CN105601631A - 2,4-二取代-5-氯嘧啶类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及2，4-二取代-5-氯嘧啶类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用，具体而言，本发明涉及一种由通式(I)所示的2，4-二取代-5-氯嘧啶类衍生物或其药学上可以接受的盐、立体异构体或前药，其制备方法及其含有该衍生物的药物组合物，以及作为治疗剂特别是作为EGFR抑制剂的用途，其中通式(I)中的各取代基的定义与说明书中的定义相同。
Description
技术领域：
本发明涉及一类具有表皮生长因子受体EGFR抑制活性的噻吩并嘧啶或呋喃并嘧啶类化合物及其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂合物，其制备方法、包含该化合物的药物组合物，以及这些化合物在制备用于预防或治疗与生物体内的表皮生长因子受体(EGFR)相关的细胞异常增殖、形态变化以及运动功能亢进等相关的疾病，以及与血管新生或癌转移相关的疾病的药物，尤其是用于治疗或预防肿瘤生长与转移的药物中的用途。
背景技术：
表皮生长因子受体(EGFR、Erb-B1)属于一种正常与恶性细胞增殖有关的蛋白质家族。表皮生长因子受体的过度表现出现在至少70％的人类癌症(Seymour、L.K.、CurrDrugTargets2，2001，117133)例如，非小细胞肺癌、乳癌(breastcancer)、神经胶质瘤(glioma)、头颈鳞状细胞癌(headandnecksquamouscellcarcinoma)及前列腺癌(prostatecancer)(Raymondetal.、Drugs60suppl1、2000、discussion41-2；Salomonetal.、CritRevOncolHematol19、1995、183-232；Voldborgetal.、AnnOncol8、1997、1197-1206)。因此EGFR-TK广泛被认可为开发及设计化合物之受到瞩目的标靶，所述化合物可以特异性结合且抑制络氨酸激酶的活性以及其于癌细胞中的信号传导路径，也因此可以作为诊断剂和治疗剂。举例来说EGFR络氨酸激酶(EGFR-TK)的可逆抑制剂(reversibleinhibitor)，TARCEVA，为FDA核准用于治疗NSCLC及晚期胰腺癌。经过核准的其它抗-EGFR标靶分子包括拉帕替尼(LAPATINIB)及艾瑞莎(IRESSA)。
厄洛替尼(erlotinib)及吉非替尼(gefitinib)对所有患肺癌的病人的疗效是有限的。当厄洛替尼(erlotinib)及吉非替尼(gefitinib)用于治疗所有的肺癌患者，患者肿瘤收缩(tumorshrinkage)的可能性(反应率)为8-10％及肿瘤恶化的平均时间为约2个月{shepherdetalNEJM2004、Thatcheretal.Lancet2005}。2004年发现与EGFR的体细胞突变有关的肺癌以厄洛替尼(erlotinib)或吉非替尼(gefitinib)治疗后伴随着明显的临床反应{Paezetal.Science20004；Lynchetal.NEJM2004；PaoetalPNAS2004}。
EGER的体细胞突变(somaticmutations)发生机率在NSCLC患者白人为10-15％及在亚洲人为30-40％。EGFR的突变越来越频繁的发生于不吸烟者、女性、罹患腺癌(adenocarcinoma)以及东亚人种患者{ShigematsuetalJNCI2005}。至今已有6种潜在的临床试验单纯化疗的EGFR突变病人都以厄洛替尼(erlotinib)或吉非替尼(gefitinib)有效。这些研究能前瞻性的诊断或治疗超过200位EGFR突变病人。以吉非替尼(gefitinib)及厄洛替尼(er咯tinib)治疗的患者他们共同表现出放射线反应率(responserate)范围从60％至82％及其恶化的平均时间为9.4到13.3个月。这些结果相较于晚期NSCLC铂类药物化疗(platin-basedchemotherapy)(分别为20-30％及3-4个月)为3-4倍大{Schiller、etalJCO2002}。最近刚完成第III级临床试验，以吉非替尼(gefitinib)治疗相较于传统化疗(conventionalchemotherapy)，单纯的EGFR突变的化学治疗NSCLC患者有显著的延长(危害率(hazardratio)＝0.48(95％CI；0.36-0.64)；P＜0.0001)无恶化存活期及肿瘤反应率(71.3对47.2％，P＝0.0001){moketal.EMSOmeeting2008}。相反地，对于NSCLC晚期患者相较于作为其起初治疗的化疗，当EGFR野生型的NSCLC患者接收到吉非替尼(gefitinib)有个更坏的结果{MoketalEMSOmeeting2008}。因此，EGFR突变提供了一个比传统全身化疗更有效重要的选择方法(EGFRTKIs)给NSCLC患者。在许多临床中心经常以EGER突变来评估NSCLC患者。
发明内容
本发明是提供一种2，4-二取代-5-氯嘧啶类衍生物的制备方法以及这些化合物的生物学评价。
化合物示例：
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例应理解为仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的保护范围。
下述实施例中所制得的化合物的结构是通过核磁共振(1HNMR)和质谱(MS)予以确定。
1HNMR位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。1HNMR的测定是用BrukerAVANCE-400核磁仪，测定的溶剂为氘代二甲亚砜(DMSO-d6)，氘代氯仿(CDCl3)，内标为四甲基硅烷(TMS)，化学位移是以10-6作为单位给出。
MS的测定是用FINNIGANLCQAd(ESI)质谱仪(生产商：Therm，型号：FinniganLCQadvantageMAX)。
IC50值的测定是用NovoStar酶标仪(德国BMG公司)。
薄层硅胶是使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板。
硅胶柱层析是使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。
HPLC测试是使用安捷伦1200DAD高压液相色谱仪(SunfireC18150×4.6mm色谱柱)和Waters2695-2996高压液相色谱仪(GiminiC18150×4.6mm色谱柱)。
微波反应是使用CEMDiscover-S908860型微波反应器。
另外，以下实施例中无特殊说明，反应均在氮气氛下进行。氩气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气气球。
以下实施例中无特殊说明，反应中的溶液是指水溶液。
中间体1-6
以上六个中间体的制备方法参照专利：WO2012/061299。
实施例1
第一步：
室温下将去甲托品醇(2.565g，15mmol)和4-氟-2-甲氧基-1-硝基苯(2.095g，16.5mmol)溶解于二甲基亚砜(15ml)中，再向里加碳酸钾(4.140g，30mmol)，室温搅拌反应，直至TLC监测原料反应完全，将反应液倒入水中，向里加乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到化合物7：8-(4-硝基-3-甲氧基-苯基)-8-氮杂-双环[3，2，1]辛烷-3-醇(4.08g，黄色固体)，收率：97％。MSm/z(ESI)：278[M+1]；1HNMR(300Hz，CDCl3)：8.01(d，1H)，6.25(d，1H)，6.14(d，1H)，4.28(s，2H)，4.08(s，1H)，3.93(s，3H)，2.40(d，2H)，2.13(dd，4H)，1.72(m，4H)，1.28(d，1H)。
第二步：
室温下将化合物7溶解于甲醇(5ml)中，缓慢加入83mg钯炭(含水1％)，通入H2，室温搅拌反应直至TLC监测原料反应完全，抽滤，减压浓缩，得到中间体7：8-(4-氨基-3-甲氧基-苯基)-8-氮杂-双环[3，2，1]辛烷-3-醇(249mg，淡紫色固体)。MSm/z(ESI)：248[M+1]；1HNMR(300Hz，CDCl3-d3)：6.63(s，1H)，6.28(d，2H)，4.02(d，3H)，3.82(s，3H)，2.27(m，5H)，2.05(d，3H)，1.53(d，2H)，1.28(d，1H)。
第三步：
将中间体1(286mg，1mmol)和中间体7(249mg，1mmol)溶解于仲丁醇(8ml)中，向里加三氟乙酸74ul，100℃下反应直至TLC监测原料反应完全，冷却至室温后，向里加饱和碳酸氢钠中和，乙酸乙酯(50ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到化合物9(216mg，黄色固体)，收率：43％。m/z(ESI)：497.94[M+1]；1HNMR(300Hz，CDCl3-d3)：8.25(m，1H)，8.16(m，2H)，7.59(m，2H)，6.26(s，1H)，5.99(m，1H)，4.08(s，2H)，3.98(s，1H)，3.80(s，3H)，2.44(dd，5H)，2.05(d，2H)，1.62(t，4H)，1.25(s，1H)。
第四步：
称量化合物9(216mg，0.43mmol)于单口瓶中，向里加铁粉(122mg，2.17mmol)、氯化铵(115mg，2.17mmol)，再加入15ml四氢呋喃和水的混合溶液(比例为1∶1)，65℃下加热回流，直至TLC监测原料反应完全，冷却至室温后，抽滤，减压浓缩，向里加水(100ml)乙酸乙酯(50ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到化合物10(115mg，淡黄色固体)，收率：57％。m/z(ESI)：467.96[M+1]。
第五步：
将化合物10(115mg，0.25mmol)和丙烯酸(26.6mg，0.37mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中，再向里加1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(71mg，0.37mmol)，室温搅拌反应，直至TLC监测原料反应完全，将反应液倒入水中，向里加乙酸乙酯(100ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到实施例1(97mg，淡黄色固体)，收率：75％。m/z(ESI)：522.01[M+1]；1HNMR(300Hz，DMSO-d6)：10.30(s，1H)，8.30(s，1H)，8.05(s，1H)，7.62(t，1H)，7.53(d，1H)，7.37(t，1H)，7.14(d，1H)，6.94(dd，1H)，6.42(dd，1H)，6.25(dd，2H)，6.01(s，1H)，5.76(dd，1H)，4.50(d，1H)，4.05(s，2H)，3.71(d，4H)，2.23(d，2H)，1.90(m，4H)，1.45(d，2H)。
实施例2
通过中间体2和中间体7，参照实施例1的合成步骤，即可得到实施例2。m/z(ESI)：522.02[M+1]；
1HNMR(400Hz，DMSO-d6)：7.82(s，1H)，7.76(s，1H)，7.49(d，2H)，7.38(t，2H)，7.29(t，1H)，7.00(d，1H)，5.49-5.40(m，1H)，5.29(s，1H)，3.88(t，2H)，3.59(s，4H)，2.56(dt，4H)，2.44(s，5H)，1.07(t，3H)。
实施例3
其中中间体8的合成可参照实施例1中的前两步，然后通过中间体1和中间体8，参照实施例1的合成步骤，即可得到实施例3。MSm/z(ESI)：523.01[M+1]；1HNMR(300Hz，DMSO-d6)：10.32(s，1H)，8.30(s，1H)，8.06(s，1H)，7.61(s，1H)，7.54(d，1H)，7.38(t，1H)，7.15(d，1H)，6.94(d，1H)，6.39(d，1H)，6.23(d，2H)，5.91(s，1H)，5.76(d，1H)，4.62(d，1H)，4.03(d，1H)，3.70(s，3H)，3.14(dd，4H)，2.61(s，2H)，2.05(m，2H)，1.34(m，2H)。
实施例4
微波下将中间体8(120mg，0.48mmol)和中间体5(149mg，0.48mmol)溶解于正丁醇(8ml)中，向里加15ul浓盐酸，150℃下微波反应30分钟后，冷却至室温，旋去正丁醇，用硅胶色谱柱法纯化所得残留物，得到实施例4(39mg，淡黄色色固体)。m/z(ESI)：522.01[M+1]；1HNMR(300Hz，DMSO-d6)：10.09(s，1H)，8.73(s，1H)，7.97(d，2H)，7.58(d，，1H)，7.53(d，1H)，7.41(d，1H)，7.30(d，1H)，7.19(t，1H)，6.44(dd，1H)，6.24(d，2H)，6.02(d，1H)，5.73(s，1H)，4.62(d，1H)，4.04(s，1H)，3.64(d，3H)，3.19(m，4H)，2.62(s，2H)，2.06(s，2H)，1.36(d，2H)。
实施例5
通过中间体8和中间体6，参照实施例4的合成步骤，即可得到实施例5。m/z(ESI)：539.07[M+1]；1HNMR(300Hz，DMSO-d6)：10.46(s，1H)，9.47(s，1H)，8.26(m，2H)，7.97(d，1H)，7.54(dd，1H)，7.37(d，1H)，7.00(d，2H)，6.48(dd，1H)，6.33(m，3H)，5.83(d，1H)，4.67(d，1H)，4.10(m，1H)，3.18(dd，4H)，2.53(d，2H)，2.13(m，2H)，1.40(dd，2H)。
实施例6
其中中间体9的合成可参照实施例1中的前两步，然后通过中间体4和中间体9，参照实施例4的合成步骤，即可得到实施例6。m/z(ESI)：492.98[M+1]；1HNMR(300Hz，DMSO-d6)：10.41(s，1H)，9.47(s，1H)，8.43(s，1H)，7.69(d，2H)，7.50(t，1H)，7.24(s，2H)，7.04(d，1H)，6.44(dd，4H)，5.84(d，1H)，4.66(d，1H)，4.08(d，1H)，3.15(s，4H)，2.67(s，2H)，2.12(m，2H)，1.41(dd，2H)。
实施例7
通过中间体9和中间体5，参照实施例4的合成步骤，即可得到实施例7。m/z(ESI)：492.00[M+1]；1HNMR(300Hz，DMSO-d6)：10.23(s，1H)，9.03(s，1H)，8.87(s，1H)，8.12(s，1H)，7.93(s，1H)，7.57(s，1H)，7.44(d，2H)，7.35(d，1H)，6.51(m，3H)，6.32(d，1H)，5.82(d，1H)，4.69(d，1H)，4.08(dd，1H)，3.16(d，4H)，2.67(s，2H)，2.12(m，2H)，1.40(dd，2H)。
实施例8
通过中间体9和中间体6，参照实施例4的合成步骤，即可得到实施例8。m/z(ESI)：509.05[M+1]；1HNMR(300Hz，DMSO-d6)：10.42(s，1H)，8.27(s，1H)，8.11(d，1H)，7.90(d，2H)，7.52(t，1H)，7.33(d，1H)，6.96(d，1H)，6.48(dd，1H)，6.30(m，2H)，5.83(d，2H)，4.71(d，1H)，4.05(t，1H)，3.72(d，3H)，3.20(dd，4H)，2.69(d，2H)，2.13(m，2H)，1.43(dd，2H)。
实施例9
通过中间体7和中间体6，参照实施例4的合成步骤，即可得到实施例9。m/z(ESI)：509.05[M+1]；1HNMR(300Hz，DMSO-d6)：10.42(s，1H)，8.31(d，1H)，8.09(d，1H)，7.95(s，1H)，7.84(s，1H)，7.52(t，1H)，7.35(d，1H)，6.98(d，1H)，6.61-6.41(m，1H)，6.36(t，2H)，5.83(d，2H)，4.54(d，1H)，4.08(d，2H)，3.79(s，4H)，2.31(d，2H)，1.96(dd，4H)，1.53(d，2H)。
实施例10
其中中间体10的合成可参照实施例1中的前两步，然后通过中间体10和中间体6，参照实施例4的合成步骤，即可得到实施例10。m/z(ESI)：508.05[M+1]；1HNMR(300Hz，DMSO-d6)：10.46(s，1H)，9.46(s，1H)，8.32(d，1H)，8.15(d，1H)，7.97(s，1H)，7.55(t，1H)，7.37(d，1H)，6.99(d，2H)，6.42(d，4H)，5.83(d，1H)，4.58(d，1H)，4.06(s，2H)，3.75(s，1H)，2.29(d，2H)，1.93(d，4H)，1.50(d，2H)。
实施例11
其中中间体11的合成可参照实施例1中的前两步，然后通过中间体11和中间体6，参照实施例4的合成步骤，即可得到实施例11。m/z(ESI)：508.06[M+1]；1HNMR(300Hz，DMSO-d6)：10.41(d，1H)，9.50(s，1H)，8.47-8.08(m，2H)，7.95(d，1H)，7.59(dd，1H)，7.38(d，1H)，6.99(d，1H)，6.59-6.41(m，1H)，6.40-6.17(m，2H)，5.84(d，1H)，3.22(d，2H)，3.18-2.75(m，4H)，2.61(dd，2H)，2.37(d，2H)，2.33-1.94(m，3H)。
实施例12
其中中间体12的合成可参照实施例1中的前两步。
将中间体12(150mg，0.454mmol)和中间体4(211mg，0.681mmol)溶解于仲丁醇(8ml)中，向里加三(二亚苄基丙酮)二钯(41mg，0.045mmol)，4，5-双二苯基膦-9，9-二甲基氧杂蒽(26mg，0.045mmol)，碳酸钾(125mg，0.091mmol)，氮气保护，90℃下反应直至TLC监测原料反应完全，冷却至室温后，用水和乙酸乙酯(50ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到化合物12(60mg，淡黄色固体)，收率：22％。m/z(ESI)：605.16[M+1]；1HNMR(300Hz，DMSO-d6)：10.44(s，1H)，8.37(s，1H)，8.18(s，1H)，7.81-7.57(m，2H)，7.46(t，1H)，7.20(d，1H)，7.02(d，1H)，6.51(dd，1H)，6.40-6.19(m，2H)，6.12-5.72(m，2H)，3.89-3.62(m，3H)，2.67(d，4H)，2.39(d，4H)，2.36-2.07(m，5H)，1.66-1.12(m，4H)。
实施例13
通过中间体12和中间体6，参照实施例12的合成步骤，即可得到实施例13。m/z(ESI)：621.22[M+1]；1HNMR(300Hz，DMSO-d6)：10.43(s，1H)，8.24(d，1H)，8.14(d，1H)，7.89(s，2H)，7.52(t，1H)，7.34(d，1H)，6.94(d，1H)，6.48(dd，1H)，6.43-6.11(m，2H)，5.83(d，2H)，4.12-3.56(m，3H)，2.97(d，，4H)，2.65(d，4H)，2.37(d，5H)，2.37-1.86(m，5H)，1.59-1.00(m，3H)。
实施例14
其中中间体13的合成可参照实施例1中的前两步，然后通过中间体13和中间体6，参照实施例12的合成步骤，即可得到实施例14。m/z(ESI)：590.17[M+1]；1HNMR(300Hz，DMSO-d6)：10.46(s，1H)，9.49(s，1H)，8.54-8.13(m，2H)，7.91(s，1H)，7.57(t，1H)，7.37(d，1H)，6.99(d，2H)，6.48(dd，1H)，6.42-6.17(m，3H)，6.02-5.65(m，1H)，3.30-2.86(m，4H)，2.68(s，3H)，2.48(dd，4H)，2.34(s，3H)，2.27-2.01(m，6H)，1.24(d，2H).
实施例15
其中中间体15的合成可参照实施例1中的前四步。
将中间体15(100mg，0.244mmol)和4-氯-3-三氟甲基异氰酸苯酯(81mg，0.366mmol)溶解于无水四氢呋喃(5ml)中，室温搅拌直至TLC监测原料反应完全，向反应液中加几滴饱和碳酸氢钠溶液，用水和乙酸乙酯(50ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到实施例15(97mg，淡黄色固体)，收率：63％。m/z(ESI)：633.48[M+1]；1HNMR(300Hz，DMSO-d6)：9.53(s，1H)，9.34(d，1H)，9.08(s，1H)，8.40(s，1H)，8.13(s，1H)，7.65(d，2H)，7.50(t，1H)，7.41(dd，2H)，7.24(d，2H)，6.89(t，1H)，6.64(d，2H)，2.94(s，4H)，2.34(s，4H)，2.18(s，3H)。
实施例16
其中中间体16的合成可参照实施例1中的前四步。然后通过中间体16和4-氯-3-三氟甲基异氰酸苯酯，参照实施例15的合成步骤，即可得到实施例16。m/z(ESI)：660.50[M+1]；1HNMR(300Hz，DMSO-d6)：9.44(s，1H)，9.30(s，1H)，9.09(s，1H)，8.43(s，1H)，8.19(s，1H)，7.71(d，2H)，7.58-7.39(m，3H)，7.24(d，2H)，6.94(d，1H)，6.53(d，2H)，4.51(s，1H)，4.03(s，2H)，3.73(s，1H)，2.23(d，2H)，2.03-1.74(m，4H)，1.43(d.2H)。
第一步：
参照实施例15的合成步骤。
第二步：
将中间体18(500mg，0.7mmol)溶解于二氯甲烷(15ml)中，向里加三氟乙酸(1ml，1.4mmol)室温搅拌直至TLC监测原料反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液和乙酸乙酯(50ml*3)萃取，再用饱和氯化钠溶液(100ml*2)洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到实施例17(140mg，白色固体)。m/z(ESI)：618.45[M+1]；1HNMR(300Hz，DMSO-d6)：10.19(s，1H)，9.89(s，1H)，9.64(s，1H)，8.46(s，1H)，8.15(s，1H)，7.66(dd，3H)，7.42(dt，4H)，6.95(d，1H)，6.77(d，2H)，3.23(d，9H)。
生物学评价：
1、受体酪氨酸激酶EGFR分子水平酶活抑制初步评价实验
(1)酶反应底物Poly(Glu，Tyr)4∶1用无钾离子的PBS(10mM磷酸钠缓冲液，150mMNaCl，pH7.2-7.4)稀释成20μg/ml，125μl/孔包被酶标板，置37℃反应12-16小时。弃去孔中液体。洗板，用200μl/孔的T-PBS(含0.1％Tween-20的无钾离子的PBS)洗板三次，每次5分钟。于37℃烘箱中干燥酶标板1-2小时。
(2)每孔加入用反应缓冲液(50mMHEPESpH7.4，50mMMgCl2，0.5mMMnCl2，0.2mMNa3VO4，1mMDTT)稀释的ATP溶液50μL，终浓度5μM。每孔中加入1μl的化合物溶液(1％DMSO溶解，终浓度为10μM)，再加入50μl用反应缓冲液稀释的c-Met酪氨酸激酶蛋白。置37℃摇床(100rpm)反应1小时。每次实验需设无ATP对照孔两孔及相应DMSO溶剂对照孔(阴性对照孔)。弃去孔中液体，T-PBS洗板三次。
(3)加入抗体PY99100μl/孔(抗体用含BSA5mg/ml的T-PBS稀释，浓度为0.4μg/ml)，37℃摇床反应0.5小时。弃去孔中液体，T-PBS洗板三次。
(4)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗100μl/孔(抗体用含BSA5mg/ml的T-PBS稀释，浓度为0.5μg/ml)，37℃摇床反应0.5小时。弃去孔中液体，T-PBS洗板三次。
(5)加入2mg/ml的OPD显色液100μl/孔(用含有0.03％H2O2的0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH＝5.4)稀释)，25℃避光反应1-10分钟。(OPD溶解时需用超声，显色液需现配现用)。
(6)加入2MH2SO450μl/孔中止反应，用可调波长式微孔板酶标仪VERSAmax读数，波长为490nm。
(7)样品的抑制率通过下列公式求得：
表1.部分化合物对酪氨酸激酶EGFR激酶抑制率(％)
| 实施例编号 | 10nm抑制率(％) | 100nm抑制率(％) |
| 5 | 24.2 | 78.6 |
[0103]
| 8 | 37.0 | 61.8 |
| 9 | 31.3 | 75.3 |
| 10 | 49.2 | 79.2 |
| 11 | 55.3 | 90.0 |
| 13 | 60.3 | 78.8 |
| Gefitinib | 68.2 | 95.7 |
2、受体酪氨酸激酶EGFR酶活抑制IC50评价实验
将上述筛选得到的明确具有EGFR酶活抑制作用的化合物(化合物在10-5M对受体酪氨酸激酶EGFR的抑制率＞50％)配成梯度浓度，进行IC50评价。用四参数法计算各化合物分子水平抑制蛋白酪氨酸激酶的IC50值，结果列入表2中。
表2.部分化合物对酪氨酸激酶EGFR酶活抑制的IC50
Claims (8)
1.2，4-二取代-5-氯嘧啶类衍生物，其结构为下述通式(I)所示：
其中R1为氢、甲氧基或卤素；R2为 X为氮、氧或硫。
2.权利要求1化合物的制备方法包括以下步骤：
第一步：
室温下将去甲托品醇和4-氟-2-甲氧基-1-硝基苯溶解于二甲基亚砜中，再向里加碳酸钾，室温搅拌反应，直至TLC监测原料反应完全，将反应液倒入水中，向里加乙酸乙酯萃取，再用饱和氯化钠溶液洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到化合物7；
第二步：
室温下将化合物7溶解于甲醇中，缓慢加入钯炭(含水1％)，通入H2，室温搅拌反应直至TLC监测原料反应完全，抽滤，减压浓缩，得到中间体7；
第三步：
将中间体1和中间体7溶解于仲丁醇中，向里加三氟乙酸，100℃下反应直至TLC监测原料反应完全，冷却至室温后，向里加饱和碳酸氢钠中和，乙酸乙酯萃取，再用饱和氯化钠溶液洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到化合物9；
第四步：
称量化合物9于单口瓶中，向里加铁粉、氯化铵，再加入四氢呋喃和水的混合溶液(比例为1∶1)，65℃下加热回流，直至TLC监测原料反应完全，冷却至室温后，抽滤，减压浓缩，向里加水，乙酸乙酯萃取，再用饱和氯化钠溶液洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到化合物10；
第五步：
将化合物10和丙烯酸溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，再向里加1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌反应，直至TLC监测原料反应完全，将反应液倒入水中，向里加乙酸乙酯萃取，再用饱和氯化钠溶液洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残留物，得到实施例1。
3.根据权利要求2所述方法，第一步的二甲基亚砜要做无水处理。
4.根据权利要求2所述方法，第三步需要在氮气保护下完成。
5.根据权利要求2所述方法，第四步的N，N-二甲基甲酰胺要做无水处理。
6.权利要求1所述的2，4-二取代-5-氯嘧啶类衍生物可接受的盐或药学上可接受的溶剂合物。
7.权利要求1所述放的2，4-二取代-5-氯嘧啶类衍生物具有作为治疗剂特别是作为EGFR抑制剂的用途。
8.权利要求1所述的2，4-二取代-5-氯嘧啶类衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。
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-
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