JPH07303486A - ラクトバチルス・デルブリュエキイ由来のプラスミド - Google Patents
ラクトバチルス・デルブリュエキイ由来のプラスミドInfo
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- JPH07303486A JPH07303486A JP6223934A JP22393494A JPH07303486A JP H07303486 A JPH07303486 A JP H07303486A JP 6223934 A JP6223934 A JP 6223934A JP 22393494 A JP22393494 A JP 22393494A JP H07303486 A JPH07303486 A JP H07303486A
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- Japan
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- plasmid
- restriction
- vector
- dna
- lactobacillus
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 少なくとも図１の制限地図又はその部分を含
むラクトバチルス・デルブリュエキイ由来のプラスミ
ド、並びに、前記のプラスミド、大腸菌及び／又はラク
トコッカス・ラクチス内での複製が可能な少なくとも１
つのＤＮＡ配列、そして少なくとも１つのマーカーを含
む組み換えベクターに関係する。 【効果】 本発明のラクトバチルス・デルブリュエキイ
由来の新しいプラスミドは、特定の微生物、特にラクト
バチルス・ブルガリカスの形質を転換するのに利用で
き、また、本発明の上記のプラスミドを含む組み換えベ
クターは、大腸菌とラクトコッカス・ラクチスの中での
複製が可能で、特定の微生物、特にラクトバチルス・ブ
ルガリカスを形質転換できる。
むラクトバチルス・デルブリュエキイ由来のプラスミ
ド、並びに、前記のプラスミド、大腸菌及び／又はラク
トコッカス・ラクチス内での複製が可能な少なくとも１
つのＤＮＡ配列、そして少なくとも１つのマーカーを含
む組み換えベクターに関係する。 【効果】 本発明のラクトバチルス・デルブリュエキイ
由来の新しいプラスミドは、特定の微生物、特にラクト
バチルス・ブルガリカスの形質を転換するのに利用で
き、また、本発明の上記のプラスミドを含む組み換えベ
クターは、大腸菌とラクトコッカス・ラクチスの中での
複製が可能で、特定の微生物、特にラクトバチルス・ブ
ルガリカスを形質転換できる。
Description
【０００１】
【０００２】本発明はラクトバチルス・デルブリュエキ
イ(Lactobacillus delbrueckii sp.)に由来する新しい
プラスミド、前記のプラスミドを含む組み換えベクタ
ー、前記のプラスミド及び／又はベクターにより形質転
換された微生物、そしてそのプラスミド及び／又はベク
ターの微生物の形質転換への利用に関係する。
イ(Lactobacillus delbrueckii sp.)に由来する新しい
プラスミド、前記のプラスミドを含む組み換えベクタ
ー、前記のプラスミド及び／又はベクターにより形質転
換された微生物、そしてそのプラスミド及び／又はベク
ターの微生物の形質転換への利用に関係する。
【０００３】
【０００４】生物の生物学的形質転換とは以下の３つの
基準を満たすものでなくてはならない。
基準を満たすものでなくてはならない。
【０００５】１．形質転換をもたらすＤＮＡは、電気的
形質転換、無機イオンによる処理、原形質融合などのよ
うな物理的あるいは化学的手法によって、生物の中に入
らなくてはならない。
形質転換、無機イオンによる処理、原形質融合などのよ
うな物理的あるいは化学的手法によって、生物の中に入
らなくてはならない。
【０００６】２．形質転換体は、例えば形質転換ＤＮＡ
と結合した抗生剤耐性遺伝子のような、１つ又は複数の
マーカーによって集団中の非形質転換細胞から選択され
なくてはならない。これを最もよく満足するのは問題の
標的宿主からある抗生剤に対する耐性遺伝子を分離する
方法と、既知の耐性遺伝子と標的宿主と適合した発現配
列（プロモーターとターミネーター）とを処理する方法
である。
と結合した抗生剤耐性遺伝子のような、１つ又は複数の
マーカーによって集団中の非形質転換細胞から選択され
なくてはならない。これを最もよく満足するのは問題の
標的宿主からある抗生剤に対する耐性遺伝子を分離する
方法と、既知の耐性遺伝子と標的宿主と適合した発現配
列（プロモーターとターミネーター）とを処理する方法
である。
【０００７】３．形質転換ＤＮＡは複製されなくてはな
らない（独立にあるいは宿主ゲノムの部分として）。こ
れを最もよく満足するのは、形質転換させるべき宿主か
ら複製するプラスミドを分離し、続いて大腸菌［Escher
ichia coli (E.coli)］やラクトコッカス・ラクチス［L
actococcus lactis (Lc.lactis)］などのような微生
物、あるいはラクトバチルス・デルブリュエキイ・ブル
ガリカス亜種［Lactobacillus delbrueckii subsp.bulg
aricus (L.bulgaricus)］などのような特定の標的生物
の中で複製することのできるベクターを作るという方法
である。
らない（独立にあるいは宿主ゲノムの部分として）。こ
れを最もよく満足するのは、形質転換させるべき宿主か
ら複製するプラスミドを分離し、続いて大腸菌［Escher
ichia coli (E.coli)］やラクトコッカス・ラクチス［L
actococcus lactis (Lc.lactis)］などのような微生
物、あるいはラクトバチルス・デルブリュエキイ・ブル
ガリカス亜種［Lactobacillus delbrueckii subsp.bulg
aricus (L.bulgaricus)］などのような特定の標的生物
の中で複製することのできるベクターを作るという方法
である。
【０００８】国際特許出願WO92/14825号にはラクトバチ
ルス・デルブリュエキイ・ブルガリカス亜種M-878菌株
から分離された約7.9kbの長さを持つプラスミドpBULIと
その誘導体について記載されている。
ルス・デルブリュエキイ・ブルガリカス亜種M-878菌株
から分離された約7.9kbの長さを持つプラスミドpBULIと
その誘導体について記載されている。
【０００９】このプラスミドの制限地図には酵素BamHI,
EcoRI, KpnIと PstIによる制限部位がないという特徴が
ある。
EcoRI, KpnIと PstIによる制限部位がないという特徴が
ある。
【００１０】このプラスミドは乳酸菌をはじめとする種
々の微生物を作るベクターとして用いられ、またこのプ
ラスミドの誘導体はシャトルベクター（乳酸菌−大腸
菌）として用いられている。
々の微生物を作るベクターとして用いられ、またこのプ
ラスミドの誘導体はシャトルベクター（乳酸菌−大腸
菌）として用いられている。
【００１１】他のシャトルベクターについては、Canadi
an Journal of Microbiology (vol.38(1992)pp69-74),A
CTA MICROBIOLOGICA BULGARICA (vol.27(1991)993-8)及
び日本特許出願JP-A-4.218.381に記載されている。
an Journal of Microbiology (vol.38(1992)pp69-74),A
CTA MICROBIOLOGICA BULGARICA (vol.27(1991)993-8)及
び日本特許出願JP-A-4.218.381に記載されている。
【００１２】
【００１３】本発明は、特定の微生物、特にラクトバチ
ルス・ブルガリカス(Lactobacillusbulgaricus)の形質
を転換するのに利用できるラクトバチルス・デルブリュ
エキイ由来の新しいプラスミドを供給することを目的と
する。
ルス・ブルガリカス(Lactobacillusbulgaricus)の形質
を転換するのに利用できるラクトバチルス・デルブリュ
エキイ由来の新しいプラスミドを供給することを目的と
する。
【００１４】本発明のもう一つの目的は、大腸菌とラク
トコッカス・ラクチスの中での複製が可能で、特定の微
生物、特にラクトバチルス・ブルガリカスを形質転換す
ることのできる上記のプラスミドを含む組み換えベクタ
ーを得ることである。
トコッカス・ラクチスの中での複製が可能で、特定の微
生物、特にラクトバチルス・ブルガリカスを形質転換す
ることのできる上記のプラスミドを含む組み換えベクタ
ーを得ることである。
【００１５】
【００１６】第１に、少なくとも図１に示した制限地図
又はその部分を含むラクトバチルス・デルブリュエキイ
由来のプラスミド。
又はその部分を含むラクトバチルス・デルブリュエキイ
由来のプラスミド。
【００１７】第２に、少なくともＤＮＡ配列番号(SEQ I
D No.)１及び／又はその相補的配列、あるいはその部分
を含む上記第１に記載のプラスミド。
D No.)１及び／又はその相補的配列、あるいはその部分
を含む上記第１に記載のプラスミド。
【００１８】第３に、上記第１又は２に記載のプラスミ
ド、大腸菌及び／又はラクトコッカス・ラクチス内での
複製が可能な少なくとも１つのＤＮＡ配列、そして少な
くとも１つのマーカーを含む組み替えベクター。
ド、大腸菌及び／又はラクトコッカス・ラクチス内での
複製が可能な少なくとも１つのＤＮＡ配列、そして少な
くとも１つのマーカーを含む組み替えベクター。
【００１９】第４に、上記第１又は２に記載のプラスミ
ド、及び／又は第３に記載の組み換えベクターによって
形質転換された微生物。
ド、及び／又は第３に記載の組み換えベクターによって
形質転換された微生物。
【００２０】第５に、上記第1又は２に記載のプラスミ
ド、及び／又は第３に記載の組み換えベクターによって
形質転換された、ラクトバチルス・ブルガリカス。
ド、及び／又は第３に記載の組み換えベクターによって
形質転換された、ラクトバチルス・ブルガリカス。
【００２１】第６に、上記第１又は２に記載のプラスミ
ド、及び／又は第３に記載のベクターの微生物の形質転
換への利用。
ド、及び／又は第３に記載のベクターの微生物の形質転
換への利用。
【００２２】本発明は少なくとも図１の制限地図あるい
は、その部分（単／複）を含む、ラクトバチルス・デル
ブリュエキイに由来した新しいプラスミドに関係する。
は、その部分（単／複）を含む、ラクトバチルス・デル
ブリュエキイに由来した新しいプラスミドに関係する。
【００２３】本発明によるプラスミドは少なくともＤＮ
Ａ配列番号1及び／又は、その相補的配列、あるいはそ
の部分（単／複）を包含する。
Ａ配列番号1及び／又は、その相補的配列、あるいはそ
の部分（単／複）を包含する。
【００２４】更に本発明は、本発明によるプラスミド、
大腸菌及び／又はラクトコッカス・ラクチス内において
複製可能な少なくとも１つのＤＮＡ配列、そして少なく
とも１つのマーカーを含む、組み換えベクターに関係す
る。
大腸菌及び／又はラクトコッカス・ラクチス内において
複製可能な少なくとも１つのＤＮＡ配列、そして少なく
とも１つのマーカーを含む、組み換えベクターに関係す
る。
【００２５】大腸菌及び／又はラクトコッカス・ラクチ
ス内で複製できるＤＮＡ配列は、例えばpDP193のような
特定のプラスミドによって構成され、それは分子操作の
ために組み換えベクターが、大腸菌又はラクトコッカス
・ラクチス内で自由に培養されることを可能にする。
ス内で複製できるＤＮＡ配列は、例えばpDP193のような
特定のプラスミドによって構成され、それは分子操作の
ために組み換えベクターが、大腸菌又はラクトコッカス
・ラクチス内で自由に培養されることを可能にする。
【００２６】本発明による組み換えベクターが含むマー
カーは、分析を行う際の参照として用いられるＤＮＡ断
片（すなわち、表現型と地図上の位置が既知の遺伝子）
及び／又は本発明によるベクターによって形質転換され
た微生物内で発現するＤＮＡ断片である。
カーは、分析を行う際の参照として用いられるＤＮＡ断
片（すなわち、表現型と地図上の位置が既知の遺伝子）
及び／又は本発明によるベクターによって形質転換され
た微生物内で発現するＤＮＡ断片である。
【００２７】このＤＮＡ断片はまた、例えば以下に示す
ものを得るための微生物の形質転換に利用され得る。
ものを得るための微生物の形質転換に利用され得る。
【００２８】−ファージに対する耐性菌株 −粘着性の菌株(ropy strains)（組織特性の改善） −プロバイオテック菌株(probiotec strains) −新しい又は改良された酵素（リパーゼ、デヒドロゲナ
ーゼなど）、芳香剤、あるいは香料を生産する菌株
ーゼなど）、芳香剤、あるいは香料を生産する菌株
【００２９】本発明はまた、本発明によるプラスミド及
び／又は組み換えベクターによって形質転換された微生
物、特にラクトバチルス・ブルガリカスに関する。
び／又は組み換えベクターによって形質転換された微生
物、特にラクトバチルス・ブルガリカスに関する。
【００３０】最後に本発明は、本発明によるプラスミド
及び／又はベクターの微生物の形質転換への利用に関す
る。
及び／又はベクターの微生物の形質転換への利用に関す
る。
【００３１】
【００３２】図１は、本発明によるラクトバチルス・デ
ルブリュエキイのプラスミドpN42の制限地図を示す。図
２は、プラスミドpJDC9とプラスミドpN42からのプラス
ミドpN42-Sub CBの構成を示す。図３は、プラスミドpJD
C9とプラスミドpN42からのpN42-Sub CEの構成を示す。
図４は、プラスミドpUC19とプラスミドpN42からのｐN42
-Sub WとｐN42-Sub Xの構成を示す。図５は、pDP352の
クロラムフェニコール・トランスアセチラーゼ遺伝子の
構成を示す。図６は、プラスミドpDP193の構成を示す。
図７は、プラスミドpDP359の構成を示す。
ルブリュエキイのプラスミドpN42の制限地図を示す。図
２は、プラスミドpJDC9とプラスミドpN42からのプラス
ミドpN42-Sub CBの構成を示す。図３は、プラスミドpJD
C9とプラスミドpN42からのpN42-Sub CEの構成を示す。
図４は、プラスミドpUC19とプラスミドpN42からのｐN42
-Sub WとｐN42-Sub Xの構成を示す。図５は、pDP352の
クロラムフェニコール・トランスアセチラーゼ遺伝子の
構成を示す。図６は、プラスミドpDP193の構成を示す。
図７は、プラスミドpDP359の構成を示す。
【００３３】本発明による大腸菌／ラクトコッカス・ラ
クチス−ラクトバチルス・デルブリュエキイ シャトル
ベクターであるpDP359の構成は、以下の特徴をもつ。
クチス−ラクトバチルス・デルブリュエキイ シャトル
ベクターであるpDP359の構成は、以下の特徴をもつ。
【００３４】まず、pDP193が合体することによって、ラ
クトバチルス・ブルガリカスに発現されるべき遺伝子の
付加などのような分子操作を行うために、プラスミドを
大腸菌又はラクトコッカス・ラクチスの中で自由に培養
させることが可能である。第２に本物のラクトバチルス
・デルブリュエキイ プラスミドが完全に封入されてい
るということは、pDP359がpN42の複製に必要な全ての配
列を含んでいること、したがってpDP359はpN42がその宿
主N42内で複製するのと同じようにラクトバチルス・ブ
ルガリカス内で複製するはずであることを保証する。第
３にpDP352内で処理したクロラムフェニコール耐性遺伝
子を包含するということは、ラクトバチルス・ブルガリ
カスの中から形質転換体を選択する手段を保証する。
クトバチルス・ブルガリカスに発現されるべき遺伝子の
付加などのような分子操作を行うために、プラスミドを
大腸菌又はラクトコッカス・ラクチスの中で自由に培養
させることが可能である。第２に本物のラクトバチルス
・デルブリュエキイ プラスミドが完全に封入されてい
るということは、pDP359がpN42の複製に必要な全ての配
列を含んでいること、したがってpDP359はpN42がその宿
主N42内で複製するのと同じようにラクトバチルス・ブ
ルガリカス内で複製するはずであることを保証する。第
３にpDP352内で処理したクロラムフェニコール耐性遺伝
子を包含するということは、ラクトバチルス・ブルガリ
カスの中から形質転換体を選択する手段を保証する。
【００３５】ネッスルの培養コレクションの５０株を超
すラクトバチルス・デルブリュエキイ菌株の分析によ
り、染色体外複製プラスミドを含有するＮ42が１株確認
された。これはpN42と呼ばれ（制限地図は図１に示
す）、ラクトバチルス・ブルガリカス内での複製に必要
なトランス(trans)及びシス(cis)分子をコードした全て
のプラスミドを含んでいるに相違ないことから、分析に
選ばれた。N42のラクトバチルス・デルブリュエキイ種
としての完全性は、APIテストとラクトバチルス・デル
ブリュエキイ特異的プローブとのハイブリッド形成とい
う分子的特徴により確かめられている（Delley M., Mol
let B.,及びHottinger H.,1990,ＤＮＡ probe for Lact
obacillus delbrueckii, Appl. Environ. Microbiol,5
6:1967-1970)。
すラクトバチルス・デルブリュエキイ菌株の分析によ
り、染色体外複製プラスミドを含有するＮ42が１株確認
された。これはpN42と呼ばれ（制限地図は図１に示
す）、ラクトバチルス・ブルガリカス内での複製に必要
なトランス(trans)及びシス(cis)分子をコードした全て
のプラスミドを含んでいるに相違ないことから、分析に
選ばれた。N42のラクトバチルス・デルブリュエキイ種
としての完全性は、APIテストとラクトバチルス・デル
ブリュエキイ特異的プローブとのハイブリッド形成とい
う分子的特徴により確かめられている（Delley M., Mol
let B.,及びHottinger H.,1990,ＤＮＡ probe for Lact
obacillus delbrueckii, Appl. Environ. Microbiol,5
6:1967-1970)。
【００３６】pN42プラスミドＤＮＡは、制限地図作成と
サブクローニングのためセシウム・クロライド−エチジ
ウム・ブロマイド浮揚性濃度勾配によって分離される。
プラスミドpN42は、いくつかの固有の制限部位PstI(pN4
2-Sub CB),AvrII(pN42-Sub CE)で大腸菌ベクターである
pJDC9内に（J.-D.Chen and D.A.Morrisson 1987,Clonin
g of Streptococcus pneumoniae DNA Fragments in Esc
herichia coliRequires Vector Protected by Strong T
ransciptional Terminators, Gene 55,179-187)、ある
いはＤＮＡ配列分析用のpUC/pKプラスミド内に全部クロ
ーニングされる。
サブクローニングのためセシウム・クロライド−エチジ
ウム・ブロマイド浮揚性濃度勾配によって分離される。
プラスミドpN42は、いくつかの固有の制限部位PstI(pN4
2-Sub CB),AvrII(pN42-Sub CE)で大腸菌ベクターである
pJDC9内に（J.-D.Chen and D.A.Morrisson 1987,Clonin
g of Streptococcus pneumoniae DNA Fragments in Esc
herichia coliRequires Vector Protected by Strong T
ransciptional Terminators, Gene 55,179-187)、ある
いはＤＮＡ配列分析用のpUC/pKプラスミド内に全部クロ
ーニングされる。
【００３７】pN42プラスミドＤＮＡは、制限酵素PstIで
処理され、PstI処理及び脱リン酸化を行ったpJDC9ベク
ターと混合、結合したのちに大腸菌内に形質転換され
る。コロニーは制限酵素処理で分析され、陽性クローン
はpN42-Sub CB(図2)と呼ばれる。
処理され、PstI処理及び脱リン酸化を行ったpJDC9ベク
ターと混合、結合したのちに大腸菌内に形質転換され
る。コロニーは制限酵素処理で分析され、陽性クローン
はpN42-Sub CB(図2)と呼ばれる。
【００３８】pN42プラスミドＤＮＡは、制限酵素Avr II
で処理され、XbaI処理及び脱リン酸化を行ったpJDC9ベ
クターと混合し、結合したのちに大腸菌内に形質転換さ
れる。コロニーは制限酵素処理によって分析され、陽性
クローンはpN42-Sub CE(図３）と呼ばれる。
で処理され、XbaI処理及び脱リン酸化を行ったpJDC9ベ
クターと混合し、結合したのちに大腸菌内に形質転換さ
れる。コロニーは制限酵素処理によって分析され、陽性
クローンはpN42-Sub CE(図３）と呼ばれる。
【００３９】プラスミドpN42-Sub CBは制限酵素EcoRVお
よびPstIで処理され、アガロースゲル上で、精製された
3.1kbと5.1kb断片のＤＮＡ断片に分離される。これら２
つの断片は、PstIとSmaIによる処理及び脱リン酸化を行
ったｐUC19ベクターと混合、結合したのちに大腸菌内に
転換される。コロニーは制限酵素処理により分析され、
陽性クローンはpN42-Sub WとpN42-Sub X（図４)(それぞ
れ5.1kbと3.1kbの断片に対応）と呼ばれる。
よびPstIで処理され、アガロースゲル上で、精製された
3.1kbと5.1kb断片のＤＮＡ断片に分離される。これら２
つの断片は、PstIとSmaIによる処理及び脱リン酸化を行
ったｐUC19ベクターと混合、結合したのちに大腸菌内に
転換される。コロニーは制限酵素処理により分析され、
陽性クローンはpN42-Sub WとpN42-Sub X（図４)(それぞ
れ5.1kbと3.1kbの断片に対応）と呼ばれる。
【００４０】pN42の完全なＤＮＡ配列は、Pharｍaciaの
T7 sequencing （登録商標） キットと 35 SdATPを用
いたジデオキシ鎖末端反応による合成オリゴヌクレオチ
ドプライマーを二本鎖の両方につけたサブクローンから
決定される。pN42は8140塩基対の環状二本鎖プラスミド
であり、GCGの”Frames"というコンピュータプログラム
で識別される（コンピュータのソフトウェアはGenetics
Computer Group Inc.(GCG)のものである、Devereux
J., Haeberli P. and SmithiesO.(1984), A comprehens
ive set of sequence analysis programs for the VAX.
Nucleic Acids Res. 12: 387-395)50個かそれ以上のア
ミノ酸から成るオープンな読み枠を少なくとも五個（OR
F1からORF5と呼ぶ）を持つものとから成る。GCGのプロ
グラム"Repeat"は21塩基対が３回直接繰り返しているの
を認識し、これは複製の開始点である可能性がある。pN
42の制限地図は図１に、また完全なＤＮＡ配列は配列表
の配列番号１に掲げられている。
T7 sequencing （登録商標） キットと 35 SdATPを用
いたジデオキシ鎖末端反応による合成オリゴヌクレオチ
ドプライマーを二本鎖の両方につけたサブクローンから
決定される。pN42は8140塩基対の環状二本鎖プラスミド
であり、GCGの”Frames"というコンピュータプログラム
で識別される（コンピュータのソフトウェアはGenetics
Computer Group Inc.(GCG)のものである、Devereux
J., Haeberli P. and SmithiesO.(1984), A comprehens
ive set of sequence analysis programs for the VAX.
Nucleic Acids Res. 12: 387-395)50個かそれ以上のア
ミノ酸から成るオープンな読み枠を少なくとも五個（OR
F1からORF5と呼ぶ）を持つものとから成る。GCGのプロ
グラム"Repeat"は21塩基対が３回直接繰り返しているの
を認識し、これは複製の開始点である可能性がある。pN
42の制限地図は図１に、また完全なＤＮＡ配列は配列表
の配列番号１に掲げられている。
【００４１】pN42のＤＮＡ配列分析により、プラスミド
のラクトバチルス・デルブリュエキイ内での複製とこれ
ら全ての特徴を備えるシャトルベクターの構成とにおい
て重要であるかもしれない構造的特徴を定義することが
可能になる（遺伝子の導入はpN42を以下の制限部位Avr
II, NsiI, SphIで処理しクローニングするか、あるいは
ラクトバチルス・デルブリュエキイから分離したNbプラ
スミドＤＮＡの5箇所のSphI部位の１つ、即ち第7882塩
基対で処理することによって得られるだろう）。
のラクトバチルス・デルブリュエキイ内での複製とこれ
ら全ての特徴を備えるシャトルベクターの構成とにおい
て重要であるかもしれない構造的特徴を定義することが
可能になる（遺伝子の導入はpN42を以下の制限部位Avr
II, NsiI, SphIで処理しクローニングするか、あるいは
ラクトバチルス・デルブリュエキイから分離したNbプラ
スミドＤＮＡの5箇所のSphI部位の１つ、即ち第7882塩
基対で処理することによって得られるだろう）。
【００４２】これによって、前記のシャトルベクターを
ラクトバチルス・ブルガリカスに形質転換したとき、そ
れが複製されることが確かめられる。
ラクトバチルス・ブルガリカスに形質転換したとき、そ
れが複製されることが確かめられる。
【００４３】明かな耐性遺伝子によって与えられる抗生
剤耐性は、適切な翻訳／転写制御信号をもつ生物ならば
何にでも移し変えることができるであろうと判断されて
いる。従って、明らかなグラム陽性クロラムフェニコー
ル耐性遺伝子（元来はStaphylococcus aureusに由来す
るクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ,C
AT）は、広域宿主プラスミドpNZ12から採取されており
（W.M. de Vos, 1987, Gene Cloning and Expression i
n Lactic Streptococci, FEMS Microbiol. Reviews, 4
6, 281-295)、lacS-Zオペロンから本物のラクトバチル
ス・ブルガリカスのプロモーターを加工するのに利用さ
れている（P. Leong-Morgenthaler, M,C, Zwahlen and
H. Hottinger, 1991, Lactose Metabolism in Lactobac
illus bulgaricus: Analysis of the Primary Structur
e and Expression of the Genes Involved, J. Bacteri
ol., 173, 1951-1957)。この遺伝子のすぐ下流に、ラク
トコッカス・ラクチス のNCDO2054株のラクトース−ガ
ラクトース オペロンからのグラム陽性ステム−ループ
ターミネーターがある。その完全な構成は図５に示され
ている。
剤耐性は、適切な翻訳／転写制御信号をもつ生物ならば
何にでも移し変えることができるであろうと判断されて
いる。従って、明らかなグラム陽性クロラムフェニコー
ル耐性遺伝子（元来はStaphylococcus aureusに由来す
るクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ,C
AT）は、広域宿主プラスミドpNZ12から採取されており
（W.M. de Vos, 1987, Gene Cloning and Expression i
n Lactic Streptococci, FEMS Microbiol. Reviews, 4
6, 281-295)、lacS-Zオペロンから本物のラクトバチル
ス・ブルガリカスのプロモーターを加工するのに利用さ
れている（P. Leong-Morgenthaler, M,C, Zwahlen and
H. Hottinger, 1991, Lactose Metabolism in Lactobac
illus bulgaricus: Analysis of the Primary Structur
e and Expression of the Genes Involved, J. Bacteri
ol., 173, 1951-1957)。この遺伝子のすぐ下流に、ラク
トコッカス・ラクチス のNCDO2054株のラクトース−ガ
ラクトース オペロンからのグラム陽性ステム−ループ
ターミネーターがある。その完全な構成は図５に示され
ている。
【００４４】プラスミドpKN19は、大腸菌クローニング
ベクターpK19であり（R.D. Pridmore, 1987, New and V
ersatile Cloning Vectors with Kanamycin-Resistanc
e, Gene, 56, 309-312), Maniatis et al.によると非本
質的領域における唯一のBspHI制限部位が制限酵素で処
理され、突き出した４塩基はKlenow酵素と４つのヌクレ
オチドによって修復される（T. Maniatis, E.F. Fritch
and J. Sambrook, Molecular cloning a laboratory m
anual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY, 1982)。pNZ12からのクロラムフェニコール
耐性遺伝子は、共に突然変異誘導プライマーある、CAT
遺伝子のATG開始コドンに重なるBspHI制限部位を導入す
るプライマーA (5'-AGGAGGATCCTCTCATGAACTTTAATAAAATT
G)と、CAT遺伝子の9塩基対下流にClaI制限部位を導入す
るプライマーB (5'-TACAGTATCGATTATCTCATATTATA)を利
用したPCR増幅法により抽出される（Saiki R.K., Gelfa
nd D.H., Stoffel S., Scharf S.J.,Higuchi R., Horn
G.T., Mullis K.B., and Ehrlich H.A., 1988, Primer-
directed enzymatic amplification of DNA with a the
rmostable DNA polymerase. Science, 239: 487-491; S
aiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Hor
n G.T., Ehrlich H.A. and Arnheim N., 1985, Enzymat
ic amplification of β-globin genomic sequences an
d restriction site analysis for diagnosis of sickl
e cell anemia, Science 230: 1350-1354)。このPCR増
幅は、BglII処理pNZ12DNAを50ngにオリゴヌクレオチドC
とDを各0.3μM,４種のヌクレオチドを200μM加えて行わ
れ、94℃で0.5分間、50℃で0.5分間、72℃で0.5分間のP
CRサイクルを合計３０サイクル繰り返す。
ベクターpK19であり（R.D. Pridmore, 1987, New and V
ersatile Cloning Vectors with Kanamycin-Resistanc
e, Gene, 56, 309-312), Maniatis et al.によると非本
質的領域における唯一のBspHI制限部位が制限酵素で処
理され、突き出した４塩基はKlenow酵素と４つのヌクレ
オチドによって修復される（T. Maniatis, E.F. Fritch
and J. Sambrook, Molecular cloning a laboratory m
anual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY, 1982)。pNZ12からのクロラムフェニコール
耐性遺伝子は、共に突然変異誘導プライマーある、CAT
遺伝子のATG開始コドンに重なるBspHI制限部位を導入す
るプライマーA (5'-AGGAGGATCCTCTCATGAACTTTAATAAAATT
G)と、CAT遺伝子の9塩基対下流にClaI制限部位を導入す
るプライマーB (5'-TACAGTATCGATTATCTCATATTATA)を利
用したPCR増幅法により抽出される（Saiki R.K., Gelfa
nd D.H., Stoffel S., Scharf S.J.,Higuchi R., Horn
G.T., Mullis K.B., and Ehrlich H.A., 1988, Primer-
directed enzymatic amplification of DNA with a the
rmostable DNA polymerase. Science, 239: 487-491; S
aiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Hor
n G.T., Ehrlich H.A. and Arnheim N., 1985, Enzymat
ic amplification of β-globin genomic sequences an
d restriction site analysis for diagnosis of sickl
e cell anemia, Science 230: 1350-1354)。このPCR増
幅は、BglII処理pNZ12DNAを50ngにオリゴヌクレオチドC
とDを各0.3μM,４種のヌクレオチドを200μM加えて行わ
れ、94℃で0.5分間、50℃で0.5分間、72℃で0.5分間のP
CRサイクルを合計３０サイクル繰り返す。
【００４５】その産物は、制限酵素ClaIとBamHIとアガ
ロースゲルから精製された660塩基対の断片と共に処理
され、またClaI, BamHIで処理、脱リン酸された大腸菌
ベクターpBS KS+ （登録商標）(Stratagene Corp.)にク
ローニングされる。つながれた断片は、大腸菌に転換さ
れ、アンピシリン、5-ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−（3-D-ガラクトピラノシド）(X-Gal)およびイソ
プロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を加
えたLBプレート上に撤かれる。クローンは、制限酵素処
理によってスクリーニングされ、選択された陽性クロー
ンをクローンAと呼ぶ。これは、クロラムフェニコール
とアンピシリン両方に耐性である。クローンAは、制限
酵素MfeI,StuIにより処理、脱リン酸化される。この断
片は、pNZ12に由来する等量のCAT MfeI−StuI断片で置
換される。これは、PCRに誘導されクローンBを生じるCA
T遺伝子の突然変異を全部排除するために行うものであ
る（この段階は図5には示されていない）。
ロースゲルから精製された660塩基対の断片と共に処理
され、またClaI, BamHIで処理、脱リン酸された大腸菌
ベクターpBS KS+ （登録商標）(Stratagene Corp.)にク
ローニングされる。つながれた断片は、大腸菌に転換さ
れ、アンピシリン、5-ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−（3-D-ガラクトピラノシド）(X-Gal)およびイソ
プロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を加
えたLBプレート上に撤かれる。クローンは、制限酵素処
理によってスクリーニングされ、選択された陽性クロー
ンをクローンAと呼ぶ。これは、クロラムフェニコール
とアンピシリン両方に耐性である。クローンAは、制限
酵素MfeI,StuIにより処理、脱リン酸化される。この断
片は、pNZ12に由来する等量のCAT MfeI−StuI断片で置
換される。これは、PCRに誘導されクローンBを生じるCA
T遺伝子の突然変異を全部排除するために行うものであ
る（この段階は図5には示されていない）。
【００４６】クローンBは、制限酵素BamHIとClaIで処理
され、660塩基対の断片がアガロースゲルから精製され
る。pKN19/galT-termは、ラクトコッカス・ラクチス NC
DO2054ラクトース−ガラクトース オペロンターミネー
ターを含むpKN19でありSpeI-SacI制限断片として存在
し、その内部のBspHI制限部位は上述のように破壊され
ている。pKN19/galT-termは、制限酵素SfuIとSacI（そ
れらの制限部位は断片にもともと存在する）とアガロー
スゲルから精製された１９０塩基対の断片と共に処理さ
れる。これら２つの断片は、ベクターpKN19と混合、制
限酵素SacI,BamHI処理および脱リン酸化、互いに結合さ
せたのちに大腸菌に形質転換される。クローンは、制限
酵素処理によりスクリーニングされ、陽性クローンを選
び、クローンＣと呼ぶ。
され、660塩基対の断片がアガロースゲルから精製され
る。pKN19/galT-termは、ラクトコッカス・ラクチス NC
DO2054ラクトース−ガラクトース オペロンターミネー
ターを含むpKN19でありSpeI-SacI制限断片として存在
し、その内部のBspHI制限部位は上述のように破壊され
ている。pKN19/galT-termは、制限酵素SfuIとSacI（そ
れらの制限部位は断片にもともと存在する）とアガロー
スゲルから精製された１９０塩基対の断片と共に処理さ
れる。これら２つの断片は、ベクターpKN19と混合、制
限酵素SacI,BamHI処理および脱リン酸化、互いに結合さ
せたのちに大腸菌に形質転換される。クローンは、制限
酵素処理によりスクリーニングされ、陽性クローンを選
び、クローンＣと呼ぶ。
【００４７】発表されているラクトバチルス・ブルガリ
カス lacSプロモーターは、２つの突然変異誘導オリゴ
ヌクレオチド、すなわちATG開始コドンの240塩基対上流
にEcoRI制限部位を導入するオリゴヌクレオチドC (5'-A
TTGGAAGAATTCACCAACGCTTTTCATTTC)と、開始コドンと重
なったBspHI制限部位を生来含有するlacS遺伝子のATGの
110塩基対下流でプライマーとなるオリゴヌクレオチドD
(5'-GGTGGTGACGAAGACGATA)を作るために用いられる。
このPCR増幅は、ラクトバチルス・デルブリュエキイの
ゲノムＤＮＡ100ngにオリゴヌクレオチドCとDを各0.3μ
M、4種のヌクレオチドを200μM加えて行われ、94℃で0.
5分間、50℃で0.5分間、72℃で5分間のPCRサイクルを合
計30サイクル繰り返す。そのPCR産物は、制限酵素EcoRI
とBspHIで処理され、アガロースゲルから250塩基対の断
片が精製される。クローンDは、制限酵素BspHIとSacIで
処理され、アガロースゲルから780塩基対の断片が精製
される。これら2つの断片は、EcoRI, SacI 処理および
脱リン酸化をうけたpKN19ベクターと結合され、大腸菌
に転換されたのち、カナマイシンを加えたLBプレートに
撤かれる。クローンは、制限酵素処理によってスクリー
ニングされ、選択された陽性クローンをpDP352と呼び、
その完全なＤＮＡ配列は配列表の配列番号２に掲げられ
ている。
カス lacSプロモーターは、２つの突然変異誘導オリゴ
ヌクレオチド、すなわちATG開始コドンの240塩基対上流
にEcoRI制限部位を導入するオリゴヌクレオチドC (5'-A
TTGGAAGAATTCACCAACGCTTTTCATTTC)と、開始コドンと重
なったBspHI制限部位を生来含有するlacS遺伝子のATGの
110塩基対下流でプライマーとなるオリゴヌクレオチドD
(5'-GGTGGTGACGAAGACGATA)を作るために用いられる。
このPCR増幅は、ラクトバチルス・デルブリュエキイの
ゲノムＤＮＡ100ngにオリゴヌクレオチドCとDを各0.3μ
M、4種のヌクレオチドを200μM加えて行われ、94℃で0.
5分間、50℃で0.5分間、72℃で5分間のPCRサイクルを合
計30サイクル繰り返す。そのPCR産物は、制限酵素EcoRI
とBspHIで処理され、アガロースゲルから250塩基対の断
片が精製される。クローンDは、制限酵素BspHIとSacIで
処理され、アガロースゲルから780塩基対の断片が精製
される。これら2つの断片は、EcoRI, SacI 処理および
脱リン酸化をうけたpKN19ベクターと結合され、大腸菌
に転換されたのち、カナマイシンを加えたLBプレートに
撤かれる。クローンは、制限酵素処理によってスクリー
ニングされ、選択された陽性クローンをpDP352と呼び、
その完全なＤＮＡ配列は配列表の配列番号２に掲げられ
ている。
【００４８】pDP352に組み入れられたクロラムフェニコ
ール耐性遺伝子は、本物のラクトバチルス・ブルガリカ
ス プロモーターから転写され、この宿主内では構成成
分として発現している。これは−35,−10領域の元来の
プロモーター要素をもち、リボゾームの結合部位のクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子のATGに対する相対的位置
にもとのlacS遺伝子のATGに対するそれと全く同じであ
る。このことは、クロラムフェニコール耐性遺伝子が正
しく転写し、翻訳が正しい位置から開始すること、ひい
ては耐性遺伝子が機能することを保証する。
ール耐性遺伝子は、本物のラクトバチルス・ブルガリカ
ス プロモーターから転写され、この宿主内では構成成
分として発現している。これは−35,−10領域の元来の
プロモーター要素をもち、リボゾームの結合部位のクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子のATGに対する相対的位置
にもとのlacS遺伝子のATGに対するそれと全く同じであ
る。このことは、クロラムフェニコール耐性遺伝子が正
しく転写し、翻訳が正しい位置から開始すること、ひい
ては耐性遺伝子が機能することを保証する。
【００４９】大腸菌-ラクトコッカス・ラクチス シャ
トルベクターpDP193は、大腸菌ベクターpUC18（R.D. Pr
idmore, 1987, New and Versatile Cloning Vectors wi
th Kanamycin-Resistance, Gene, 56, 309-312)とプラ
スミドpVA749（F.L. Macrina,J.Ａ. Tobian, K.R. Jone
s and R.P. Evans, Molecular cloning in the Strepto
cocci, in A. Hallaender, R. DeMoss, S. Kaplan, S.
Konisky, D. Savage and R. Wolve (Eds.), Genetic en
gineering of microorganisms for chemicals,Plenum,
New York,1982, pp.195-210)から作られる。pVA749はキ
メラプラスミドpVA838よりHindIII制限断片として抽出
され（F.L.Macrina, J.A. Tobian, K.R. Jones, R.P. E
vans and D.B. Clewell, 1982, A Cloning Vector able
to Replicate in Escherichia coli and Streptococcu
s sanguis, Gene, 19, 345-353), pUC18のHindIII部位
にクローニングされる。pUCクローニング配列の反対側
にある第２のHindIII部位はKlenow酵素終末修復により
除去される。pVA749自身は、ストレプトコッカス・ファ
エカリス(Streptococcus faecalis)（ラクトコッカス・
ラクチス内での複製可能）から複製したグラム陽性プラ
スミドとpAMβ1由来のエリスロマイシン耐性遺伝子から
構成される。pDP193の構造は、図6に描写されている。
トルベクターpDP193は、大腸菌ベクターpUC18（R.D. Pr
idmore, 1987, New and Versatile Cloning Vectors wi
th Kanamycin-Resistance, Gene, 56, 309-312)とプラ
スミドpVA749（F.L. Macrina,J.Ａ. Tobian, K.R. Jone
s and R.P. Evans, Molecular cloning in the Strepto
cocci, in A. Hallaender, R. DeMoss, S. Kaplan, S.
Konisky, D. Savage and R. Wolve (Eds.), Genetic en
gineering of microorganisms for chemicals,Plenum,
New York,1982, pp.195-210)から作られる。pVA749はキ
メラプラスミドpVA838よりHindIII制限断片として抽出
され（F.L.Macrina, J.A. Tobian, K.R. Jones, R.P. E
vans and D.B. Clewell, 1982, A Cloning Vector able
to Replicate in Escherichia coli and Streptococcu
s sanguis, Gene, 19, 345-353), pUC18のHindIII部位
にクローニングされる。pUCクローニング配列の反対側
にある第２のHindIII部位はKlenow酵素終末修復により
除去される。pVA749自身は、ストレプトコッカス・ファ
エカリス(Streptococcus faecalis)（ラクトコッカス・
ラクチス内での複製可能）から複製したグラム陽性プラ
スミドとpAMβ1由来のエリスロマイシン耐性遺伝子から
構成される。pDP193の構造は、図6に描写されている。
【００５０】プラスミドpVA838は、制限酵素HindIIIで
処理され、アガロースゲルで断片を分離し5.2kbのpVA74
9断片が精製される。ベクターpUC18は、制限酵素HindII
Iで処理、脱リン酸化を行ったのちpVA749断片と混合さ
れ、結合して大腸菌に形質転換される。コロニーは制限
酵素処理により分析され、陽性クローンをクローンDと
呼ぶ。クローンDは、50μg/mlエチジウムブロマイド存
在下で制限酵素HindIIIに処理され（M. Osterlund, H.
Luthman, S.V. Nilsson and G. Magnusson (1982), Eth
idium-bromide-inhibited restriction endonucleases
cleave one strand ofcircular DNA, Gene 20, 121-12
5)、その断片をアガロースゲル上で分離し7.9kbの線状
の断片が精製される。線形クローンD内にHindIIIによっ
て生じた４塩基の突出はManiatis et al.による４種の
ヌクレオチドの存在下でKlenow酵素によって埋められて
（T.Maniatis, E.F. Fritch and J. Sambrook, Molecul
ar cloning a laboratory manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982)、結合さ
れて大腸菌に形質転換される。コロニーは、制限酵素処
理によって分析され、陽性クローンをpDP193と呼ぶ。
処理され、アガロースゲルで断片を分離し5.2kbのpVA74
9断片が精製される。ベクターpUC18は、制限酵素HindII
Iで処理、脱リン酸化を行ったのちpVA749断片と混合さ
れ、結合して大腸菌に形質転換される。コロニーは制限
酵素処理により分析され、陽性クローンをクローンDと
呼ぶ。クローンDは、50μg/mlエチジウムブロマイド存
在下で制限酵素HindIIIに処理され（M. Osterlund, H.
Luthman, S.V. Nilsson and G. Magnusson (1982), Eth
idium-bromide-inhibited restriction endonucleases
cleave one strand ofcircular DNA, Gene 20, 121-12
5)、その断片をアガロースゲル上で分離し7.9kbの線状
の断片が精製される。線形クローンD内にHindIIIによっ
て生じた４塩基の突出はManiatis et al.による４種の
ヌクレオチドの存在下でKlenow酵素によって埋められて
（T.Maniatis, E.F. Fritch and J. Sambrook, Molecul
ar cloning a laboratory manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982)、結合さ
れて大腸菌に形質転換される。コロニーは、制限酵素処
理によって分析され、陽性クローンをpDP193と呼ぶ。
【００５１】プラスミドpDP193は、制限酵素SacIとEcoR
Iで処理され、脱リン酸化される。pDP352は、制限酵素S
acIとEcoRIとアガロースゲルから精製された1100塩基対
のCAT遺伝子と共に処理される。これら２つは混合され
結合ののち、ラクトコッカス・ラクチスの無プラスミド
株LM0230に電気的に転換される。陽性コロニーは、エリ
スロマイシン及びクロラムフェニコールに耐性なものと
して同定され、制限酵素処理によって確認できる。選択
した陽性クローンをpDP193-CAT 352と呼ぶ。
Iで処理され、脱リン酸化される。pDP352は、制限酵素S
acIとEcoRIとアガロースゲルから精製された1100塩基対
のCAT遺伝子と共に処理される。これら２つは混合され
結合ののち、ラクトコッカス・ラクチスの無プラスミド
株LM0230に電気的に転換される。陽性コロニーは、エリ
スロマイシン及びクロラムフェニコールに耐性なものと
して同定され、制限酵素処理によって確認できる。選択
した陽性クローンをpDP193-CAT 352と呼ぶ。
【００５２】pDP193-CAT ３５２は、制限酵素SseIとBam
HIによって処理され脱リン酸化される。プラスミドpN42
-Sub CEは、制限酵素SseIとBamHI（両方の制限部位は連
結部に由来する）とアガロースゲルから精製された9.3k
bの断片と共に処理される。これらの２つの断片は、混
合され結合ののちラクトコッカス・ラクチス LM0230株
に電気的に形質転換される。クローンは、制限酵素処理
によりスクリーニングされ、選択した陽性クローンを図
7に示すようにpDP359と呼ぶ。
HIによって処理され脱リン酸化される。プラスミドpN42
-Sub CEは、制限酵素SseIとBamHI（両方の制限部位は連
結部に由来する）とアガロースゲルから精製された9.3k
bの断片と共に処理される。これらの２つの断片は、混
合され結合ののちラクトコッカス・ラクチス LM0230株
に電気的に形質転換される。クローンは、制限酵素処理
によりスクリーニングされ、選択した陽性クローンを図
7に示すようにpDP359と呼ぶ。
【００５３】ベクターpDP359は、宿主ラクトバチルス・
ブルガリカス内で機能すべきシャトルベクターとしての
必要条件を満たしている。pDP359は、ラクトバチルス・
デルブリュエキイから分離、精製した完全な本物の複製
プラスミド、そして天然のラクトバチルス・ブルガリカ
ス プロモーターから転写されたクロラムフェニコール
耐性遺伝子を含有している。これらの考察は、前記のpD
P359プラスミドがラクトバチルス・ブルガリカスに導入
されたときに複製することを保証する。
ブルガリカス内で機能すべきシャトルベクターとしての
必要条件を満たしている。pDP359は、ラクトバチルス・
デルブリュエキイから分離、精製した完全な本物の複製
プラスミド、そして天然のラクトバチルス・ブルガリカ
ス プロモーターから転写されたクロラムフェニコール
耐性遺伝子を含有している。これらの考察は、前記のpD
P359プラスミドがラクトバチルス・ブルガリカスに導入
されたときに複製することを保証する。
【００５４】
【００５５】本発明に係るラクトバチルス・デルブリュ
エキイ由来の新しいプラスミドは、特定の微生物、特に
ラクトバチルス・ブルガリカスの形質を転換するのに利
用できる。
エキイ由来の新しいプラスミドは、特定の微生物、特に
ラクトバチルス・ブルガリカスの形質を転換するのに利
用できる。
【００５６】また、本発明の上記のプラスミドを含む組
み換えベクターは、大腸菌とラクトコッカス・ラクチス
の中での複製が可能で、特定の微生物、特にラクトバチ
ルス・ブルガリカスを形質転換できる。
み換えベクターは、大腸菌とラクトコッカス・ラクチス
の中での複製が可能で、特定の微生物、特にラクトバチ
ルス・ブルガリカスを形質転換できる。
【００５７】
【００５８】 配列番号：1 配列の長さ：８１４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：他の核酸 ＤＮＡ(プラスミド） 起源 生物名：ラクトバチルス・ブルガリカス (Lactobacillu
s bulgaricus) 株名：N2 配列の特徴 特徴を表す記号：プラスミド pN42 存在位置：１..8140 特徴を表す記号：複製の起始（Origin of replication) 存在位置：5694..5758. 特徴を表す記号：ORF1. 存在位置：1344..169. 特徴を表す記号：ORF2. 存在位置：5965..7806. 特徴を表す記号：ORF3. 存在位置：4718..5668. 特徴を表す記号：ORF4. 存在位置：3116..3637. 特徴を表す記号：ORF5. 存在位置：1779..2360.
s bulgaricus) 株名：N2 配列の特徴 特徴を表す記号：プラスミド pN42 存在位置：１..8140 特徴を表す記号：複製の起始（Origin of replication) 存在位置：5694..5758. 特徴を表す記号：ORF1. 存在位置：1344..169. 特徴を表す記号：ORF2. 存在位置：5965..7806. 特徴を表す記号：ORF3. 存在位置：4718..5668. 特徴を表す記号：ORF4. 存在位置：3116..3637. 特徴を表す記号：ORF5. 存在位置：1779..2360.
【００５９】 配列 CCTAGGCTTG AAATTGACGC ATAGGCGCAA AGGGAGCGGG CGACAGGGGG TAAAGCACGA 60 TAAATTCGTT TTTTACAGAC GTTCAGTCCA TGTTGTCATA TTTGTACTCC CGTTTTTAGG 120 GCTGTTTTAA AAGTATTTTT AGCGGCGATT TGTTAATTAT AGCCCCTATA CAAACATCTT 180 TTGTAAAAAG CCTTTTTTCT GTTCTTTCAA CAAATCTAAC TTACGTTGAT GAAGAGCGAT 240 AGTGTCATCT AGCTGTTTTA AAAATGAGCC TATTTTTTTT TGTTCTTCCT GACTAGGTTT 300 ATAGATTTTA AATGATGAAA ATTTAGAAAT CCAATGACGT TCATGACTTT GAGGTACATA 360 TTTTATATTC TTCAATGTAT TAAACATAAA ATAGAAATTG TCAGAATTAT CATTCAAACT 420 AAGTAATTTC ATTGCGGAGC TCTTAATTTT AAAAGGGAAA TCTACATAAT GAGAGTCAGT 480 TGTAAAATCA TCAAATATAA CAACTGGATT TTCTACGGTA GCATTTTTAA TCCCGCTAAT 540 TTCATCTGTA TAGCCCAATA AGAAACTCTT GCCTGCTGTT AAAACAGGGG TATTAAAATT 600 GTCATCGTAC TCTGTAGATT TGACAATATA TTTTGTTGGT TGCTCATAGT TAAATACCTC 660 CCCCAACTTA CACTGCTCCC ATTCGTCACT AAATCCTTCA AACCGAATAG CTGGATACCC 720 GCTCTTATAA GCGAACATTT TCTGCAGTAA AGCGCTTTTT AAGCATTTAA GTTGCTGTTT 780 CTTTTCCTCA TGTAAAGTGA TTGCAGTATC CAATTCAGAG AAGAAGTTAG CAATTCTTTC 840 TTGTTCAGAC GTAGTTGGAA ACGCAACAGA CTGATTTCCG ACAATATCCG AGTTCAAATT 900 AACCTGACTT CCCGGCTGAC CATATTTGTT CCAATATGGT TTGAACATAA GAAGCCATTG 960 AAACATAAAT TCCTTATTAA ATGTTGGGTT GAGAAATATT AAGAATCCAT CGTGAACTCC 1020 TGTGTTAACG TAATTGATCA CTGGACTACC CACAGTAGCA GCAATACTTA ACAATAAATG 1080 TGGTTCTGTG ATAACACGCG TTTTAGATTG ACCAGCTTTT GAAATGTGTT GCGATAAGTG 1140 ATGAATGCGT CCTTTTTGTT CAGTGACATC GGATATTCTT AGCCATCCAA CATTTGAATT 1200 ATCATCGAAC CATTTGGGGT TAGAAATAGG TCTTGGACTC GCTCCACGTA CGATTTCCGC 1260 TTTGTTTTTT AACTTACACT GCTCCCAAGG ATCAGCGAAA CCTTTAAATC TTAATTGCGG 1320 ATATTTAGCT TGTGTATCAT TCATTATTTT TCCTCCGGTT TAATGTCTAA GGCCATTTTA 1380 TCAAATTAAA AATCAGCAAA ACCTATTTTG TGTCTGGTGG AACCAACAAG CGGCTAGAAA 1440 ATATGCTGCC AAACACCCTA AAGAACAAAA TATTGATAAC GAGCATACTT GGCATTAAAC 1500 GCCGTATAAG CTCATTTAAG CCGTTTTAAG TGTTATATGC ATAATTATAT TAAAACTGCT 1560 TTAAAATCGC TTAGAAGCAA GAATAGGCAG CTTGAGTGGC TGAATTGGCG ATGACTGAAC 1620 TAAGGACTAG GCCAAGAAAC TTTTGCACAG TCAACAATTC CCCGGACTAA TTCGGACTTT 1680 TTCTTTCTGG TCAGGTCTCC TAATGGTCAG TAAGGTCAGC CGCTTCAGCG GTCAATCGTG 1740 TATAATAATA ATCAAGATTG ACAAGAGGAG GGCTGACAAT GGCAAATAGC GCTGGCATGC 1800 TGTCAGTAGG TCAAATAGCT AAAATGCTGA AGACCAACAG ACAGAACATT TACAACGTGC 1860 TTAAAGCTGA GCATATTAAA CCTGACGGCT TCAATGACAA GCACTATTCA CTTTACAGCC 1920 CGGAAACAAT TCAAGAGATC AAGGCCGCTC TGTCTAAGAA GGCAACGCTG AGAAGTAAGA 1980 AGGTAGTAGC AAAAGAGCAG GCTGAAGAGA TAGCTGACTT GAAGAATCAG CTGTCAGAAC 2040 AGCAGAGATT GACAACCTGG CTACAGTCTC AGCTGGTTCA ACTTCAAGTA GAGGCTGACA 2100 AGCTCAGGAG TCAGAACAGC CAGTTACAGC TAGACAATGC AAAGACTCAG CTCCTTATTG 2160 GCCAGGTTGA CCAGGAGAAG ACAACACTGA AGGCCGAGAA TGACCGACTG AGCGCTGAAA 2220 ATAACAAACT AGGACAATTA ACCGATAAGG TGCTGAAGGA CGCTCAGAGA GCAGAAGAGG 2280 ACGCTCAGAA GGCTAAAGCT GATCTAGATA AAGCCCAAGC CCGGCGGGCT GGCTTATGGT 2340 CTAGAATCAC CAGGAATTAT TAAGAGTGGT ATAGCCGTTA TCTGACTTTG TGAAATTCCT 2400 TATTGGCTCT GTCAGATCAA GCGATTTTAA ACCTATACGA GTTTGTGAAT CCTAGTTTAC 2460 GGAATTGGGC GATAAGGAAG CCCGTCATTG CAAGGATAGA AGGTTAGTTC CAATAAGACA 2520 CATTATGTAA AGTTGTAAGT GGTATACCTG TAATTGATTG ACAGGAACTA TACACGGGCT 2580 AGACACTTGC CAGCATTGAC TGTAGCGGCT TTACAATGAC ACTAGATCTA CACTATAATT 2640 ACAGCGGAAA GAGAAAGGCT GAGCGGTCTC CTAATGGACA ACTACAACTG GCCAGCCCGG 2700 CAACTTTGAG AGCCGTTAAA GAGCTCTCTC AGCATGGTTA GAGTATAGAA AGAGTGCTGA 2760 ACATGGACTT TAAAAAAGGG CTGAAGGGCT TGCAAGATCA GCAGACCCGG CTTGAAGCTA 2820 AACAGGAAGT ACTGTTAGAC ATCATGGCTG AGTTCTGGCC TAAAGTAGCT AAAGAAGGCA 2880 ATGACGTTGC TGAAGCGGTC AAGGTAGAAG ACCTGGCTGA ATGGTTCGCT AAGAACAGCC 2940 GGAAAACTGT TATTTGCGTG TCAGCAAGAC AGAAGACGGC TATGACCTGG CTTTTGAACC 3000 ACAACAGCCT TCAAGAGAAT TGTTATGGTA CGATGATCTT TATTGGCGGC TGGGTAAAAC 3060 AGCTGACCAA CTCAAAACGT AAATCTAAGG TCAAGACGCT AGAGGAAATT ATCTAATGGC 3120 GGTTTACAAA GAATGGACTG ATTCAGATCA TTTAGAGTTA GTCAAAAATT GGAAATTACA 3180 CGGGCTGACT AACGTTGAGA TAGCTCAAAG AATAGGCATT GCTGAGAAGA CTTTGTACGT 3240 ATGGTTGAAG AAGTCTCCTA AGCTGAAGAA GGCCATTAGA GGCGGCAAGG ATATTGCCAG 3300 GGCTAGGGCT GAGAATGCAC TGTATGAGCT TGCTCTTAAT GGCGATAGGC AAGCCCTTTT 3360 CTTTTGGCTC AAAAACAACT ACAGAGAACG CTACTCAGAC AAGCCGTTAA GCCCGGCTGA 3420 AGCCGATTTG ATGAGTCAGA AGGCAAGGCT GGCCAAATTA CAGGCTGACC TGGCTGAGGC 3480 TCAGCTGAAG GCCATTAAGG AAGACCAGGG AGACCAAGCA ACGCAATTAA ACAACCTGTT 3540 AGACAGTCTG AAGGAAGCCG TGTTAGATGA GGGAATTAGC CCCGATAACA TCGTTCCTAC 3600 TGGCAACGGC TTAATTATCG ATGATATTCC TGACTCTTAG GTTTACACGA CATTGACAGT 3660 GTAAACACAA GATAGCGGAA AATCTTCTGA TTATTATATT TACAAGCACT GTATATTGTG 3720 CTATTCTAAG ATGTGCTAAA CGGATTTGGG GAATGCAACT AACTGCTGTA AGGTATCAAC 3780 TTTTTTTGTT GCGCTCTTTA ATTCTTTAGC AAAAAGCTAG ATATCAAAAA AGAGCGAGAC 3840 CGGGTATTGC TTCACGGGTT CGCTCTTATT TTTTTATCTG GCTAGTTGCC TACTGGTACT 3900 ATGCTGACAC CCTAGCGGCA TGTTTGCGGT ATTGCACTAC AGCGGCAACA ATGGTAAAAA 3960 TAATAATAGG TAACAAAAAA GCCTTTAGTA CTGGCAATAC TAGAGGCGGG CTGTGTTTAG 4020 CTCTGGCAAA GCTTAACACG GTTAGAATTA TATTCCGTAC CACATATGAT ACGTTTAAAC 4080 GTAACACTCT GTCAAGGAGA ACATATCACC TTAAGGGTAC ATATAGTAGT TTTCTTCTAA 4140 CATTATGTTG TAAAAACATA ACATTTTGTA GACAAACACT ATACTTCTAT GACTCTAACC 4200 ATGTTTAAGA CAGGCCAGGC TAACACCTAT TGGCCTGTTT TTTGTTGCCA AAATTTCAAA 4260 AGAAAGGCGG TAACAGCCGT GATTAAACAA CAAAACATTG ATGTTAGAGC GGCTATTAAA 4320 GCTTCTGGTC TGAAGCAATA TGAGGTAGCT ACTTTGATGA ATGTTTCAGC TAGCTATCTC 4380 AGCCAGCTTT TACTTCAACC ATTGTCAGAA GGCCATAAGA AGCGCATTAT GGCGGCGATT 4440 AAACAAGGCG AGTCATTGAA GGGAGAACAA GAATAATGAT GAGCTTAGAA GAACGTGAGC 4500 AAGAAATTGA AAAGGTAGTA CGCATTGCTG AAGCTGACTT CAACAACGCT TGTCAATTGC 4560 ATGCTATCAA CAAGGAAGAT GTTATTAAGA ACCATGCTTA CAAGTATGCT GAAGTGCTGA 4620 GGCTTCAGGA ATTGCTGGCA TTGAACAAGA CCATTAGGGA CGGTCTGAAC GGCATTGAAA 4680 TGTCAGTAGA TCTCATTGAG TAGCGGGGAG ACCCGCCATG AACAACAGTG AAAAAAACTC 4740 TCTAATGGCT GAACCGTATA ACTCAGACCG CAACGCCATT GACAGACTCA GAATCAACCA 4800 GAAGGCCTTA CAGGCGGGCT CTGTCAAGCG TGAAGAGGGC TACAACTCAG AGGGCTTAGA 4860 AATGGTCTCC TACACGGCTT ATAAGAGCGG CATTCAGTAT GTCATTTCTT CAGAAGCTGA 4920 AGGCGGCAAA ATGGTTATTA ACGAGACCTT CAGCAAGGTT CAACATCTAC TAATTGCCAG 4980 CTGGTATAGC CAGCCAGACA GAGCCAGCAA TTTCAGAATA CAGCTGACCT TTAAAGAGAT 5040 CTCAGAGGCG CTAGGAGTCA GCAGAAGCCA GGCTACAGCG CTCAGAAAGC AGCTGAGAGA 5100 GCTAATTACA CAGCTAGTAC GTTGTACTTT TGTTAACAGC AATAAAGACG GCATAGACGC 5160 TGTCAATCTC TTTGCAGCTG GCAACTACAG TAAAGGGAAG CTGACAATGT GGTTAACTCC 5220 TAACATGGCT GAGCGGCTTC TGTCAGAAGA ATCATCTACG GAATATTTTC CGTTATCTTT 5280 ACTGAAGCTG AAAGGGACAG CCTATTATTT AGCCTTAAAG GTCATGCACA ACGCAAACAT 5340 TAATGCACGC TGGCATGCTG ACAGAGTTGA CAGATTGGGC TTAGAAAACA CGCTGAAGGC 5400 CTTGCCTACA CTCCCCGACC CGGTAAAACT CTCTAAAGGC AACAGCAGAA GCCTATACCT 5460 AAAAATCTTA ACTCCCCTGG CTAAAGCTAT TGAAGAGCTT GAAGCCGTCA CTGGCATTGT 5520 CGTTAGACCT AGCCAGCCAC TAAAGGGAAT GAAGACGAAA GATCTGTCTA AAGTCACTTT 5580 GAATGTCATT GATTGGGGAC AGGTTGATAT AGCCGAATTG ACCAGAAATA AGAGAAAACG 5640 CTTGCGAAAA AATAATGTTC GTGAGGACTA AAACTATATT TGTCCTAATT CGTATGTAGG 5700 TAATTATGGT CGCAAATGTA GGTAATTATG GTCGCAAATG TAGGTAATTA TGGTCGCATT 5760 GTGAAATTTA GGCAAGTGCC TTGAGGCATT GAGCCAGTAA GGAGTAAGCG CATTTTTTTA 5820 AAAAGCTTCA CTTGCTAATA GTTTAATAGT ATTAAAAGCA ACGGCTCAGC TTGACGCTGG 5880 CCTTGCTTGA AAATTGAAAA AAGATGAAAC AGCCAGGGAG AGCAGAGGCT TCTACTGGCC 5940 TGTTTTTAGA AGAAGGTATC TAGCATGAAC AATAACTTAG TTAAACCAAC AGATTTAAAG 6000 GGCTTGGTCT CTTTACCGGA ATACATTGCC AGCGTGGTTA GCATGGACTC TAAAGGCTTC 6060 TTTAGCTGTC TCAATCCGAA CCACCCGGAC AATCACCCTA GCATGTGTTT AGACCCTAAC 6120 CACCCGCAAT ATGTTCATTG CTTCAGTTGC GGCGTGTCCT ATGATCTGTT TGATTGTTGG 6180 GCGCTGATTA ATGACGGCGT GACAGAGACC AAGAAGAATA GCGCTGGCAA GGAAAAGCCA 6240 GTCTATAACT TCAATGCTGT AGCTTCAGAG ATTGCTGACC ATTACGGCTA TGCTCTTATT 6300 GGCGACCCGG CAAATGATCT CTATTCGGTA GAACCACCCT TGCCAGAACC ACCAGCAGAA 6360 CCAGCTCAGA CCAGCACCAA TTTTAGAGAG CAATTAGAAG ATTGGCATGC TAACTTGAAT 6420 CAGACTGACT ATCTTCAGAA GCGGGGAATC ACTCAGACAA CAGCAGAGAT TTTCAATTTA 6480 GGCTACTCCC CGTTGACCAA CAGCATTATT ATCCCTTACG GTCAGGACGG CTATTACGTT 6540 CAGAGGGCGC TGAATCCAAT TGAGAAGCGT GACCGCTACC GCTTCCCTAT TGGCCAGGCT 6600 AGAGCCTACA ACATTGAAGC ATTGGCTAAA TGCAAGACGG TATTCATCGT TGAAGGCCAG 6660 TTTGACGCTC TGTCAATCAT GCAAGAATCC GATGTAGGAG CTGTAGCAAC TTCAACCAGC 6720 CAGACTCGGC TTATTGTCAA GGCCTTACAG AAGTTCAAAG AGCAAGACCC AACAATTAAC 6780 CCGACTATCA TTCTCAGCAT GGACAACGAC AGAGCAGGCC AGAAGGCGAA TAGAGCCCTT 6840 CAGAGGGACT TAGAAGCCCT GGGCTTTACT TGCTATGTCA ACCCGGTTAA CGGCGACTAC 6900 AAGGACGCTA ACGAGTTCCT GGTAAAGGAT AGAGAGGGCT TCAGACAGAA ACTTCAGCAC 6960 GTCATCAATC AGCCCGACAA TTGGCTTGAC AATTACTATG CTGACATCAA AAAACGCCAT 7020 GACTACCCGG ACAATATCCC TACTGGCTTC AAGAATTTAG ATGATGAGCT TGACGGCGGT 7080 CTTCAGCCTA AACTGTATGT TTTAGGCGCT GTCAGTTCGC TAGGGAAAAC GACTTTTGCC 7140 TTGAATATTG CTGACAACCT GGCTAAACAG GGGAGACATG TTTTCTTCTT CAGCATGGAA 7200 TCTAGCAAGA GAGAAGTGAC GGACAAGCTT TTAAGCCGGG CTAGCTGTCT CTCTAACGGC 7260 CATAAATGGA CTCAGCTTCA AGTCAGCCGG GGAGAATGGT TGAACAATGC TGAGGACAAA 7320 GAAGAGTTTG ACGGCCTGTT TAAAGCCTTC AGCCGTTACC AGCACTTCTT ACATATCTAT 7380 GACAATAGAG TTAAGGCAAG TCAGGTAAAA GACCTGGTCA ATAGTTGGCT TGACAACCAC 7440 CCGGACGAGA AGAAGCCGCT TGTAGTCGTT GACTATCTTC AGATCTTGCA AGCTGAGCAG 7500 GACAATGTGA CAGATAAGGC GAAAGTGACG GACAGCGTGA GTGTTCTCTC AGAGCTGACT 7560 AAACAGGCTG AAGTCCCTGT TCTGGTCATC TCATCATTGA ACCGGGCTTC CTACTGGCAA 7620 GACGTAAGTT TTGAATCCTT CAAGGAATCC GGGGAAATTG AGTACTCAGC AGACGTTATG 7680 TTAGGATTAG AGTTCGCTCA TCGTGAAGAA TACATTACAG TTAAGGGCAA CGGCCATGTT 7740 GAATTGAACA AAGAGAAGTT TGACCAGCGG AAACAGGAAG TCCTAGACGG GTTGAAATGG 7800 TCATTCTGAA GAATCGAACT GGCAAGACAG GCGGTCATAT CTTCTTCAAG TACAACGCCA 7860 TGTTTAACAG CTACCAGGCA TGCACTGAGC AAGAGGCGGC AATACCCAAT AACTTTAATA 7920 AGTTGTTTCA TAGCAAGGAA GTAGGCAAGC CAATTGAAGC GGCTGTGCGT GATTACACGG 7980 TAGACCCGGT AACAGGCCTG GCAACAGAGA AGAAGCCCGA TAAATAGAAC TGAAGAAGCT 8040 GGCCAGGAAT GGCTGGCTTT TGTTTTGCCT TCAGACGCTC TCAGAAGCTC ATAGAGCCCC 8100 TCTGAGCCTG CATTGGTAGA TTTTTCCGGC CGAACACCCC 8140
【００６０】配列番号：２ 配列の長さ：１２０２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ＤＮＡ(合成） 配列の特徴 起源：ラクトバチルス・ブルガリカス (Lactobacillus
bulgaricus) 特徴を表す記号：lacS プロモーター 存在位置：1..239 配列の特徴 起源：スタフィロコッカス・アウレウス (Staphylococc
us aureus) 特徴を表す記号：クロラムフェニコール アセチルトラ
ンスフェラーゼ ペプチド (Chloramphenicol acetyltra
nsferase peptide) 存在位置：240..890 配列の特徴 起源：ラクトコッカス・ラクチス (Lactococcus lacti
s) 特徴を表す記号：ステム−ループ ターミネーター フォ
ローイング galT 遺伝子 (stem-loop terminator follo
wing galT gene) 存在位置：903..1102
bulgaricus) 特徴を表す記号：lacS プロモーター 存在位置：1..239 配列の特徴 起源：スタフィロコッカス・アウレウス (Staphylococc
us aureus) 特徴を表す記号：クロラムフェニコール アセチルトラ
ンスフェラーゼ ペプチド (Chloramphenicol acetyltra
nsferase peptide) 存在位置：240..890 配列の特徴 起源：ラクトコッカス・ラクチス (Lactococcus lacti
s) 特徴を表す記号：ステム−ループ ターミネーター フォ
ローイング galT 遺伝子 (stem-loop terminator follo
wing galT gene) 存在位置：903..1102
【００６１】 配列 GAATTCACCA ACGCTTTCAT TTCACGCCTC CCGAAGTACA TGCAAGAGGC TATATCGCCA 60 TCATTAGCAG CTTAATTGAA TATTTACTGG CTAAACTATT GAGTTTTCAA GGCTTCATAG 120 TTCTTTTTGG TGTGGAAGTT TAAATTACTA AAAATATTTT AGTAAAACAT CTTGGTTTAT 180 TTAGTAAACA AGTCTATACT GTAATTATAA ACAAGTTAAC ACACCTAAAG GAGAATTTCA 240 TGAACTTTAA TAAAATTGAT TTAGACAATT GGAAGAGAAA AGAGATATTT AATCATTATT 300 TGAACCAACA AACGACTTTT AGTATAACCA CAGAAATTGA TATTAGTGTT TTATACCGAA 360 ACATAAAACA AGAAGGATAT AAATTTTACC CTGCATTTAT TTTCTTAGTG ACAAGGGTGA 420 TAAACTCAAA TACAGCTTTT AGAACTGGTT ACAATAGCGA CGGAGAGTTA GGTTATTGGG 480 ATAAGTTAGA GCCACTTTAT ACAATTTTTG ATGGTGTATC TAAAACATTC TCTGGTATTT 540 GGACTCCTGT AAAGAATGAC TTCAAAGAGT TTTATGATTT ATACCTTTCT GATGTAGAGA 600 AATATAATGG TTCGGGGAAA TTGTTTCCCA AAACACCTAT ACCTGAAAAT GCTTTTTCTC 660 TTTCTATTAT TCCATGGACT TCATTTACTG GGTTTAACTT AAATATCAAT AATAATAGTA 720 ATTACCTTCT ACCCATTATT ACAGCAGGAA AATTCATTAA TAAAGGTAAT TCAATATATT 780 TACCGCTATC TTTACAGGTA CATCATTCTG TTTGTGATGG TTATCATGCA GGATTGTTTA 840 TGAACTCTAT TCAGGAATTG TCAGATAGGC CTAATGACTG GCTTTTATAA TATGAGATAA 900 TCGAAAAAAA AAAGCTCAAA TTTTTGAGCT TTTTTTGTAT GTAATTGTCA TGCATGAAAA 960 TGTAATGGTA ATTGTGATAA TTATTAATAA AAAAATTGAT ATAATGAAGT GGATGAAAAA 1020 AAGACAGTTA AGAAGAAATA AAAATAAATT TAAAAGAGTA TCACTAGCTT TTTTTGGTTT 1080 AGTGATTATT TTAGCGGAGC TC 1102
【図１】本発明によるラクトバチルス・デルブリュエキ
イのプラスミドpN42の制限地図である。
イのプラスミドpN42の制限地図である。
【図２】プラスミドpJDC9とプラスミドpN42からのプラ
スミドpN42-Sub CBの構成を示す図である。
スミドpN42-Sub CBの構成を示す図である。
【図３】プラスミドpJDC9とプラスミドpN42からのpN42-
Sub CEの構成を示す図である。
Sub CEの構成を示す図である。
【図４】プラスミドpUC19とプラスミドpN42からのｐN42
-Sub WとｐN42-Sub Xの構成を示す図である。
-Sub WとｐN42-Sub Xの構成を示す図である。
【図５】pDP352のクロラムフェニコール・トランスアセ
チラーゼ遺伝子の構成を示す図である。
チラーゼ遺伝子の構成を示す図である。
【図６】プラスミドpDP193の構成を示す図である。
【図７】プラスミドpDP359の構成を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:225） Ｃ１２Ｒ 1:225）
Claims (6)
- 【請求項１】 少なくとも次の表１に示した制限地図又
はその部分を含むラクトバチルス・デルブリュエキイ由
来のプラスミド。 【表１】 - 【請求項２】 少なくともＤＮＡ配列番号１及び／又は
その相補的配列、あるいはその部分を含む請求項１に記
載のプラスミド。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載のプラスミド、大
腸菌及び／又はラクトコッカス・ラクチス内での複製が
可能な少なくとも１つのＤＮＡ配列、そして少なくとも
１つのマーカーを含む組み替えベクター。 - 【請求項４】 請求項１又は２に記載のプラスミド、及
び／又は請求項３に記載の組み換えベクターによって形
質転換された微生物。 - 【請求項５】 請求項1又は２に記載のプラスミド、及
び／又は請求項３に記載の組み換えベクターによって形
質転換された、ラクトバチルス・ブルガリカス。 - 【請求項６】 請求項１又は２に記載のプラスミド、及
び／又は請求項３に記載のベクターの微生物の形質転換
への利用。
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