CN105602967A - 水稻qGL3.2基因在用于改良水稻粒型及千粒重性状中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于转基因技术领域，具体涉及水稻antisense-qGL3.2基因在改良水稻粒长及千粒重性状方面的应用。本发明利用水稻粒长基因qGL3.2，将其反向导入短粒近等基因系CW52的基因组中，用以改良水稻的粒型性状，包括采用短粒近等基因系CW52为转基因受体，构建antisense-qGL3.2转基因植株。经试验表明，本发明制得的水稻antisense-qGL3.2转基因植株仅在粒长和千粒重两方面有明显的提高和改善，而其它农艺性状改变不明显；根据田间调查及考种数据，与对照相比，antisense-qGL3.2转基因CW52的产量性状优于对照：粒长增加约0.6mm；千粒重增加约10.7％。

Description

水稻qGL3.2基因在用于改良水稻粒型及千粒重性状中的应用

技术领域

本发明属于转基因技术领域，涉及水稻qGL3.2基因在用于改良水稻粒型及千粒重性状中的应用，具体涉及水稻qGL3.2基因在用于改良水稻粒长及千粒重性状中的应用。

背景技术

现有技术公开了水稻是世界上重要的粮食作物之一，全世界有约2/3的人口以水稻为主食。在耕地面积逐渐减少的情况下，为了满足日益增长的人口对粮食的需求，提高水稻单位产量具有重要意义。资料显示，水稻产量性状主要由有效穗数、每穗粒数和千粒重几部分组成，这些产量性状都属于数量性状(QTL)，由许多效应不同的基因所控制。现有技术中，分离与克隆这类产量性状基因的方法一般采用定位克隆技术，然后采用组成型表达载体或组织专一性表达载体将目的基因导入目标品种，以期获得作物特定经济性状或抗逆性性状的改良。

GSK家族参与植物的多种生长发育，对逆境的反应以及对激素的调控和激素与激素间在分子上的相互作用都有参与。目前，对植物GSK基因的功能研究较少，尚无关于GSK基因涉及产量性状形成及其改良的报道。

本申请的发明人拟提供GSK基因尤其是水稻qGL3.2基因在改良粒长及千粒重性状方面的应用。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的缺陷，提供水稻qGL3.2基因在改良水稻粒长及千粒重性状方面的应用。

本发明以籼型栽培稻PA64与特种大粒稻CW23杂交并与PA64回交构建的产量QTL近等基因系为材料，通过染色体片段叠代定位与基因组序列分析相结合的方法分离克隆了来自CW23基因组的一个控制水稻粒长及千粒重的QTLqGL3.2，研究表明粒型qGL3.2是一个GSK基因(Glycogensynthasekinase)。

具体的，本发明的水稻OsqGL3.2基因在用于改良水稻粒长及千粒重性状中的应用，其特征在于，利用水稻qGL3.2基因，将其反向导入短粒近等基因系CW52，改良水稻的粒长及千粒重性状。

本发明的实施例中，将水稻OsqGL3.2基因反向转化处理短粒近等基因系CW52，使CW52的粒长及千粒重性状获得明显改善。

本发明还包括：水稻qGL3.2的分离、克隆与转基因功能研究等。

1)qGL3.2基因与蛋白结构组成

水稻qGL3.2基因，genbank登录号为DP000009.2，该登陆基因序列全长6281bp，其中调控区长4046bp，编码区长2235bp，序列如SEQ.IDNO1.所示；全长CDS由13个外显子组成，正常编码的cDNA长1275bp，序列如SEQ.IDNO2.所示；编码424个氨基酸，序列如SEQ.IDNO3.所示，

该基因的结构与其编码的蛋白质组成如下：

水稻qGL3.2基因结构如图1所示，蛋白结构如图2所示，

2)antisense-qGL3.2基因表达载体的构建

采用pCAMBIA1304(CenterfortheApplicationofMolecularBiologyofInternationalAgriculture,Canberra,ACT,Australia)为表达载体，将PA64的qGL3.2基因编码区一段285bp大小的片段(序列如SEQ.IDNO4.所示)反向插入到pCAMBIA1304载体多克隆位点下游，得到含有antisense-qGL3.2基因的表达载体，其结构图如图3所示，

3)antisense-qGL3.2基因转化实验

采用籼型栽培稻PA64与特种大粒稻CW23杂交并与PA64回交构建的短粒近等基因系CW52为转基因受体，构建antisense-qGL3.2基因的表达转基因植株；将CW52成熟种子去壳消毒后接种在脱分化植物组织培育基上诱导愈伤组织；在愈伤组织诱导2-3周后，采用基因枪微弹轰击法，将含antisense-qGL3.2基因的经纯化的pCAMBIA1304质粒DNA导入CW52愈伤组织细胞；在添加30ppm潮霉素的MS培养基上连续培养3-4周筛选抗性细胞系，然后将筛选的细胞系转移到分化培养基诱导长芽和生根；

4)转化处理试管苗移载及转化植株后代的分子检测

将antisense-qGL3.2基因转化处理的CW52试管苗移载田间，并在分蘖期取叶片提取DNA采用PCR扩放技术进行分子检测，于2013年冬获得阳性T₀代植株及T₁代种子，2014年夏，在江苏太仓加代繁殖，获得转基因T₁代植株及T₂种子，共计5个株系；

5)antisense-qGL3.2转CW52植株转基因的RT检测

目的基因qGL3.2在转基因植株中与对照相比表达量下调，如图4所示；

6)antisense-qGL3.2转基因T₂代群体产量性状的调查与统计

将antisense-qGL3.2转基因T₁代于2014年夏播种，四叶期将两个antisense-qGL3.2转基因T₂代株系种植在江苏太仓复旦大学试验田，每个小区种植30株，行株距为6寸×6寸，每行10株，重复2次，同时设立近等基因系CW52对照。在成熟期统计各小区20个单株的株高，分蘖，主茎穗粒数，平均穗粒数，粒长，粒宽，千粒重，计算平均值，统计结果如表1所示：

表1

株系

株高(cm)

分蘖

主茎穗粒数

平均穗粒数

粒长(mm)

粒宽(mm)

千粒重(g)

DZF.2-1

99±3.2

9±1.3

113±9.8

85±6.3

10.93±0.05

3.82±0.062

42.4±0.73

DZF.2-4

97±2.4

8±1.1

105±6.3

77±6.1

10.88±0.077

3.86±0.042

42.3±0.84

CW52

91±2.4

8±1.2

102±8.5

80±7.0

10.29±0.051

3.83±0.038

38.2±0.92

根据田间调查及考种数据结果显示，水稻antisense-qGL3.2转基因植株在株高，分蘖，主茎穗粒数，平均穗粒数，粒长，粒宽，千粒重等性状上的变化，与对照相比，antisense-OsqGL3.2转基因CW52的粒长及千粒重性状优于对照：粒长增加约0.6mm，千粒重增加约10.7％(如图5-11所示)；

水稻antisense-OsqGL3.2转基因植株与CW52穗形及种子形态的对比结果如图17-20所示。

试验结果表明，本发明制得的水稻antisense-qGL3.2转基因植株仅在粒长和千粒重两方面有明显的提高和改善，而其它农艺性状改变不明显。

附图说明

图1为水稻qGL3.2基因结构。

图2为水稻qGL3.2基因蛋白结构。

图3为水稻antisense-qGL3.2基因的表达载体结构图。

图4为水稻antisense-qGL3.2基因在转基因植株与对照中表达量的比较。

图5为水稻antisense-qGL3.2转基因植株与对照株高比较。

图6为水稻antisense-qGL3.2转基因植株与对照分蘖比较。

图7为水稻antisense-qGL3.2转基因植株与对照主茎穗粒数比较。

图8为水稻antisense-qGL3.2转基因植株与对照平均穗粒数比较。

图9为水稻antisense-qGL3.2转基因植株与对照粒宽比较。

图10为水稻antisense-qGL3.2转基因植株与对照粒长比较。

图11为水稻antisense-qGL3.2转基因植株与对照千粒重比较。

图12为水稻antisense-qGL3.2转基因种子与对照形态特征比较。

具体实施方式

实施例1

1、选择qGL3.2基因编码区285bp大小的一段(其基因组序列见SEQIDNO.1)，采用PCR方法从近等基因系CW52中将其扩增，并反向插入到植物表达载体pCAMBIA1304多克隆位点下游，获得antisense-qGL3.2表达载体pCAMBIA1304/antisense-qGL3.2；

2、诱导水稻愈伤组织培养基

(1)诱导及继代培养基：MS+2mg/L2,4-D。

(2)高渗培养基：MS+2mg/L2,4-D+46.67g/L山梨醇+46.67g/L甘露醇。

(3)第一轮筛选培养基：MS+2mg/L2,4-D+30mg/L潮霉素。

(4)第二轮筛选培养基：MS+2mg/L2,4-D+50mg/L潮霉素。

(5)分化培养基：MS+3mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+50mg/L潮霉素。

(6)生根壮苗培养基：1/2MS+0.1mg/LNAA；

其中：以上培养基均含30g/L蔗糖+2.5g/Lagar，pH5.8；愈伤诱导、继代、筛选培养条件为26-28℃暗培养，分化、生根壮苗为26-28℃及16小时光周期；

3、愈伤组织诱导与处理

(1)取授粉后12-15天的未成熟种子，在无菌条件下，先用70％乙醇浸洗10min，转入0.1％升汞浸泡20min，无菌水清洗3次；

(2)在无菌条件下剥离幼胚，接种于愈伤诱导培养基上，26-28℃暗培养约20天后切芽，继代一次；

(3)在继代培养基中挑选生长旺盛、淡黄色的愈伤30-50块(每块3mm左右)，置于高渗培养基上中央，排成直径约2.5cm的圆圈内，培养约4-5h后用于转化；

4、基因枪转化

(1)基因枪：为购自宁波新芝科技有限公司的高压气体基因枪,型号:GJ-1000；

(2)微粒子弹制备；

(3)称取60mg钨粉(直径约1um)，加入到1.5ml灭菌离心管中，再加入1ml无水乙醇，振荡1min，于10000rpm离心10s，弃上清，重复洗一次后，将金粉悬浮于1ml无菌水中现用或-20℃保存；

(4)吸取50ul钨粉悬浮液于1.5ml离心管，依次加入5ugDNA、50ul2.5MCaCl₂、20ul0.1M亚精胺，振荡5分钟，10000rpm离心20s，弃上清，以140ul无水乙醇漂洗两次，加入60ul无水乙醇，悬浮待用；

5、轰击受体材料

(1)将基因枪放于超净工作台上，用70％酒精擦净真空室，并将可裂膜、载粒膜、金属挡网(均由宁波新芝科技有限公司供货)于70％酒精中消毒30分钟，然后用无菌滤纸吸干或吹净残余酒精；

(2)打开电源开关，真空泵及氦气瓶阀；

(3)将可裂膜装入固定、旋紧；

(4)取10ul包被DNA的钨粉无水乙醇悬浮液，均匀涂布于载粒膜中心，放在超净台上吹干；

(5)将载有微弹的载粒膜及挡网装入微弹发射装置，使有颗粒的一面朝下；

(6)将培养皿放在托盘上，使愈伤集中于培养皿中央；

(7)打开气瓶，调节压力1100Psi；

(8)抽真空，当真空度达到需要值时，将VAC键转到Hold位置；

(9)轰击，每皿轰击2次(第一次轰击后将培养皿旋转90度后进行第二次轰击)，按放气键使真空表读数回零，取出样品，轰击后于高渗培养基上继续培养12-16h；

6、转化愈伤组织筛选

(1)将打枪后高渗培养基上的愈伤转入不含筛选剂的诱导培养基上恢复生长5-7天；

(2)将愈伤转到含30mg/L潮霉素的筛选培养基上，均匀摆放，暗培养14-17天进行第一次抗性筛选；

(3)将抗性愈伤转入含50mg/L潮霉素的筛选培养基上，暗培养8-12天进行第二次抗性筛选；

7、转化植株筛选与检测

(1)将筛选后存活的愈伤于分化培养基上光照培养30天；

(2)待分化出小植株后，将小植株转入生根壮苗培养基，长大后移入温室；

(3)分别采用PCR扩增和基因组Southern杂交法检测侯选的转化植株，共获得5株含有转化的antisense-qGL3.2片段的阳性植株。

试验结果表明，本发明制得的水稻antisense-qGL3.2转基因植株仅在粒长和千粒重两方面有明显的提高和改善，而其它农艺性状改变不明显。

SEQUENCELISTING

<110>复旦大学

<120>水稻qGL3.2基因在用于改良水稻粒型及千粒重性状中的应用

<130>

<160>4

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>6281

<212>DNA

<213>水稻qGL3.2基因

<400>1

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<210>3

<211>424

<212>PRT

<213>水稻qGL3.2的氨基酸序列

<400>3

MetAlaTyrSerGlyLeuArgHisGlyGlyValGlySerSerSerArg

151015

ProGlyHisGlyPheLysGlyProAlaSerSerValGluCysLeuGly

202530

ArgGluMetLeuGluMetGlnLeuArgAspSerLysProAspValGly

354045

AspGluLysAsnThrGluArgAspValValAspGlySerSerAlaGlu

505560

AlaGlyHisIleIleAlaThrThrIleArgGlyArgAsnGlyLeuPro

65707580

LysGlnSerValThrTyrIleAlaGluHisValValGlyThrGlySer

859095

PheGlyValValTyrGlnAlaLysCysArgGluThrGlyGluIleVal

100105110

AlaIleLysLysValLeuGlnAspLysArgTyrLysAsnArgGluLeu

115120125

GlnIleMetHisMetLeuAspHisProAsnIleValGlyLeuLysHis

130135140

TyrPhePheSerThrThrGluArgAspGluLeuTyrLeuAsnLeuVal

145150155160

LeuGluTyrValProGluThrValAsnArgIleAlaArgGlnTyrSer

165170175

ArgMetAsnGlnArgValProLeuIleTyrValLysLeuTyrThrTyr

180185190

GlnIleCysArgAlaLeuAlaTyrIleHisAsnCysValGlyIleCys

195200205

HisArgAspIleLysProGlnAsnValLeuValAsnProHisThrHis

210215220

GlnLeuLysIleCysAspPheGlySerAlaLysValLeuValLysGly

225230235240

GluProAsnIleSerTyrIleCysSerArgTyrTyrArgAlaProGlu

245250255

LeuIlePheGlyAlaThrGluTyrThrThrAlaIleAspLeuTrpSer

260265270

ThrGlyCysValMetAlaGluLeuLeuLeuGlyGlnProLeuPhePro

275280285

GlyGluSerGlyValAspGlnLeuValGluIleIleLysValLeuGly

290295300

ThrProThrArgGluGluIleLysCysMetAsnProAsnTyrThrGlu

305310315320

PheLysPheProGlnIleLysAlaHisProTrpHisLysValPheGln

325330335

LysArgLeuProProGluAlaValAspLeuValSerArgPheLeuGln

340345350

TyrSerProAsnLeuArgCysThrAlaMetGluAlaCysMetHisPro

355360365

PhePheAspGluLeuArgAspProAsnThrArgLeuProAsnGlyArg

370375380

ProLeuProProLeuPheAsnPheArgThrGlnGluLeuAsnGlyIle

385390395400

ProProGluAlaIleGluArgLeuValProGluHisAlaArgArgGln

405410415

SerLeuPheMetAlaLeuArgThr

420

<210>4

<211>285

<212>DNA

<213>水稻qGL3.2基因表达载体反向序列

<400>4

acccgttgattcattctgctgtactgtctcgcaattcggtttactgtctctggaacatac60

tcaaggacaagattgaggtaaagttcatccctttcagtggttgagaagaagtaatgctta120

agaccaacaatattaggatgatccagcatatgcataatttgcaattccctgttcttgtaa180

cgtttatcttgaagaacctttttaatggcaacaatttctcctgtttctcgacatttggcc240

tgatatacaaccccaaaagaaccagttccgaccacatgctcagca285

Claims (4)

1.水稻qGL3.2基因在用于改良水稻粒型及千粒重性状中的应用，其特征在于，将水稻qGL3.2基因反向导入水稻基因组中，改良水稻的粒型性状；

所述水稻qGL3.2基因，genbank登录号为DP000009.2，该登陆基因序列全长6281bp，其中调控区长4046bp，编码区长2235bp，序列如SEQ.IDNO1.所示；全长CDS由13个外显子组成，正常编码的cDNA长1275bp，序列如SEQ.IDNO2.所示；编码424个氨基酸，序列如SEQ.IDNO3.所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用中，采用短粒近等基因系CW52为转基因受体，构建antisense-qGL3.2转基因植株。

3.一种antisense-qGL3.2基因表达载体，其特征在于，采用pCAMBIA1304为表达载体，将PA64的qGL3.2基因编码区序列如SEQ.IDNO4.所示的一段285bp大小的片段反向插入到pCAMBIA1304载体多克隆位点下游，得到含有antisense-qGL3.2基因的表达载体。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过下述步骤构建antisense-qGL3.2转基因植株：

1)选择qGL3.2基因编码区序列如SEQIDNO.1所示的285bp大小的一段，采用PCR方法从近等基因系CW52中将其扩增，并反向插入到植物表达载体pCAMBIA1304多克隆位点下游，获得antisense-qGL3.2表达载体pCAMBIA1304/antisense-qGL3.2；

2)确定诱导水稻愈伤组织培养基，

包括，诱导及继代培养基，高渗培养基，第一轮筛选培养基，第二轮筛选培养基，分化培养基，和生根壮苗培养基，

其中：所述培养基均含30g/L蔗糖+2.5g/Lagar，pH5.8；

愈伤诱导、继代、筛选培养条件为26-28℃暗培养，分化、生根壮苗为26-28℃及16小时光周期；

3)愈伤组织诱导与处理；

4)基因枪转化；

5)轰击受体材料；

6)转化愈伤组织筛选；

7)转化植株筛选与检测，

分别采用PCR扩增和基因组Southern杂交法检测侯选的转化植株，获得含有转化的antisense-qGL3.2片段的阳性植株。