CN105586328A - 一种米曲霉发酵酶液的提取物及其应用 - Google Patents

一种米曲霉发酵酶液的提取物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一种米曲霉发酵酶液的提取物及其应用。所述米曲霉发酵酶液的提取物是由米曲霉HML366通过发酵培养，再经过浸提、过滤并离心得到粗酶液，取粗酶液中的上清酶液使用纤维素超滤柱浓缩和阴离子交换层析纯化制备而得。本发明由米曲霉HML366发酵酶液得到的提取物，同时具有葡聚糖外切酶和葡聚糖内切酶活性，酶活性高，耐高温，宽pH耐受范围，可以显著提高纤维素酶系的降解能力，改善纤维素酶系的协同作用。

Description

一种米曲霉发酵酶液的提取物及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种米曲霉发酵酶液的提取物及其应用。
背景技术
植物纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源，植物每年通过光合作用，能产生高达15.5×1010吨纤维素类物质，其中纤维素、半纤维素的总量为8.5×1010吨。纤维素是植物（包括某些真菌和细菌）的结构多糖，是它们细胞壁的主要成分。木材的大于50%，麻纤维的70-80%，棉纤维的90-98%。木质纤维素是由D-葡萄糖借β-（1,4）糖苷键连接的直链多糖，纤维素多糖可以被酶水解糖化降解成为葡萄糖，最终经生物转化生成乙醇，经过蒸馏就可以得到洁净的乙醇作为能源，代替不可再生的石油资源。
纤维素酶系是一组协同作用降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，根据各种酶的作用不同主要分为三类：
(1)β-葡聚糖内切酶（EC3.2.1.4，endo-1,4-β-D-glucanase，EG）：可结合在纤维素链内部的非结晶区的任何部位随机水解β-1，4糖苷键，切断纤维素链产生有非还原端的小分子纤维素，主要产物是纤维二糖、纤维三糖和纤维寡聚糖等。
(2)葡聚糖外切酶（EC3.2.1.91，exo-1,4-β-D-glucanase，CBH）：葡聚糖外切酶是纤维素酶系中的重要组分，在天然纤维素的降解过程主导作用，从纤维素链的末端水解β-1，4糖苷键，依次切下纤维二糖分子，生成葡萄糖、纤维寡聚糖和纤维二糖。葡聚糖外切酶可以从线状分子的纤维素水解切下纤维二糖单位，故又称为纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase）。
(3)β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21，β-1,4-glucosidase，BG）：β-葡萄糖苷酶将纤维二糖或其他可溶性的纤维寡糖水解成葡萄糖分子，也称纤维二糖酶。纤维寡聚糖和纤维二糖对内切葡聚糖酶和葡聚糖外切酶具有强烈的抑制作用，β-葡萄糖苷酶可以消除纤维二糖对内切葡聚糖酶和葡聚糖外切酶的反馈抑制作用，提高纤维素酶的降解效率，在纤维素的降解中起着非常关键的作用。
在这三类酶的协同作用下，纤维素最终被降解为葡萄糖。在植物纤维素中，结晶状的纤维素微纤丝紧紧的被木质素和半纤维素包裹着，木聚糖酶可以降低纤维素生物质颗粒的大小和机械晶格，破坏秸秆中的纤维素、半纤维素与木质素的结构，使之松散。自然界中有产纤维素酶的微生物主要是霉菌和细菌，目前用于生产纤维素酶的菌种主要有木霉属(Trichoderma)、青霉(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)的菌种。应用最广的纤维素酶生产菌是木霉属(Trichoderma)菌种，但木霉属菌种常常存在β-葡萄糖苷酶活力较低的不足，导致纤维二糖积累，降低酶解效率。由于目前的纤维素酶普遍存在着酶活力低、成本高的缺陷，用木质纤维素生产燃料乙醇至今不能真正实现工业化，开发新的纤维素酶资源一直是研究热点。
发明内容
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种米曲霉发酵酶液的提取物及其应用，所得提取物同时具有葡聚糖外切酶和葡聚糖内切酶活性，耐高温，宽pH耐受范围，在纤维素水解糖化应用上具有良好的应用潜能。
本发明采用的技术方案如下：
一种米曲霉发酵酶液的提取物，所述提取物是由米曲霉HML366通过下述步骤制备得到：
（1）将米曲霉HML366的PDA斜面菌种制成孢子液，取孢子液中孢子于纤维素酶复筛固体培养基中，30℃恒温培养5-8天；
（2）在步骤（1）所得培养物中加入150-250mL无菌重蒸水，40℃恒温水浴1-2小时，然后浸提、过滤并离心得到粗酶液；
（3）收集步骤（2）所得粗酶液中的上清酶液，使用纤维素超滤柱将所述上清酶液浓缩，再使用阴离子交换层析纯化，得到成品。
进一步地，所取孢子液中孢子的个数为105-108个。
进一步地，步骤（1）所述纤维素酶复筛固体培养基为：12g蔗渣，8g麸皮，60mLMandels营养盐液。
进一步地，步骤（2）所述离心的转速为4500-5500r/min，时间为10-30min。
进一步地，步骤（3）中，使用纤维素超滤柱将上清酶液浓缩，浓缩至原来上清酶液1/5体积。
进一步地，所述纤维素超滤柱为3000Da纤维素超滤柱。
进一步地，步骤（3）中，使用阴离子交换层析，压力为580psi，以pH8.3的0.01mol/LTris-HCl为起始缓冲液，在所述起始缓冲液中添加1mol/L的NaCl为洗脱缓冲液，纯化至NaCl摩尔浓度为0.27mol/L时，得到成品。
进一步地，步骤（3）所述浓缩、纯化均在2~4℃进行。
本发明还提供如上所述一种含有米曲霉发酵酶液提取物的组合物。
如上所述的米曲霉发酵酶液提取物及其组合物在降解植物纤维素中的应用。
本发明所用的米曲霉HML366已经在非专利文献中公开，文献出处为：YonglingQin,YunkaiZhang,HaiyanHE,etal.ScreeningandIdentificationofaFungalβ-GlucosidaseandtheEnzymaticSynthesisofGentiooligosaccharide.AppliedBiochemistryandBiotechnology，2011,163:1012–1019；申请人已保证从申请日起二十年内向公众发放该生物材料。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
（1）本发明由米曲霉HML366发酵酶液得到的提取物，同时具有葡聚糖外切酶和葡聚糖内切酶活性，酶活性高，耐高温，宽pH耐受范围，可以显著提高纤维素酶系的降解能力，改善纤维素酶系的协同作用。
（2）本发明的米曲霉发酵酶液提取物的制备方法简单，在得到粗酶液后只需经过纤维素超滤柱浓缩和阴离子交换层析纯化，即可得到成品。3000Da纤维素超滤柱可以有效的脱除粗酶液的盐分和小分子量杂质，在pH为8.3的缓冲液条件下，阴离子交换层析对酶蛋白的吸附洗脱分离效果好。
附图说明
本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：
图1是阴离子交换层析蛋白纯化图；
图2是本发明的米曲霉发酵酶液提取物的SDS-PAGE电泳图；
图3是米曲霉发酵酶液提取物的葡聚糖外切酶酶活快速检测效果图；
图4是米曲霉发酵酶液提取物的葡聚糖内切酶酶活快速检测效果图；
图5是米曲霉发酵酶液提取物的酶最适温度和温度稳定性图；
图6是米曲霉发酵酶液提取物的酶最适pH和pH稳定性图；
图7为HMLCBH1经胰蛋白酶消化后的飞行时间质谱分析图；
图8为飞行时间质谱结果图；
图9为米曲霉发酵酶液提取物的保守序列分析图；
图10为米曲霉发酵酶液提取物的序列功能分析图。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书（包括任何附加权利要求、摘要）中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
米曲霉发酵酶液提取物的制备
本实施例使用的培养基包括如下几种：
（1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂15.0~20.0g，蒸馏水1000mL，pH自然。
（2）纤维素酶复筛固体培养基：12g蔗渣，8g麸皮，60mLMandels营养盐液。
（3）Mandels营养盐液：(NH4)2SO41.4g，KH2PO42g，CaCl20.3g，MgSO4·7H2O3g，FeSO4·7H2O5mg，MnSO41.6mg，CoCl22.0mg，ZnCl21.7mg，定溶于1000mL蒸馏水中。
本发明的一种米曲霉发酵酶液的提取物，所述提取物是由米曲霉HML366通过下述步骤制备得到：
（1）将米曲霉HML366的PDA斜面菌种用10mL生理盐水洗下制成孢子液，采用血球计数板在显微镜下直接测定孢子数，取107个孢子于纤维素酶复筛固体培养基中，置于500mL锥形烧瓶内混匀，每天翻动两次，30℃恒温培养5-8天；
（2）在步骤（1）所得培养物中加入200mL无菌重蒸水，40℃恒温水浴1-2小时，然后浸提、四层纱布过滤并5000r/min离心20min，得到粗酶液；
（3）收集步骤（2）所得粗酶液中的上清酶液，4℃保存；使用纤维素超滤柱将所述上清酶液浓缩至原来上清酶液5分之一体积，再使用阴离子交换层析分离纯化，用10mL起始缓冲液把样品带入阴离子交换层析柱，设计100mL洗脱缓冲液，流速1mL/min，洗脱缓冲液浓度线性递增50％洗脱分离酶蛋白，每管收集1mL；大约在64min在0.27mol/LNaCl浓度时洗出的提取物收集在第31管，即得成品。
其中，阴离子交换层析中压力为580psi，以pH8.3的0.01mol/LTris-HCl为起始缓冲液，在所述起始缓冲液中添加1mol/L的NaCl为洗脱缓冲液。
参见附图1为阴离子交换层析蛋白纯化图。其中，A为蛋白质紫外吸收曲线，B为电导率曲线；横坐标为洗脱时间，左边纵坐标为280nm蛋白质紫外吸收值（AU）及洗脱缓冲液浓度（％），右边纵坐标为电导值（Conductivity，mS/cm)。
表1为米曲霉HML366发酵酶液的纯化过程，其中阴离子交换层析纯化回收率为61.2％，纯化倍数为14.4，比活力为9.65U/mg。
表1
米曲霉发酵酶液提取物的性能测定
（1）米曲霉发酵酶液提取物的分子量测定
将上述米曲霉发酵酶液提取物成品通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，依照Laemmli(1970)的方法，以12%分离胶，4%浓缩胶，电泳缓冲液为pH8.3Tris–glycine缓冲液，考马斯亮兰R250染色；出现的是单一条带，说明酶蛋白已经达到电泳纯，SDS-PAGE电泳分析表明分子量为48kDa。参见附图2为本发明的米曲霉发酵酶液提取物的SDS-PAGE电泳图，其中1为本发明的米曲霉发酵酶液提取物，2为发酵原液，M为分子量标准蛋白质标记（Marker）。
（2）米曲霉发酵酶液提取物的葡聚糖外切酶及葡聚糖内切酶酶活快速检测
葡聚糖外切酶的酶活快速检测：0.04%4-甲基伞形葡萄糖苷，0.6%琼脂糖溶液倒上层，30℃反应10min，302nm紫外灯下照射，有葡聚糖外切酶活性的蛋白带有白色荧光产生，挑选有白色荧光的酶检测其是否具有β-葡萄糖昔酶活性，如果没有则证明可能为具有葡聚糖外切酶活性。参见附图3为米曲霉发酵酶液提取物的葡聚糖外切酶酶活快速检测效果图，可以观察到使用0.04%4-甲基伞形葡萄糖苷快速检测葡聚糖外切酶，302nm紫外灯下照射，有葡聚糖外切酶活性的蛋白带有白色荧光产生（点1，3）。
葡聚糖内切酶的酶活快速检测：用pH为5的50mmol/L乙酸钠缓冲液溶解羧甲基纤维素钠，浓度为1％，用CMCNa溶液浸泡蛋白电泳胶块30℃下反应30min，用0.2%刚果红染色20min，1mol/L的NaCl脱色，有葡聚糖内切酶活性的蛋白带有透明圈。参见附图4为米曲霉发酵酶液提取物的葡聚糖内切酶酶活快速检测效果图，其中点1、2、3、5、6、7为葡聚糖内切酶活水解羧甲基纤维素钠底物后产生的透明圈，证明本发明的提取物具有葡聚糖内切酶酶活性。
（3）米曲霉发酵酶液提取物的酶活及酶学性质测定
葡聚糖外切酶的酶活的测定：对硝基苯酚含量的测定取0.2mL用0.05mol/LpH4.8的柠檬酸缓冲液配制的0.005%的对硝基苯酚(pNPC)溶液，加入0.2mL适当稀释的酶液，补加柠檬酸缓冲液0.6mL。于50℃反应30min后，加入1.0mL1.0%Na2C03试剂终止反应，于410nm比色。以沸水灭酶活5min的酶液作空白消零。以每分钟水解产生1μmol的对硝基苯酚的酶力量定义为1个酶活单位（U）。每个样品三次重复，然后取平均值。
葡聚糖内切酶的酶活测定：0.02mol/L的pH4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制1﹪羧甲基纤维素钠为底物，测定内切葡聚糖酶活力。将1mL1％（w/v）羧甲基纤维素钠置于50℃的水浴锅中预热5min，加入0.05mL适当浓度酶液，50℃保温反应30min；待反应结束后，立即加入3mL的DNS试剂,补足去离子水定容10mL体积，沸水浴5分钟，用自来水冷却至室温，测540nm下的吸光值，依据葡萄糖标准曲线计算反应产生的葡萄糖浓度确认酶活，每分钟产生1μmol葡萄糖的酶量为1个酶活单位（U）。
以该实验项目某一个条件下的最高酶活为100℅，其他条件下酶活性与最高酶活性的比值即为相对酶活。
提取物酶最适pH和pH稳定性实验：在30℃条件下，将酶与pH2.5～11的缓冲液混合：柠檬酸磷酸缓冲液(pH2.5～6.0)，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0～7.0)，Tris-HCl缓冲液(pH7.0～pH9.0)，甘氨酸–NaOH缓冲液(pH9.0～11.0)，测定酶活确定酶作用的最适pH值。将酶保存于不同pH值的缓冲液中30℃放置24h后，在最适pH值和最适温度下测定酶活确认酶稳定性。
提取物酶最适温度和热稳定性实验：最适pH条件下，测定30℃～70℃条件下提取物酶酶活确认最适作用温度；最适pH条件下，将酶置于30℃～90℃恒温水浴保持60min后测定其残余酶活力确认酶温度稳定范围。
金属离子对提取物酶活的影响：将10mmol/L的不同的金属离子与酶液混合，30℃保温60min，在最适pH值和最适温度下测定相对酶活。
参见附图5及附图6可知，纯化酶最适作用温度为为和50℃，在60℃以下酶稳定性较好，60℃保温1h可以保持80%酶活力，耐热性和其他耐热性菌种接近；在pH5.0时酶活最高，在pH3.0-pH10.0范围内稳定，pH3.0时酶活保留78％，pH4.0时酶活保留92％，pH10.0酶活保留77％。
表2为金属离子对纯化米曲霉HML366葡聚糖外切酶活的影响，表中数据表明Co2＋、Hg2+、Ag+和Cu2+对HMLCBH1有强烈的抑制作用，而Mn2+、Mg2+、Ca2+和Fe3+对酶的激活作用明显。
表2
（4）米曲霉发酵酶液提取物的飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）鉴定蛋白
在SDS-PAGE电泳结束后，剪下纯化的纯化木聚糖酶条带，送上海基康生物技术有限公司飞行时间质谱(4700ProteomicsAnalyzer，AppliedBiosystems，USA）扫描分析后获得肽片段的指纹图谱，将获得的混合物肽片段质量数据使用Mascot软件在SWISS－PROT数据库上查询鉴定纯化酶。
参考附图7及图8，其中：图7为HMLCBH1经胰蛋白酶消化后的飞行时间质谱分析；图8为飞行时间质谱结果。经Mascot检索比对米曲霉发酵酶液提取物和蛋白gi:22138643得到了匹配，为纤维二糖水解酶D。由附图7及图8可知，米曲霉基因已经完成全长测序，飞行时间质谱后Mascot检索比对米曲霉基因数据库，纯化米曲霉发酵酶液提取物和蛋白gi:22138643得到了匹配，可信度高，为纤维二糖水解酶D，等电点为4.36，分子量48072.6Da，得到的蛋白质分子量和SDS-PAGE电泳结果相吻合。
米曲霉发酵酶液提取物的氨基酸序列表为：
MHQRALLFSAFWTAVQAQQAGTLTAETHPSLTWQKCAAGGTCTEQKGSVVLDSNWRWLHS60
VDGSTNCYTGNTWDATLCPDNESCASNCALDGADYEGTYGVTTSGDALTLQFVTGANIGS120
RLYLMADDDESYQTFNLLNNEFTFDVDASKLPCGLNGAVYFVSMDADGGVAKYSTNKAGA180
KYGTGYCDSQCPRDLKFINGQVRKGWEPSDSDKNAGVGGHGSCCPQMDIWEANSISTAYT240
PHPCDDTAQTMCEGDTCGGTYSSERYAGTCDPDGCDFNAYRMGNESFYGPSKLVDSSSPV300
TVVTQFITADGTDSGALSEIKRFYVQGGKVIANAASNVDGVTGNSITADFCTAQKKAFGD360
DDIFAQHGGLQGMGNALSSMVLTLSIWDDHHSSMMWLDSSYPEDADATAPGVARGTCEPH420
AGDPEKVESQSGSATVTYSNIKYGPIGSTFDAPA454
米曲霉发酵酶液提取物的序列功能分析表明，米曲霉发酵酶液提取物的149个氨基酸残基具有葡聚糖外切酶CBH1活性(celluloseCBH1)，米曲霉发酵酶液提取物的385个氨基酸残基具有葡聚糖内切酶活性（endoglucanase），飞行时间质谱还检测到两个氨基酸片段为为编号为SMAC09043的假设蛋白（hypotheticalproteinSMAC09043），参见附图9及10。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。
<110>河池学院
<120>一种米曲霉发酵酶液的提取物及其应用
<160>1
<210>1
<211>454
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
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Claims (10)

1.一种米曲霉发酵酶液的提取物，其特征在于，所述提取物是由米曲霉HML366通过下述步骤制备得到：
（1）将米曲霉HML366的PDA斜面菌种制成孢子液，取孢子液中孢子于纤维素酶复筛固体培养基中，30℃恒温培养5-8天；
（2）在步骤（1）所得培养物中加入150-250mL无菌重蒸水，40℃恒温水浴1-2小时，然后浸提、过滤并离心得到粗酶液；
（3）收集步骤（2）所得粗酶液中的上清酶液，使用纤维素超滤柱将所述上清酶液浓缩，再使用阴离子交换层析纯化，得到成品。
2.根据权利要求1所述的米曲霉发酵酶液的提取物，其特征在于，步骤（1）中，所取孢子液中孢子的个数为105-108个。
3.根据权利要求1所述的米曲霉发酵酶液的提取物，其特征在于，步骤（1）所述纤维素酶复筛固体培养基为：12g蔗渣，8g麸皮，60mLMandels营养盐液。
4.根据权利要求1所述的米曲霉发酵酶液的提取物，其特征在于，步骤（2）所述离心的转速为4500-5500r/min，时间为10-30min。
5.根据权利要求1所述的米曲霉发酵酶液的提取物，其特征在于，步骤（3）中，使用纤维素超滤柱将上清酶液浓缩，浓缩至原来上清酶液1/5体积。
6.根据权利要求1或5所述的米曲霉发酵酶液的提取物，其特征在于，所述纤维素超滤柱为3000Da纤维素超滤柱。
7.根据权利要求1所述的米曲霉发酵酶液的提取物，其特征在于，步骤（3）中，使用阴离子交换层析，压力为580psi，以pH8.3的0.01mol/LTris-HCl为起始缓冲液，在所述起始缓冲液中添加1mol/L的NaCl为洗脱缓冲液，纯化至NaCl摩尔浓度为0.27mol/L时，得到成品。
8.根据权利要求1所述的米曲霉发酵酶液的提取物，其特征在于，步骤（3）所述浓缩、纯化均在2~4℃进行。
9.一种含有权利要求1所述的米曲霉发酵酶液提取物的组合物。
10.根据权利要求1所述的米曲霉发酵酶液提取物或权利要求8所述的组合物在降解植物纤维素中的应用。
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