转染方法参照说明书。miRNA-NC和miRNA-3923的工作浓度均为5μM。转染后48h收集各组细胞用于后续实验。
4、QPCR实验
细胞总RNA提取和PCR步骤同实施例2。
结果如图3所示,与miRNA-NC组相比,miRNA-3923组的miRNA-3923的水平显著升高,表明miRNA-3923过表达成功。
5、细胞粘附实验
将转染48h的NCI-H596细胞使用0.25%胰酶消化成细胞悬液,以5×104个/ml接种于96孔细胞培养板,每孔0.1ml,60min后,37℃PBS洗去未粘附的细胞,MTT法测各孔490nm波长光吸收值。用光吸收值大小代表粘附活细胞的相对数量。
6、结果
miRNA-3923组相对光密度值为0.185±0.011,miRNA-NC组相对光密度值为1.702±0.057。与miRNA-NC组相比,miRNA-3923组光吸收值显著下降(P<0.05)。上述实验结果表明miRNA-3923能够显著抑制NCI-H596细胞粘附能力,同时表明miRNA-3923不利于NCI-H596细胞粘附。
实施例4研究miRNA-3923对肺鳞癌细胞迁移、侵袭能力的影响
1、细胞培养同实施例2。
2、迁移实验
转染48h的NCI-H596细胞使用胰酶消化并计数,取105个细胞置于1.5mLEP管中,加入200μL无血清培养基重悬细胞,加入transwell小室中,下层小室加入10%胎牛血清的DMEM培养基,放入37℃,5%CO2孵箱培养24h。取transwell小室,用棉签擦除里面的细胞,并用PBS轻轻洗掉里面剩余细胞。固定染色后显微镜下取8个随机视野进行计数。
3、侵袭实验
转染48h的NCI-H596细胞使用胰酶消化并计数,取105个细胞置于1.5mLEP管中,加入200μL无血清培养基重悬细胞,加入经过铺基质胶的transwell小室中,下层小室加入10%FBS的DMEM培养基,放入37℃,5%CO2孵箱培养24h。取transwell小室,用棉签擦除里面的细胞,并用PBS轻轻洗掉里面剩余细胞。固定染色后显微镜下取8个随机视野进行计数。
4、结果
迁移实验:与miRNA-NC相比,miRNA-3923组穿过transwell小室基底膜的细胞减少了约61%。
侵袭实验:与miRNA-NC相比,miRNA-3923组穿过已经铺过基质胶的transwell小室基底膜的细胞减少了63%。
上述实验结果表明,miRNA-3923过表达能够显著抑制NCI-H596细胞迁移、侵袭能力。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。