CN1055970C - 源于德氏乳杆菌的质粒 - Google Patents

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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora

Abstract

本发明涉及一个来源于德氏乳杆菌的质粒，它至少包含如图1所示的限制性酶谱或者它的某些部分；一个包含上述质粒的重组载体，它至少包含一种能够在大肠杆菌和/或乳酸乳球菌体内复制的DNA顺序及至少一个选择标记。
本发明还涉及被上述质粒和/或重组载体转化的微生物。

Description

源于德氏乳杆菌的质粒
该发明涉及一种来源于德氏乳杆菌(Lacto bacillusdelbrueckii sp.)的新质粒，一种包含上述质粒的重组载体，被上述质粒和/或载体转化的微生物，以及该质粒和/或载体转化微生物的应用。
一个对机体成功的生物转化必须满足下列三个原则：
1.用于转化的DNA必须通过诸如电转化，无机离子处理，原生质体融合等物理的或者化学的方法被导入有机体。
2.应用一种或一种以上的选择标记，如以与转化DNA连锁的抗生素抗性基因为标记，使转化体能够从非转化细胞群体中被选择出来。无论是通过从该靶宿主分离某种抗生素抗性基因，还是设计一种已知的带有为靶宿主相容的表达顺序(启动子和终止区)的抗性基因，这个目的将会被很好地实现。
3.转化的DNA必须被复制(自主地或者作为宿主基因组的一部分)。通过从被转化的宿主分离复制的质粒，然后在微生物，如大肠杆菌(E.Coli)或乳球菌(LC.lactis)，及其一种特殊的靶机体如德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.bulgaricus)中构建复制型载体，就能很好地实现此目的。
国际专利申请WO92/14825描述了从德氏乳杆菌保加利亚亚种M-878菌株中分离得到的长度大约为7.9kb质粒pBULI及其衍生质粒。
这种质粒的限制性酶谱的特征为缺少BamHI、EcoRI、KpnI及PstI限制性酶位点。
这种质粒被用作培育各种微生物如乳酸细菌(Lactic acidbacteria)的载体；它的衍生质粒被用作(乳酸细菌和大肠杆菌之间的)一种穿梭载体。
其它穿梭载体，在Canadian Journal of Microbio-logy(Vol.38(1992)pp.69-74)，ACTA MICROBI-OLOGICA BUL GARICA(Vol.27(1991)pp.3-8)，及日本专利申请JP-A-4.218.381中有所描述。
本发明的目的在于提供一种新的来源于德氏乳杆菌的质粒，该质粒能被用来转化特异的微生物，尤其是保加利亚乳杆菌，(Lactobacillus bulgaricus)。
本发明的另一个目的是获得一种包含上述质粒的重组载体，此种载体能够在大肠杆菌和乳酸乳球菌中复制，并且能够转化特异的微生物，尤其是保加利亚乳杆菌。
本发明涉及一种来源于德氏乳杆菌的新质粒，至少包括如图1所示的限制性图谱或它的某些部分。
本发明的质粒至少包括DNA序列SEQ ID NO.1和/或它的互补链，或者它的某些部分。
而且，该发明涉及一种包含本发明质粒的重组载体，它至少有一能够在大肠杆菌和/或在乳酸乳球菌中复制的DNA顺序，并且至少有一选择标记。
此能够在大肠杆菌和/或乳酸乳球菌中复制的DNA顺序，用一个特异的质粒来构建，如pDP193，此质粒允许重组载体在大肠杆菌或者乳酸乳球菌中自由扩增以便于分子操作。
依据本发明，包含在重组载体中的选择标记是一段被用作分析之用的参考DNA片段(如一个已知表型和定位的基因)，并且它是一段能够在被该载体转化的微生物中表达的DNA片段。
此DNA片段也可用来转化微生物，以获得下列结果：
-噬菌体的耐受菌株，
-粘液菌株(改良结构特性)，
-前生命期的菌株(Probiotic strains)，
-产生新的或改良的酶(脂酶，脱氢酶等)，产生芳香化合物等的菌株。
本发明也涉及被该质粒和/或重组载体转化的微生物，优选保加利亚乳杆菌。
最后，本发明涉及该质粒和/或载体转化微生物的应用。
图1表示德氏乳杆菌的质粒PN42的限制性酶谱。
图2表示从pJDC9质粒和PN42质粒构建的质粒PN42-Sub CB的结构。
图3表示从质粒pJDC9和PN42构建的质粒PN42-Sub CE的结构。
图4表示从质粒pUC19和pN42构建的质粒pN42-Sub W和pN42-Sub X的结构。
图5表示质粒pDP352的氯霉素乙酰基转移酶基因的结构。
图6表示质粒pDP193的结构。
图7表示质粒pDP359的结构。
依据本发明，作为大肠杆菌/乳酸乳球菌和德氏乳杆菌之间的穿梭载体，质粒pDP359的结构具有如下特征：
第一，pDP193的掺入使质粒在大肠杆菌或乳酸乳球菌中自由扩增以便于分子操作，例如基因的附加物在德氏乳杆菌保加利亚亚种中被表达。第二，如此完整地包含了德氏乳杆菌的质粒，能够保证质粒pDP359拥有pN42复制所必需的全部顺序，并且保证质粒pDP359以pN42在其宿主N42体内同样的方式在保加利亚乳杆菌中进行复制。第三，设计在pDP352中的氯霉素抗性基因能够保证有一种手段在德氏乳杆菌保加利亚亚种中选择转化体。
分析来自Nestlé培养物保藏中心的五十多个德氏乳杆菌菌株，确定一株，N42，包含一个染色体外的复制型质粒。此质粒被命名为pN42(其限制性酶谱如图1所示)，并被选作分析，因为它包含质粒在德氏乳杆菌保加利亚亚种中复制必需的，由质粒编码的全部反式和顺式元件。通过API试验和与德氏乳杆菌的特异性探针的杂交试验(Delley M.，Mollet B.，和Hottinger H.，1990，DNA probe for L.delbrueckii，Appl.Environ.Microbiol，56：1967-1970)，N42作为一个德氏乳杆菌的菌株，其完备性得到证实。
pN42质粒DNA是通过氯化铯溴化乙锭浮力密度梯度离心分离提取的，以便用于限制性酶谱分析和亚克隆。质粒pN42在几个确定的单一的限制性酶位点以完整的形式被克隆进大肠杆菌载体pJDC9(J.-D.Chen and D.A.Morrisson 1987，Cloning ofStreptococcus Pneumoniae DNA Fragments inEscherichia coli Requires Vector Protected byStrong Transciptional Terminators，Gene 55，179-187)：在PstI位点克隆得pN42-Sub CB，在Avr II位点克隆得pN42-Sub CE，或者被克隆到pUC/pK质粒，以进行DNA序列分析。
pN42质粒DNA用限制性内切酶PstI酶切，然后与同样经PstI酶切并且脱磷酸的pJDC9载体混合，连接后转入大肠杆菌中。菌落用限制性酶酶切进行分析，得一阳性克隆命名为pN42-Sub CB(如图2所示)。
pN42质粒DNA用限制性酶AvrII酶切，然后与经XbaI酶切并且脱磷酸的pJDC9载体混合，连接后再转入大肠杆菌，菌落用限制性酶酶切分析，得一阳性克隆命名为pN42-Sub CE(如图3所示)。
pN42质粒DNA用限制性酶EcoRV和PstI双酶切，在琼脂糖凝胶上分离DNA片段，得到纯化的3.1kb和5.1kb两片段。两片段分别与经限制酶SmaI和PstI双酶切并且脱磷酸的pUC19载体混合，连接后转入大肠杆菌，菌落用限制性酶酶切分析，其阳性克隆分别命名为pN42-Sub W和pN42-Sub X(分别对应于5.1kb和3.1kb片段)，如图4所示。
再以Pharmacia公司的T7 Sequencing试剂盒和35SdATP为材料，应用双脱氧链终止反应在双链上合成寡核苷酸引物，进行亚克隆，测定其DNA序列，得pN42 DNA全序列。pN42为环状双链质粒，由8140对碱基组成，根据GCG库中计算机“读码框架”程序确定pN42至少包含编码50个或更多氨基酸的五个开放读码框架(ORF1-ORF5)，〔计算机软件来自Genetics ComputerGroup Inc.(GCG)，Devereux J.，Haeberli P.andSmithies O.(1984)，A comprehensive set ofsequence analysis programs for the VAX.NucleicAcide Res.12：387-395〕。计算机“重复”程序确定一个直接重复三次的21对碱基，它可能是复制的起点。pN42的限制性酶谱如图1所示，其DNA全序列见序列表1(SEQ ID NO.1)。
pN42的DNA序列分析，使基因组的结构特征得到了明确，这些特征对于质粒在德氏乳杆菌体内的复制可能是重要的。同时也明确了穿梭载体的结构，它完整地保留这些特征(通过在下列限制性位点AVrII、NsiI、SphI克隆pN42可以获得基因的一般特征，来自德氏乳杆菌的Nb质粒DNA仅仅在五个SphI位点中的一个位点被切割，即在7882bp处)。
这就能保证，当被转入德氏乳杆菌保加利亚亚种菌体后，上述穿梭载体能够得到复制。
可以断定，由某一确定的抗性基因决定的抗生素抗性可以传导给任何其它的生物体，如果它包含有合适的翻译/转录的控制信号的话。因此，明确的革兰氏阳性氯霉素抗性基因〔氯霉素乙酰基转移酶(CAT)来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〕来自具有广泛宿主范围的质粒pNZ12(W.M.de Vos.198)Gene Cloning and Expression in Lactic strept-ococci，FEMS Microbiol，Review，46，281-295)，并用其构造一个完整的来自Lac-Z操纵子的德氏乳杆菌保加利亚亚种的启动子(P.Leong-Morgenthaler，M.C.Zwahlenand H.Hottinger，1991，Lactose Metabolism inLactobacillus bulgaricus：Analysis of thePrimary Structune and Expression of the GenesInvolved，J.Bacteriol.，173，1951-1957)。其下游接一个乳酸乳球菌菌株NCDO2054的乳糖一半乳糖操纵子的革兰氏阳性茎-环状终止子。其完整的结构如图5所示。
质粒pKN19为大肠杆菌克隆载体pK19(R.D.Pridmore，1987，New and Versatile Cloning Vectors WithKanamysin-Resistance，Gene，56，309-312)，在此，其非必需区的单一BspHI限制性酶位点经限制性酶切被破坏，其末端突出的四个碱基用四种单核苷酸和Klenow酶修复(T.Maniatis，E.F.Fritch and J.Sawbrook，Molec-ular Cloning a laboratorg manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spriny Harbor，NV，1982)。pNZ12的氯霉素抗性基因用PCR抗增得到(SaikiR.K.，Gelfand D.H.，Stoffel S.，Scharf S.J.Higuchi R.，Horn G.T.，Mullis K.B.，and EhrlichH.A.1988，primer-directed enzymatic amplif-ication of DNA with a thermostable DNAPolgmerase.Sciencc，239：487-491；Salki R.K.，Scharf S.，Faloona F.，Mullis K.B.，Horn G.T.，Ehrlich H.A.and Arnheim N.，1985，Emzymatic amplification of β-globin genomicsepueuces and restriction site analysis fordiagnosis of sickle cell anemia，Science230：1350-1354)，其中使用突变引物A(5′-AGGAGGATCCTCTCATGAACTTTAATAAAATTG)，其引进一个BspHI限制性位点与CAT基因的起始密码ATG重叠，和引物B(5′-TACAGTATCGATTATCTCATATATTATA)，其在CAT基因下游9bp处引进一个ClaI限制性位点。PCR扩增程序如下，50ng的BglII酶切的pNZ12DNA，加寡核苷酸引物A和B各0.3μm、200μm的四种单核苷酸，PCR循环：94℃0.5分钟-50℃0.5分钟-72℃0.5分钟，共30个循环。
PCR扩增产物用限制性酶ClaI和BamHI双酶切，用琼脂糖凝胶回收并纯化660bp片段，然后把它克隆在已经ClaI和BamHI酶切并脱磷酸的大肠杆菌载体pBS KS+上(StratageneCorp.)。连接后的片段转入大肠杆菌，然后把转化菌铺在含有氨苄青霉素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)和异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB平板上。用限制性酶酶切分析来筛选克隆，得一阳性克隆命名为克隆A(Clone A)。克隆A是一个氯霉素和氨苄青霉素双耐受株。克隆A用限制酶MfeI和StuI酶切并脱磷酸，此片段被来源于pNZ12等价CAT MfeI-StuI酶切片段所置换，这将消除CAT基因内由PCR产生的突变，于是得到克隆B(CloneB)(此步在图5中没有表示出来)。
克隆B再用限制性酶BamHI和ClaI酶切，用琼脂糖凝胶回收纯化660bp片段。pKN19/galT-末端就是在pKN19中包含有来自乳酸乳球菌NCD2054的乳糖-半乳糖操纵子的终止子(作为SpeI-SacI限制性片段)，并且如上所述原DK19内部的BspHI酶位点已被消除。pKN19/galT-末端用限制性酶SfuI和SacI酶切(对比片段而言此两位点原就存在)，用琼脂糖凝胶纯化190bp的片段。混合上述两片段，再加上用限制性酶SacI和BamHI酶切并脱磷酸的载体pKN19，连接后转入大肠杆菌。克隆应用限制性酶酶切筛选，得一阳性克隆，命名为克隆C(Clone C)。
已发表的德氏乳杆菌保加利亚亚种的lacS启动子被用来设计两个突变的寡核苷酸，引物C(5′-ATTGGAAGAATTCACCAACGCTTTTCATTTC)在起始密码ATG上游240bp处引入一个EcoRI限制性酶位点。引物D(5′-GGTGGTGACGAAGACGATA)引导lacS基因的ATG下游的110bp，lacS基因包含一个BspHI限制性酶位点与起始密码相重叠。PCR扩增按下列程序进行：德氏乳杆菌基因组DNA 100ng，加寡核苷酸引物C和D各0.3μM，再加四种单核苷酸200μM。PCR循环：94℃0.5分钟-50℃0.5分钟-72℃0.5分钟，共进行30个循环。PCR产物用限制性酶EcoRI和BspHI酶切，用琼脂糖凝胶纯化250bp的片段。克隆C用限制性内切酶BspHI和SacI酶切，用琼脂糖凝胶纯化780bp的片段。把上述两片段连接到经EcoRI和SacI酶切并脱磷酸的pKN19载体上，转入大肠杆菌，把它铺在含有卡那霉素的LB平板上，克隆用限制性酶酶切分析来筛选，得一阳性克隆命名为pDP352，序列表2(SEQ ID NO.2)为其DNA全序列。
被组建在pDP352上的氯霉素抗性基因在完整的德氏乳杆菌保加利亚亚种从启动子开始被转录，此启动子在某宿主体内被组成性表达。此包括原启动子元件：-35区和-10区，核糖体结合位点和氯霉素抗性基因起始密码ATG的相对位置与其和原lacS基因起始密码ATG的相对位置完全一致。这就能保证氯霉素抗性基因能在正确的位置上起始转录和翻译，并且能够保证抗性基因起作用。
大肠杆菌和乳酸乳球菌的穿梭载体pDP193是从大肠杆菌载体pUC18〔R.D.Pridmore，1987，New and VersatileCloning Vector with Karamycin-Resistonce，Gene，56，309-312)和质粒pVA749(F.L.Macrina，J.A.Tobian，K.R.Jones and R.P.Evans，MolecularCloning in the Streptococci，in A Hallaender，R.DeMoss，S.Kaplan，S.Konisky，D.Savage and R.Wolue(Eds.)Genetic engineering of micqoorga-nisms for Chemicals，Plenum，New York，1982，pp.195-210)构建而来。pVA749取自于嵌合质粒pVA838(F.L.Macrina，J.A.Tobian，K.R.Jones，R.P.Evansand D.B.Clewell，1982，A Cloning Vector ableto Replicate in Escherichia coli and Strept-ococcus Sanguis，Gene，19，345-353)，其作为pVA838的一个HindIII限制性片段，并把它克隆到pUC18的HindIII位点。与pUC多克隆位点反向的第二个HindIII位点经Klenow酶末端修补而被消除。pUA749自身包含一个来源于粪链球菌(streptococcus faecalis)的革兰氏阳性的质粒复制起点(在乳酸乳球菌体内能够复制)和来源于pAMβ1的红霉素抗性基因。pDP193的结构如图6所示。
质粒pVA838用限制性酶HindIII酶切，用琼脂糖凝胶分离片段，并纯化5.2kb的pUA749片段。载体pUC18用HindIII酶切并脱磷酸，再与pVA749片段混合，连接后转入大肠杆菌。应用限制性酶酶切分析来筛选菌落，一阳性克隆被命名为克隆D(Clone D)。在有50μg/ml溴化乙锭存在下(M.Osterlund，H.Luthman，S.V.Nilsson and G.Magnusson(1982)，Ethidium-bromide-inhibited restriction end onucleasesCleave one strand of circular DNA，Gene，20，121-125)，克隆D用HindIII酶切，用琼脂糖凝胶分离并纯化7.9kb的线性片段。在线性克隆D中由HindIII产生的末端突出的4个碱基，根据Maniatis等方法在有四种单核苷酸存在时被Klenow酶补齐(T.Maniatis，E.F.Fritch and J.Sambrook，Mohecular Cloning a Caboratorgmanual，Clod Spring Harbor Laboratorg，ClodSpring Harbor，Ny，1982)，再连接并转入大肠杆菌，菌落用限制性酶酶切分析，得一阳性克隆命名为pDP193。
质粒pDP193用限制性酶SacI和EcoRI双酶切并脱磷酸。pDP352也用限制性酶SacI和EcoRI双酶切，用琼脂糖凝胶纯化1100bp的CAT基因。混合此两质粒，连结后被电转化到不含质粒的乳酸乳球菌菌株LMO230，以经霉素和氯霉素抗性来确定阳性菌落，再用限制性酶酶切确证。选择出阳性克隆，命名为pDP193-CAT352。
pDP193-CAT352用限制性酶SseI和BamHI酶切并脱磷酸。质粒pN42-SubCE也用SseI和BamHI(两位点来自接头)酶切，用琼脂糖凝胶纯化9.3kb片段。混合这两个片段，连结后被电转化在乳酸乳球菌LMO230中。用限制性酶酶切来筛选克隆，得一阳性克隆，命名为pDP359，如图7所示。
载体pDP359满足作为德氏乳杆菌保加利亚亚种的穿梭载体的要求，因为它能够在该宿主体内工作。它包含一个以德氏乳杆菌中分离并定性的完整的复制型质粒，加上一个在德氏乳杆菌保加利亚亚种启动子操纵下进行转录的氯霉素抗性基因。如此就能保证当被转入德氏乳杆菌保加利亚亚种体内时，上述质粒pDP359能够在其中复制。
               序列表关于序列SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征：
(A)长度：8140bp
(B)类型：核酸
(C)链式：双
(D )拓朴学：环状(ii)分子类型：DNA(质粒)(xi)特征：(vi)来源：保加利亚乳杆菌N42菌株
(A)名称/关键：质粒pN42
(B)定位：1～8140(XI)特征：
(A)名称/关键：复制起点
(B)定位：5694～5758(XI)特征：
(A)名称/关键：ORF1
(B)定位：1344～169(XI)特征：
(A)名称/关键：ORF2
(B)定位：5965～7806(XI)特征：
(A)名称/关键：ORF3
(B)定位：4718～5668(XI)特征：
(A)名称/关键：ORF4
(B)定位：3116～3637(XI)特征：
(A)名称/关键：ORF5
(B)定位：1779～2360CCTAGGCTTG   AAATTGACGC   ATAGGCGCAA   AGGGAGCGGG   CGACAGGGGG   TAAAGCACGA     60TAAATTCGTT   TTTTACAGAC   GTTCAGTCCA   TGTTGTCATA   TTTGTACTCC   CGTTTTTAGG    120GCTGTTTTAA   AAGTATTTTT   AGCGGCGATT   TGTTAATTAT   AGCCCCTATA   CAAACATCTT    180TTGTAAAAAG   CCTTTTTTCT   GTTCTTTCAA   CAAATCTAAC   TTACGTTGAT   GAAGAGCGAT    240AGTGTCATCT   AGCTGTTTTA   AAAATGAGCC   TATTTTTTTT   TGTTCTTCCT   GACTAGGTTT    300ATAGATTTTA   AATGATGAAA   ATTTAGAAAT   CCAATGACGT   TCATGACTTT   GAGGTACATA    360TTTTATATTC   TTCAATGTAT   TAAACATAAA   ATAGAAATTG   TCAGAATTAT   CATTCAAACT    420AAGTAATTTC   ATTGCGGAGC   TCTTAATTTT   AAAAGGGAAA   TCTACATAAT   GAGAGTCAGT    480TGTAAAATCA   TCAAATATAA   CAACTGGATT   TTCTACGGTA   GCATTTTTAA   TCCCGCTAAT    540TTCATCTGTA   TAGCCCAATA   AGAAACTCTT   GCCTGCTGTT   AAAACAGGGG   TATTAAAATT    600GTCATCGTAC   TCTGTAGATT   TGACAATATA   TTTTGTTGGT   TGCTCATAGT   TAAATACCTC    660CCCCAACTTA   CACTGCTCCC   ATTCGTCACT   AAATCCTTCA   AACCGAATAG   CTGGATACCC    720GCTCTTATAA   GCGAACATTT   TCTGCAGTAA   AGCGCTTTTT   AAGCATTTAA   GTTGCTGTTT    780CTTTTCCTCA   TGTAAAGTGA   TTGCAGTATC   CAATTCAGAG   AAGAAGTTAG   CAATTCTTTC    840TTGTTCAGAC   GTAGTTGGAA   ACGCAACAGA   CTGATTTCCG   ACAATATCCG   AGTTCAAATT    900AACCTGACTT   CCCGGCTGAC   CATATTTGTT   CCAATATGGT   TTGAACATAA   GAAGCCATTG    960AAACATAAAT   TCCTTATTAA   ATGTTGGGTT   GAGAAATATT   AAGAATCCAT   CGTGAACTCC   1020TGTGTTAACG   TAATTGATCA   CTGGACTACC   CACAGTAGCA   GCAATACTTA   ACAATAAATG   1080TGGTTCTGTG   ATAACACGCG   TTTTAGATTG   ACCAGCTTTT   GAAATGTGTT   GCGATAAGTG   1140ATGAATGCGT   CCTTTTTGTT   CAGTGACATC   GGATATTCTT   AGCCATCCAA   CATTTGAATT   1200ATCATCGAAC   CATTTGGGGT   TAGAAATAGG   TCTTGGACTC   GCTCCACGTA   CGATTTCCGC   1260TTTGTTTTTT   AACTTACACT   GCTCCCAAGG   ATCAGCGAAA   CCTTTAAATC   TTAATTGCGG   1320ATATTTAGCT   TGTGTATCAT   TCATTATTTT   TCCTCCGGTT   TAATGTCTAA   GGCCATTTTA   1380TCAAATTAAA   AATCAGCAAA   ACCTATTTTG   TGTCTGGTGG   AACCAACAAG   CGGCTAGAAA   1440ATATGCTGCC   AAACACCCTA   AAGAACAAAA   TATTGATAAC   GAGCATACTT   GGCATTAAAC  1500GCCGTATAAG   CTCATTTAAG   CCGTTTTAAG   TGTTATATGC   ATAATTATAT   TAAAACTGCT  1560TTAAAATCGC   TTAGAAGCAA   GAATAGGCAG   CTTGAGTGGC   TGAATTGGCG   ATGACTGAAC  1620TAAGGACTAG   GCCAAGAAAC   TTTTGCACAG   TCAACAATTC   CCCGGACTAA   TTCGGACTTT  1680TTCTTTCTGG   TCAGGTCTCC   TAATGGTCAG   TAAGGTCAGC   CGCTTCAGCG   GTCAATCGTG  1740TATAATAATA   ATCAAGATTG   ACAAGAGGAG   GGCTGACAAT   GGCAAATAGC   GCTGGCATGC  1800TGTCAGTAGG   TCAAATAGCT   AAAATGCTGA   AGACCAACAG   ACAGAACATT   TACAACGTGC  1860TTAAAGCTGA   GCATATTAAA   CCTGACGGCT   TCAATGACAA   GCACTATTCA   CTTTACAGCC  1920CGGAAACAAT   TCAAGAGATC   AAGGCCGCTC   TGTCTAAGAA   GGCAACGCTG   AGAAGTAAGA  1980AGGTAGTAGC   AAAAGAGCAG   GCTGAAGAGA   TAGCTGACTT   GAAGAATCAG   CTGTCAGAAC  2040AGCAGAGATT   GACAACCTGG   CTACAGTCTC   AGCTGGTTCA   ACTTCAAGTA   GAGGCTGACA  2100AGCTCAGGAG   TCAGAACAGC   CAGTTACAGC   TAGACAATGC   AAAGACTCAG   CTCCTTATTG  2160GCCAGGTTGA   CCAGGAGAAG   ACAACACTGA   AGGCCGAGAA   TGACCGACTG   AGCGCTGAAA  2220ATAACAAACT   AGGACAATTA   ACCGATAAGG   TGCTGAAGGA   CGCTCAGAGA   GCAGAAGAGG  2280ACGCTCAGAA   GGCTAAAGCT   GATCTAGATA   AAGCCCAAGC   CCGGCGGGCT   GGCTTATGGT  2340CTAGAATCAC   CAGGAATTAT   TAAGAGTGGT   ATAGCCGTTA   TCTGACTTTG   TGAAATTCCT  2400TATTGGCTCT   GTCAGATCAA   GCGATTTTAA   ACCTATACGA   GTTTGTGAAT   CCTAGTTTAC  2460GGAATTGGGC   GATAAGGAAG   CCCGTCATTG   CAAGGATACA   AGGTTAGTTC   CAATAAGACA  2520CATTATGTAA   AGTTGTAAGT   GGTATACCTG   TAATTGATTG   ACAGGAACTA   TACACGGGCT  2580AGACACTTGC   CAGCATTGAC   TGTAGCGGCT   TTACAATGAC   ACTAGATCTA   CACTATAATT  2640ACAGCGGAAA   GAGAAAGGCT   GAGCGGTCTC   CTAATGGACA   ACTACAACTG   GCCAGCCCGG  2700CAACTTTGAG   AGCCGTTAAA   GAGCTCTCTC   AGCATGGTTA   GAGTATAGAA   AGAGTGCTGA  2760ACATGGACTT   TAAAAAAGGG   CTGAAGGGCT   TGCAAGATCA   GCAGACCCGG   CTTGAAGCTA  2820AACAGGAAGT   ACTGTTAGAC   ATCATGGCTG   AGTTCTGGCC   TAAAGTAGCT   AAAGAAGGCA  2880ATGACGTTGC   TGAAGCGGTC   AAGGTAGAAG   ACCTGGCTGA   ATGGTTCGCT   AAGAACAGCC  2940GGAAAACTGT   TATTTGCGTG   TCAGCAAGAC   AGAAGACGGC   TATGACCTGG   CTTTTGAACC  3000ACAACAGCCT   TCAAGAGAAT   TGTTATGGTA   CGATGATCTT   TATTGGCGGC   TGGGTAAAAC  3060AGCTGACCAA   CTCAAAACGT   AAATCTAAGG   TCAAGACGCT   AGAGGAAATT   ATCTAATGGC  3120GGTTTACAAA   GAATGGACTG   ATTCAGATCA   TTTAGAGTTA   GTCAAAAATT   GGAAATTACA  3180CGGGCTGACT   AACGTTGAGA   TAGCTCAAAG   AATAGGCATT   GCTGAGAAGA   CTTTGTACGT  3240ATGGTTGAAG   AAGTCTCCTA   AGCTGAAGAA   GGCCATTAGA   GGCGGCAAGG   ATATTGCCAG  3300GGCTAGGGCT   GAGAATGCAC   TGTATGAGCT   TGCTCTTAAT   GGCGATAGGC   AAGCCCTTTT  3360CTTTTGGCTC   AAAAACAACT   ACAGAGAACG   CTACTCAGAC   AAGCCGTTAA   GCCCGGCTGA  3420AGCCGATTTG   ATGAGTCAGA   AGGCAAGGCT   GGCCAAATTA   CAGGCTGACC   TGGCTGAGGC  3480TCAGCTGAAG   GCCATTAAGG   AAGACCAGGG   AGACCAAGCA   ACGCAATTAA   ACAACCTGTT  3540AGACAGTCTG   AAGGAAGCCG   TGTTAGATGA   GGGAATTAGC   CCCGATAACA   TCGTTCCTAC  3600TGGCAACGGC   TTAATTATCG   ATGATATTCC   TGACTCTTAG   GTTTACACGA   CATTGACAGT  3660GTAAACACAA   GATAGCGGAA   AATCTTCTGA   TTATTATATT   TACAAGCACT   GTATATTGTG  3720CTATTCTAAG   ATGTGCTAAA   CGGATTTGGG   GAATGCAACT   AACTGCTGTA   AGGTATCAAC  3780TTTTTTTGTT   GCGCTCTTTA   ATTCTTTAGC   AAAAAGCTAG   ATATCAAAAA   AGAGCGAGAC  3840CGGGTATTGC   TTCACGGGTT   CGCTCTTATT   TTTTTATCTG   GCTAGTTGCC   TACTGGTACT  3900ATGCTGACAC   CCTAGCGGCA   TGTTTGCGGT   ATTGCACTAC   AGCGGCAACA   ATGGTAAAAA  3960TAATAATAGG   TAACAAAAAA   GCCTTTAGTA   CTGGCAATAC   TAGAGGCGGG   CTGTGTTTAG  4020CTCTGGCAAA   GCTTAACACG   GTTAGAATTA   TATTCCGTAC   CACATATGAT   ACGTTTAAAC  4080GTAACACTCT   GTCAAGGAGA   ACATATCACC   TTAAGGGTAC   ATATAGTAGT   TTTCTTCTAA  4140CATTATGTTG   TAAAAACATA   ACATTTTGTA   GACAAACACT   ATACTTCTAT   GACTCTAACC  4200ATGTTTAAGA   CAGGCCAGGC   TAACACCTAT   TGGCCTGTTT   TTTGTTGCCA   AAATTTCAAA  4260AGAAAGGCGG   TAACAGCCGT   GATTAAACAA   CAAAACATTG   ATGTTAGAGC   GGCTATTAAA  4320GCTTCTGGTC   TGAAGCAATA   TGAGGTAGCT   ACTTTGATGA   ATGTTTCAGC   TAGCTATCTC  4380AGCCAGCTTT   TACTTCAACC   ATTGTCAGAA   GGCCATAAGA   AGCGCATTAT   GGCGGCGATT  4440AAACAAGGCG   AGTCATTGAA   GGGAGAACAA   GAATAATGAT   GAGCTTAGAA   GAACGTGAGC  4500AAGAAATTGA   AAAGGTAGTA   CGCATTGCTG   AAGCTGACTT   CAACAACGCT   TGTCAATTGC  4560ATGCTATCAA   CAAGGAAGAT   GTTATTAAGA   ACCATGCTTA   CAAGTATGCT   GAAGTGCTGA  4620GGCTTCAGGA   ATTGCTGGCA   TTGAACAAGA   CCATTAGGGA   CGGTCTGAAC   GGCATTGAAA  4680TGTCAGTAGA   TCTCATTGAG   TAGCGGGGAG   ACCCGCCATG   AACAACAGTG   AAAAAAACTC  4740TCTAATGGCT   GAACCGTATA   ACTCAGACCG   CAACGCCATT   GACAGACTCA   GAATCAACCA  4800GAAGGCCTTA   CAGGCGGGCT   CTGTCAAGCG   TGAAGAGGGC   TACAACTCAG   AGGGCTTAGA  4860AATGGTCTCC   TACACGGCTT   ATAAGAGCGG   CATTCAGTAT   GTCATTTCTT   CAGAAGCTGA  4920AGGCGGCAAA   ATGGTTATTA   ACGAGACCTT   CAGCAAGGTT   CAACATCTAC   TAATTGCCAG  4980CTGGTATAGC   CAGCCAGACA   GAGCCAGCAA   TTTCAGAATA   CAGCTGACCT   TTAAAGAGAT  5040CTCAGAGGCG   CTAGGAGTCA   GCAGAAGCCA   GGCTACAGCG   CTCAGAAAGC   AGCTGAGAGA  5100GCTAATTACA   CAGCTAGTAC   GTTGTACTTT   TGTTAACAGC   AATAAAGACG   GCATAGACGC  5160TCTCAATCTC   TTTGCAGCTG   GCAACTACAG   TAAAGGGAAG   CTGACAATGT   GGTTAACTCC  5220TAACATGGCT   GAGCGGCTTC   TGTCAGAAGA   ATCATCTACG   GAATATTTTC   CGTTATCTTT  5280ACTGAAGCTG   AAAGGGACAG   CCTATTATTT   AGCCTTAAAG   GTCATGCACA   ACGCAAACAT  5340TAATGCACGC   TGGCATGCTG   ACAGAGTTGA   CAGATTGGGC   TTAGAAAACA   CGCTGAAGGC  5400CTTGCCTACA   CTCCCCGACC   CGGTAAAACT   CTCTAAAGGC   AACAGCAGAA   GCCTATACCT  5460AAAAATCTTA   ACTCCCCTGG   CTAAAGCTAT   TGAAGAGCTT   GAAGCCGTCA   CTGGCATTGT  5520CGTTAGACCT   AGCCAGCCAC   TAAAGGGAAT   GAAGACGAAA   GATCTGTCTA   AAGTCACTTT  5580GAATGTCATT   GATTGGGGAC   AGGTTGATAT   AGCCGAATTG   ACCAGAAATA   AGAGAAAACG  5640CTTGCGAAAA   AATAATGTTC   GTGAGGACTA   AAACTATATT   TGTCCTAATT   CGTATGTAGG  5700TAATTATGGT   CGCAAATGTA   GGTAATTATG   GTCGCAAATG   TAGGTAATTA   TGGTCGCATT  5760GTGAAATTTA   GGCAAGTGCC   TTGAGGCATT   GAGCCAGTAA   GGAGTAAGCG   CATTTTTTTA  5820AAAAGCTTCA   CTTGCTAATA   GTTTAATAGT   ATTAAAAGCA   ACGGCTCAGC   TTGACGCTGG  5880CCTTGCTTGA   AAATTGAAAA   AAGATGAAAC   AGCCAGGGAG   AGCAGAGGCT   TCTACTGGCC  5940TGTTTTTAGA   AGAAGGTATC   TAGCATGAAC   AATAACTTAG   TTAAACCAAC   AGATTTAAAG  6000GGCTTGGTCT   CTTTACCGGA   ATACATTGCC   AGCGTGGTTA   GCATGGACTC   TAAAGGCTTC  6060TTTAGCTGTC   TCAATCCGAA   CCACCCGGAC   AATCACCCTA   GCATGTGTTT   AGACCCTAAC  6120CACCCGCAAT   ATGTTCATTG   CTTCAGTTGC   GGCGTGTCCT   ATGATCTGTT   TGATTGTTGG  6180GCGCTGATTA   ATGACGGCGT   GACAGAGACC   AAGAAGAATA   GCGCTGGCAA   GGAAAAGCCA  6240GTCTATAACT   TCAATGCTGT   AGCTTCAGAG   ATTGCTGACC   ATTACGGCTA   TGCTCTTATT  6300GGCGACCCGG   CAAATGATCT   CTATTCGGTA   GAACCACCCT   TGCCAGAACC   ACCAGCAGAA  6360CCAGCTCAGA   CCAGCACCAA   TTTTAGAGAG   CAATTAGAAG   ATTGGCATGC   TAACTTGAAT  6420CAGACTGACT   ATCTTCAGAA   GCGGGGAATC   ACTCAGACAA   CAGCAGAGAT   TTTCAATTTA  6480GGCTACTCCC   CGTTGACCAA   CAGCATTATT   ATCCCTTACG   GTCAGGACGG   CTATTACGTT  6540CAGAGGGCGC   TGAATCCAAT   TGAGAAGCGT   GACCGCTACC   GCTTCCCTAT   TGGCCAGGCT  6600AGAGCCTACA   ACATTGAAGC   ATTGGCTAAA   TGCAAGACGG   TATTCATCGT   TGAAGGCCAG  6660TTTGACGCTC   TGTCAATCAT   GCAAGAATCC   GATGTAGGAG   CTGTAGCAAC   TTCAACCAGC  6720CAGACTCGGC   TTATTGTCAA   GGCCTTACAG   AAGTTCAAAG   AGCAAGACCC   AACAATTAAC  6780CCGACTATCA   TTCTCAGCAT   GGACAACGAC   AGAGCAGGCC   AGAAGGCGAA   TAGAGCCCTT  6840CAGAGGGACT   TAGAAGCCCT   GGGCTTTACT   TGCTATGTCA   ACCCGGTTAA   CGGCGACTAC  6900AAGGACGCTA   ACGAGTTCCT   GGTAAAGGAT   AGAGAGGGCT   TCAGACAGAA   ACTTCAGCAC  6960GTCATCAATC   AGCCCGACAA   TTGGCTTGAC   AATTACTATG   CTGACATCAA   AAAACGCCAT  7020GACTACCCGG   ACAATATCCC   TACTGGCTTC   AAGAATTTAG   ATGATGAGCT   TGACGGCGGT  7080CTTCAGCCTA   AACTGTATGT   TTTAGGCGCT   GTCAGTTCGC   TAGGGAAAAC   GACTTTTGCC  7140TTGAATATTG   CTGACAACCT   GGCTAAACAG   GGGAGACATG   TTTTCTTCTT   CAGCATGGAA  7200TCTAGCAAGA   GAGAAGTGAC   GGACAAGCTT   TTAAGCCGGG   CTAGCTGTCT   CTCTAACGGC  7260CATAAATGGA   CTCAGCTTCA   AGTCAGCCGG   GGAGAATGGT   TGAACAATGC   TGAGGACAAA  7320GAAGAGTTTG   ACGGCCTGTT   TAAAGCCTTC   AGCCGTTACC   AGCACTTCTT   ACATATCTAT  7380GACAATAGAG   TTAAGGCAAG   TCAGGTAAAA   GACCTGGTCA   ATAGTTGGCT   TGACAACCAC  7440CCGGACGAGA   AGAAGCCGCT   TGTAGTCGTT   GACTATCTTC   AGATCTTGCA   AGCTGAGCAG  7500GACAATGTGA   CAGATAAGGC   GAAAGTGACG   GACAGCGTGA   GTGTTCTCTC   AGAGCTGACT  7560AAACAGGCTG   AAGTCCCTGT   TCTGGTCATC   TCATCATTGA   ACCGGGCTTC   CTACTGGCAA  7620GACGTAAGTT   TTGAATCCTT   CAAGGAATCC   GGGGAAATTG   AGTACTCAGC   AGACGTTATG  7680TTAGGATTAG   AGTTCGCTCA   TCGTGAAGAA   TACATTACAG   TTAAGGGCAA   CGGCCATGTT  7740GAATTGAACA   AAGAGAAGTT   TGACCAGCGG   AAACAGGAAG   TCCTAGACGG   GTTGAAATGG  7800TCATTCTGAA   GAATCGAACT   GGCAAGACAG   GCGGTCATAT   CTTCTTCAAG   TACAACGCCA  7860TGTTTAACAG   CTACCAGGCA   TGCACTGAGC   AAGAGGCGGC   AATACCCAAT   AACTTTAATA  7920AGTTGTTTCA   TAGCAAGGAA   GTAGGCAAGC   CAATTGAAGC   GGCTGTGCGT   GATTACACGG  7980TAGACCCGGT   AACAGGCCTG   GCAACAGAGA   AGAAGCCCGA   TAAATAGAAC   TGAAGAAGCT  8040GGCCAGGAAT   GGCTGGCTTT   TGTTTTGCCT   TCAGACGCTC   TCAGAAGCTC   ATAGAGCCCC  8100TCTGAGCCTG   CATTGGTAGA   TTTTTCCGGC   CGAACACCCC                            8140关于序列SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征：
(A)长度：1202bp
(B)类型：核酸
(C)链式：双
(D)拓朴学：线性(ii)分子类型：DNA(合成的)(xi)特征：(vi)来源：保加利亚乳杆菌
(A)名称/关键：lacS启动子
(B)定位：1～239(ix)特征：(vi)来源：金黄色葡萄球菌
(A)名称/关键：氯霉素乙酰基转移酶肽
(B)定位：240～890(ix)特征：(vi)来源：乳酸乳球菌
(A)名称/关键：galT基因后的茎-环状终止子
(B)定位：903～1102GAATTCACCA   ACGCTTTCAT   TTCACGCCTC   CCGAAGTACA   TGCAAGAGGC   TATATCGCCA     60TCATTAGCAG   CTTAATTGAA   TATTTACTGG   CTAAACTATT   GAGTTTTCAA   GGCTTCATAG    120TTCTTTTTGG   TGTGGAAGTT   TAAATTACTA   AAAATATTTT   AGTAAAACAT   CTTGGTTTAT    180TTAGTAAACA   AGTCTATACT   GTAATTATAA   ACAAGTTAAC   ACACCTAAAG   GAGAATTTCA    240TGAACTTTAA   TAAAATTGAT   TTAGACAATT   GGAAGAGAAA   AGAGATATTT   AATCATTATT    300TGAACCAACA   AACGACTTTT   AGTATAACCA   CAGAAATTGA   TATTAGTGTT   TTATACCGAA    360ACATAAAACA   AGAAGGATAT   AAATTTTACC   CTGCATTTAT   TTTCTTAGTG   ACAAGGGTGA    420TAAACTCAAA   TACAGCTTTT   AGAACTGGTT   ACAATAGCGA   CGGAGAGTTA   GGTTATTGGG    480ATAAGTTAGA   GCCACTTTAT   ACAATTTTTG   ATGGTGTATC   TAAAACATTC   TCTGGTATTT    540GGACTCCTGT   AAAGAATGAC   TTCAAAGAGT   TTTATGATTT   ATACCTTTCT   GATGTAGAGA    600AATATAATGG   TTCGGGGAAA   TTGTTTCCCA   AAACACCTAT   ACCTGAAAAT   GCTTTTTCTC    660TTTCTATTAT   TCCATGGACT   TCATTTACTG   GGTTTAACTT   AAATATCAAT   AATAATAGTA    720ATTACCTTCT   ACCCATTATT   ACAGCAGGAA   AATTCATTAA   TAAAGGTAAT   TCAATATATT    780TACCGCTATC   TTTACAGGTA   CATCATTCTG   TTTGTGATGG   TTATCATGCA   GGATTGTTTA    840TGAACTCTAT   TCAGGAATTG   TCAGATAGGC   CTAATGACTG   GCTTTTATAA   TATGAGATAA    900TCGAAAAAAA   AAAGCTCAAA   TTTTTGAGCT   TTTTTTGTAT   GTAATTGTCA   TGCATCAAAA    960TGTAATGGTA   ATTGTGATAA   TTATTAATAA   AAAAATTGAT   ATAATGAAGT   GGATGAAAAA   1020AAGACAGTTA   AGAAGAAATA   AAAATAAATT   TAAAAGAGTA   TCACTAGCTT   TTTTTGGTTT   1080AGTGATTATT   TTAGCGGAGC   TC                                                  1102

Claims (6)

1.来源于德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii sp.)的质粒，其至少包含如图1所示的限制性酶谱或者如图1所示限制酶谱的编码所述质粒在德氏乳杆菌保加利亚亚种中复制所需反式和顺式元件的部分。
2.根据权利要求1的质粒，其至少包含DNA序列SEQ ID No.1和/或它的互补链或编码所述质粒在德氏乳杆菌保加利亚亚种中复制所需反式和顺式元件的部分。
3.含有权利要求1或2的质粒的重组载体，其含有至少一种在大肠杆菌和/或乳酸乳球菌体内能够复制的DNA序列，并且至少有一个选择标志。
4.被权利要求1或2的质粒或被权利要求3的重组载体转化的微生物。
5.被权利要求1或2的质粒或被权利要求3的重组载体转化的保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)。
6.转化微生物的方法，其包括向所述微生物中引入权利要求1或2的质粒或权利要求3的载体。
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