CN105588866A - 一种识别双香豆素分子印迹电化学传感器的制备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了<b>一</b>种识别双香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，首先将玻碳电极用硅烷偶联剂和纳米铂修饰；然后，在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，二甲基丙烯酸-1，4-丁二醇酯：15~25%，丙烯酰胺：2~8%，衣康酸：4~10%，乙腈：58~71%，偶氮二异庚睛：1.0~2.0%，双香豆素：1.0~3.0%，搅拌溶解，通氮气除氧15？min，氮气氛围，55~65℃搅拌反应，即得双香豆素分子印迹聚合物；再将聚合物涂到修饰电极上，去除模板分子，制得双香豆素分子印迹电化学传感器，该传感器对双香豆素具有较高的识别性能，制得的传感器成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速，可反复使用，本发明制备的分子印迹传感器对双香豆素的响应大大提高。

Description

一种识别双香豆素分子印迹电化学传感器的制备

技术领域

本发明涉及的是一种分子印迹传感器的制备方法及快速检测应用技术领域，特别涉及一种识别双香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法，具体是基于分子印迹特异性识别作用，用于检测药品、食品、生物样品中的双香豆素技术。

背景技术

香豆素衍生物是一类广泛存在于自然界中的重要杂环化合物，具有明显的抗凝结、抗癌症及抗HIV（HumanImmunodeficiencyVirus）等生物活性。香豆素衍生物中，有一部分是分子中含有两个香豆素单体的（即香豆素的二聚体），这类化合物称为双香豆素，双香豆素具有多种生物活性，双香豆素临床实用的抗凝血剂，今年来还发现双香豆素化合物可作为抗菌剂、HIV-1整合酶、尿酶和抗结核活性。所以准确识别双香豆素对确定药物活性十分重要。双香豆素的化学结构为香豆素的二聚体，其化学结构与维生素K相似，其分子式为C₁₉H₁₂O₆，相对分子质量为336.30。双香豆素几乎不溶于水、乙醇、乙醚，溶于强碱溶液，熔点287~293℃。纯品白色或乳白色结晶粉末状。目前，检测双香豆素的方法主要有高效液相色谱、液相色谱-质谱，色谱法的准确度受到一定限制、而且仪器比较贵需要专业人员操作，也限制了其应用。另外，由于双香豆素类的衍生物的分子结构十分相近很难分开，测定时互相干扰，准确检测双香豆素很困难。因此，找到一种选择性好、灵敏度高、操作简便使用的检测双香豆素的方法十分重要。

分子印迹技术是当前开发具有分子识别功能的高选择性材料的主要方法之一，它是通过在模板分子周围形成一个高度交联的刚性高分子，除去模板分子后在分子印迹聚合物的网络结构中留下具有结合能力的识别位点，对模板分子表现出高选择识别性能的一种技术。这项技术以其构效预定性和特异识别性越来越受到人们的关注，已经成功用于固相萃取或微固相萃取，亲和色谱或毛细管电泳及传感器等领域。

依据此技术制备的分子印迹电化学传感器，应用于药物分析、环境保护及生命科学研究中起着十分重要的作用。将功能分子以适当方式修饰到电极上，制备选择性好、灵敏度高、有一定使用寿命可再生的电化学传感器成为分析科学工作者努力探索的课题。但是传统的印迹方法所制备的印迹膜厚度难以控制，高交联度使得电子传递速度和响应慢、检测下限高而且再生和可逆性差，影响分子印迹技术在电化学传感器中的应用。因此，建立一种灵敏、快速、简便、特异性高、重复性好经济使用的检测方法，对研究人员、生产企业、质控人员、政府管理部门等的迫切需要的，对食品、药品、环境安全中的双香豆素含量准确定量测定十分必要，对于香豆素生产和药理研究也具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是将分子印迹与电化学传感器相结合，提供了一种识别双香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法，主要是以双香豆素为模板，在玻碳电极表面通过硅烷偶联剂、纳米铂粒子的修饰，提高了传感器的灵敏度，采用滴涂法制备双香豆素分子印迹电化学传感器。

仪器与试剂

CHI660B电化学工作站（上海辰华仪器公司），实验采用三电极体系：铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极（SCE），玻碳电极（GCE）为工作电极；KQ-250E型超声波清洗器；

γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷；无水乙醇；二甲基丙烯酸-1，4-丁二醇酯、丙烯酰胺、衣康酸；偶氮二异庚睛，乙腈，双香豆素；氯化铂、水合肼、聚乙烯醇；磷酸缓冲溶液；所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

一种识别双香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法，特征在于该方法具有以下工艺步骤：

（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极依次用0.2μm、0.02μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为30~35%的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至45±2℃浸泡100~120min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；

（2）纳米铂修饰玻碳电极的制备：将步骤（1）制备的预处理玻碳电极放入0.15mol/L氯化铂水溶液中，室温下浸泡6~8h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为30%的水合肼溶液中浸泡1h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米铂修饰玻碳电极；

（3）双香豆素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，二甲基丙烯酸-1，4-丁二醇酯：15~25%，丙烯酰胺：2~8%，衣康酸：4~10%，乙腈：58~71%，偶氮二异庚睛：1.0~2.0%，双香豆素：1.0~3.0%，各组分含量之和为百分之百，搅拌溶解，通氮气除氧15min，氮气氛围，55~65℃搅拌反应6~8h，聚合完成后将悬浮物滤去，依次用高纯水、甲醇洗涤多次，真空干燥，即得双香豆素分子印迹聚合物；

（4）识别双香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的双香豆素分子印迹聚合物分散于0.5~08%的聚乙烯醇溶液中，制得22g/L的双香豆素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液15μL滴加到步骤（2）制备的纳米铂修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用甲醇与盐酸（体积比为甲醇：盐酸为20:1）混合溶液浸泡6~8h，除去电极上的模板分子，即得识别双香豆素分子印迹电化学传感器。

步骤（3）所述的二甲基丙烯酸-1，4-丁二醇酯：丙烯酰胺：衣康酸的最优摩尔比为3：1：1。

步骤（3）中所述的氮气氛围为通氮气除氧后氮气一直通入直到反应结束。

步骤（4）中所述的聚乙烯醇的平均分子量在110000~130000之间。

本发明的优点及效果是：

本发明将印迹技术、层层自组装法和滴涂法相结合，玻碳电极通过硅烷偶联剂连接将纳米铂修饰在电极表面，使其提高导电性能，再在纳米铂的基础上滴涂分子印迹聚合物，成功地研制了一种具有特异选择性的印迹电化学传感器。通过与无纳米铂修饰的分子印迹电极那个的响应进行比较，本发明制备的双香豆素分子印迹电化学传感器的响应信号大大提高。该印迹传感器对双香豆素表现出较高的亲和性、灵敏性和选择性，响应电流与双香豆素的浓度在4.0×10^-8~1.0×10^-4mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为1.62×10^-8mol/L将本发明制备的双香豆素分子印迹电化学传感器成功用于药品、生物样品中双香豆素的检测中，回收率在96.28~104.5%之间，因此本发明制备的分子印迹传感器可广泛应用于化工、生物医药、食品、环保检测等相关领域。

具体实施方式

实施例1

（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极依次用0.2μm、0.02μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为33%的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至45±2℃浸泡110min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；

（2）纳米铂修饰玻碳电极的制备：将步骤（1）制备的预处理玻碳电极放入0.15mol/L氯化铂水溶液中，室温下浸泡7h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为30%的水合肼溶液中浸泡1h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米铂修饰玻碳电极；

（3）双香豆素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，20mL的二甲基丙烯酸-1，4-丁二醇酯，5g丙烯酰胺，7g衣康酸，64mL的乙腈，1.5g的偶氮二异庚睛，2.5g的双香豆素，搅拌溶解，通氮气除氧15min，氮气氛围，60℃搅拌反应7h，聚合完成后将悬浮物滤去，依次用高纯水、甲醇洗涤多次，真空干燥，即得双香豆素分子印迹聚合物；

（4）双香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的双香豆素分子印迹聚合物分散于0.7%的聚乙烯醇溶液中，制得22g/L的双香豆素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液15μL滴加到步骤（2）制备的纳米铂修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用甲醇与盐酸（体积比为甲醇：盐酸为20:1）混合溶液浸泡7h，除去电极上的模板分子，即得双香豆素分子印迹电化学传感器。

实施例2

（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极依次用0.2μm、0.02μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为30%的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至45±2℃浸泡110min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；

（2）纳米铂修饰玻碳电极的制备：将步骤（1）制备的预处理玻碳电极放入0.15mol/L氯化铂水溶液中，室温下浸泡6h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为30%的水合肼溶液中浸泡1h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米铂修饰玻碳电极；

（3）双香豆素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，15mL的二甲基丙烯酸-1，4-丁二醇酯，8g丙烯酰胺，10g衣康酸，65mL的乙腈，1g的偶氮二异庚睛，1g的双香豆素，搅拌溶解，通氮气除氧15min，氮气氛围，55℃搅拌反应6h，聚合完成后将悬浮物滤去，依次用高纯水、甲醇洗涤多次，真空干燥，即得双香豆素分子印迹聚合物；

（4）双香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的双香豆素分子印迹聚合物分散于0.6%的聚乙烯醇溶液中，制得22g/L的双香豆素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液15μL滴加到步骤（2）制备的纳米铂修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用甲醇与盐酸（体积比为甲醇：盐酸为20:1）混合溶液浸泡6h，除去电极上的模板分子，即得双香豆素分子印迹电化学传感器。

实施例3

（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极依次用0.2μm、0.02μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为35%的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至45±2℃浸泡100min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；

（2）纳米铂修饰玻碳电极的制备：将步骤（1）制备的预处理玻碳电极放入0.15mol/L氯化铂水溶液中，室温下浸泡8h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为30%的水合肼溶液中浸泡1h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米铂修饰玻碳电极；

（3）双香豆素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，25mL的二甲基丙烯酸-1，4-丁二醇酯，7g丙烯酰胺，5g衣康酸，58mL的乙腈，2g的偶氮二异庚睛，3g的双香豆素，搅拌溶解，通氮气除氧15min，氮气氛围，65℃搅拌反应8h，聚合完成后将悬浮物滤去，依次用高纯水、甲醇洗涤多次，真空干燥，即得双香豆素分子印迹聚合物；

（4）双香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的双香豆素分子印迹聚合物分散于0.8%的聚乙烯醇溶液中，制得22g/L的双香豆素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液15μL滴加到步骤（2）制备的纳米铂修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用甲醇与盐酸（体积比为甲醇：盐酸为20:1）混合溶液浸泡8h，除去电极上的模板分子，即得双香豆素分子印迹电化学传感器。

实施例4

（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极依次用0.2μm、0.02μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为32%的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至45±2℃浸泡115min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；

（2）纳米铂修饰玻碳电极的制备：将步骤（1）制备的预处理玻碳电极放入0.15mol/L氯化铂水溶液中，室温下浸泡6.5h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为30%的水合肼溶液中浸泡1h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米铂修饰玻碳电极；

（3）双香豆素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，222mL的二甲基丙烯酸-1，4-丁二醇酯，2g丙烯酰胺，4g衣康酸，69mL的乙腈，1g的偶氮二异庚睛，2g的双香豆素，搅拌溶解，通氮气除氧15min，氮气氛围，57℃搅拌反应6.5h，聚合完成后将悬浮物滤去，依次用高纯水、甲醇洗涤多次，真空干燥，即得双香豆素分子印迹聚合物；

（4）双香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的双香豆素分子印迹聚合物分散于0.5%的聚乙烯醇溶液中，制得22g/L的双香豆素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液15μL滴加到步骤（2）制备的纳米铂修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用甲醇与盐酸（体积比为甲醇：盐酸为20:1）混合溶液浸泡6.5h，除去电极上的模板分子，即得双香豆素分子印迹电化学传感器。

实施例5

（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极依次用0.2μm、0.02μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为34%的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至45±2℃浸泡110min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；

（2）纳米铂修饰玻碳电极的制备：将步骤（1）制备的预处理玻碳电极放入0.15mol/L氯化铂水溶液中，室温下浸泡7.5h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为30%的水合肼溶液中浸泡1h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米铂修饰玻碳电极；

（3）双香豆素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，18mL的二甲基丙烯酸-1，4-丁二醇酯，3g丙烯酰胺，6g衣康酸，71mL的乙腈，1g的偶氮二异庚睛，1g的双香豆素，搅拌溶解，通氮气除氧15min，氮气氛围，62℃搅拌反应7.5h，聚合完成后将悬浮物滤去，依次用高纯水、甲醇洗涤多次，真空干燥，即得双香豆素分子印迹聚合物；

（4）双香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的双香豆素分子印迹聚合物分散于0.6%的聚乙烯醇溶液中，制得22g/L的双香豆素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液15μL滴加到步骤（2）制备的纳米铂修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用甲醇与盐酸（体积比为甲醇：盐酸为20:1）混合溶液浸泡7.5h，除去电极上的模板分子，即得双香豆素分子印迹电化学传感器。

实施例6

将上述实施例1~5所制备的双香豆素分子印迹电化学传感器，用于双香豆素的检测，步骤如下：

（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的双香豆素标准溶液，底液为pH7.0的磷酸盐缓冲溶液；

（2）工作曲线绘制：将Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，本发明制备的电极为工作电极组成三电极系统，连接CHI660B电化学工作站，在K₃[Fe(CN)₆]溶液中，采用循环伏安法在-0.30~0.3V电位范围内进行检测，空白标样的响应电流记为I ₀ ，含有不同浓度的双香豆素标准溶液的响应电流即为I _i ，响应电流降低的差值为△I=I ₀ -I _i ，△I与双香豆素标准溶液的质量浓度c之间呈线性关系，绘制△I~c工作曲线；

（3）双香豆素的检测：用待测样品代替步骤（1）中的双香豆素标准溶液，按照步骤（2）的方法进行检测，根据响应电流降低的差值△I和工作曲线，得到待测样品中双香豆素的含量；

所述K₃[Fe(CN)₆]溶液的浓度为5.0mmol/L；

所述pH7.0的磷酸盐缓冲溶液的浓度在50mmol/L。

响应电流与双香豆素的浓度在4.0×10^-8~1.0×10^-4mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为1.62×10^-8mol/L将本发明制备的双香豆素分子印迹电化学传感器成功用于药品、生物样品中香豆素的检测中，回收率在96.28~104.5%之间，因此本发明制备的分子印迹传感器可广泛应用于化工、生物医药、食品、环保检测等相关领域。

Claims (6)

1.一种识别双香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，该方法具有以下工艺步骤：

（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极依次用0.2μm、0.02μmAl₂O₃粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为30~35%的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至45±2℃浸泡100~120min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；

（2）纳米铂修饰玻碳电极的制备：将步骤（1）制备的预处理玻碳电极放入0.15mol/L氯化铂水溶液中，室温下浸泡6~8h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为30%的水合肼溶液中浸泡1h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米铂修饰玻碳电极；

（3）双香豆素分子印迹聚合物的制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，二甲基丙烯酸-1，4-丁二醇酯：15~25%，丙烯酰胺：2~8%，衣康酸：4~10%，乙腈：58~71%，偶氮二异庚睛：1.0~2.0%，双香豆素：1.0~3.0%，各组分含量之和为百分之百，搅拌溶解，通氮气除氧15min，氮气氛围，55~65℃搅拌反应6~8h，聚合完成后将悬浮物滤去，依次用高纯水、甲醇洗涤多次，真空干燥，即得双香豆素分子印迹聚合物；

（4）识别双香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的双香豆素分子印迹聚合物分散于0.5~08%的聚乙烯醇溶液中，制得22g/L的双香豆素分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液15μL滴加到步骤（2）制备的纳米铂修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用甲醇与盐酸混合溶液浸泡6~8h，除去电极上的模板分子，即得识别双香豆素分子印迹电化学传感器。

2.根据权利要求1中所述的一种识别双香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的二甲基丙烯酸-1，4-丁二醇酯：丙烯酰胺：衣康酸的最优摩尔比为3：1：1。

3.根据权利要求1中所述的一种识别双香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的氮气氛围为通氮气除氧后氮气一直通入直到反应结束。

4.根据权利要求1中所述的一种识别双香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述的聚乙烯醇的平均分子量在110000~130000之间。

5.根据权利要求1中所述的一种识别双香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述甲醇与盐酸混合溶液的甲醇：盐酸体积比为20:1。

6.根据权利要求1中所述的一种识别双香豆素分子印迹电化学传感器的制备方法所制备的识别双香豆素分子印迹电化学传感器。