CN102918200A - 用于酶促水解的改良的处理生物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是处理包含全纤维素的原料的方法。所述方法包括将原料与包含纤维素结合结构域的溶液混合以形成混合物。然后使混合物经历足以减少全纤维素的结晶度的条件。随后酶促水解可相比不采用所述过程的方法显示改善的速度和/或可发酵的糖产率。

Description

用于酶促水解的改良的处理生物质的方法
【相关申请的交叉引用】
为美国专利实践的目的，将2009年12月4日提交的美国临时申请No.61/266,618的内容以无不一致的程度通过引用整体并入本文。
【技术领域】
本发明涉及改良的在酶促水解之前使用，例如，包含纤维素结合结构域的溶液处理包含全纤维素的原料的方法。
【背景技术】
纤维素到葡萄糖的酶促水解经最近10年获得了增加的兴趣，及对经济上可持续的生物燃料的增长的需求指向对在它们的产生中减少成本的紧急需求。纤维素，被许多植物制造的多糖，是地球上最丰富的有机化合物之一，由此代表用于生物燃料工业的潜在金矿。但是，当前纤维素的酶促降解面对阻止其用于产生，例如，经济上竞争性的生物燃料的广泛利用的主要问题。该问题可包括，例如，低反应和/或转变速度。
【发明概述】
有利地，发明人发现了实现上述的目标和更多的方法和组合物。总而言之，本发明中在一实施方式中涉及处理包含全纤维素的原料的方法。所述方法包括将原料与包含纤维素结合结构域的溶液混合以形成混合物。然后使混合物经历足以减少全纤维素的结晶度的条件。随后酶促水解可显示相比不采用CBD处理过程的方法改善的速度和/或可发酵的糖产率。
【附图说明】
图1例证自瑞氏木霉（Trichoderma reesei）纯化的cel7A和木瓜蛋白酶切割之后的cel7A催化性结构域的SDS-PAGE凝胶。
图2例证CBD处理之后微晶纤维素的酶促水解。
图3例证各种CBD温育时间的效应。
图4显示相比CBD温育（13h）缓冲剂温育对水解速度的效应。
图5显示缓冲剂温育时间对水解速度的效应。
图6显示CBD浓度优化实验的结果。
图7显示各种CBD处理时间的水解。
图8显示各种CDB浓度的效应。
图9显示连续添加和CBD去除的效应。
图10显示45℃处理的效应。
图11显示50℃处理的效应。
图12显示用CBD处理，用缓冲剂处理，无用同时添加CBD处理，及无处理（干样品）之后使用纤维素酶和β-葡萄糖苷酶自柳枝稷产生的还原端的量。
图13显示纤维素酶的木瓜蛋白酶切割之前及之后的SDS-PAGE。
图14显示用CBDCel7A（自纯化的Cel7A的纤维素-结合结构域），CDCel7A（催化性结构域）或缓冲剂处理的微晶纤维素样品的XRD谱。
图15a显示用CBD的混合物于42℃预处理15h之后微晶纤维素的水解特征。
图15b显示用CBD的混合物于42℃预处理15h之后纤维状纤维素（FC）的水解特征。
图16显示用CBDCel7A于42℃预处理15h之后微晶纤维素的水解特征。
图17显示在预处理步骤（于42℃15h）中各种CBD浓度对水解速度的效应。
图18显示用CBD的纤维素预处理期间搅棒对水解速度的效应。
图19显示可在本发明中有用的各种CBD的氨基酸序列。
【发明详述】
总而言之本发明中在一实施方式中涉及处理包含全纤维素的原料的方法。所述方法包括将原料与包含纤维素结合结构域的溶液混合以形成混合物。然后使混合物经历足以减少全纤维素的结晶度的条件。随后酶促水解可相比不在随后水解之前采用CBD处理过程的方法显示改善的速度和/或可发酵的糖产率。有利地，水解的组合物中的可发酵的糖和/或水解速度可为至少约10%，或至少约15%，或至少约20%，多于不采用纤维素结合结构域的可比较的方法。产生一种或更多可发酵的糖诸如葡萄糖的水解之后，可采用过程诸如发酵来产生，例如，生物乙醇。
【包含全纤维素的原料】
只要原料包含全纤维素，在本方法和组合物中采用的原料的性质不是特别关键。如本文所用，"全纤维素"是指生物质的至少部分水不溶性碳水化合物部分，即，不是木质素，提取物或灰，而是，包括物质诸如多糖的生物质部分。全纤维素的精确的组合物可依赖于采用的特定原料而改变。但是，在本文有用的全纤维素一般包含各种量的纤维素诸如α-纤维素和半纤维素，且可含有各种戊聚糖或己聚糖聚合物。由此，实际上是可采用包含纤维素的任何木质纤维素生物质作为在本发明的方法和组合物中的原料。本发明可有利地在包含纤维素的结晶度需要减小的纤维素的组合物上采用。
在一实施方式中特别可优选的原料是植物生物质。生物质为许多不同类型，其可分组为少数主要类别：木或林业残留物，包括锯木厂和造纸厂废物，城市造纸废浆，藻，农业残留物，包括玉米秸杆（秸秆和稻草），及甘蔗蔗渣，及专用的能源作物，其通常由快生长的高的、木质草诸如，例如，柳枝稷组成。上述的任何可在本发明中使用。特别可优选的生物质包含具有高纤维素含量的生物质。
依赖于原料的性质，其可期望减小至少部分其尺寸以便暴露额外的处理用表面积。该减小可以任何方便的方式诸如通过研磨，插枝，切断，等进行。期望的原料尺寸改变依赖于本发明的成分和其他特效物的类型。一般而言，更小尺寸原料可更快反应，但花费更多来产生。一般而言，如果在CBD处理之前和/或水解之前原料减少是有利的。
类似地，在一些情况中首先纯化至少部分原料是常常有利的，或可甚至是必需的。纯化意指部分清洁，以便去除可负面地影响下游过程的至少一些混杂物。此纯化可辅助减少或消除下列步骤中任何不期望的反应。纯化类型会依赖于原料来源，以及，杂质的量和性质及会经历下列步骤。常常，木质纤维素原料的简单洗涤就足够。该纯化，如果进行，可在任何尺寸减小之前，伴随，或之后实现。此外，如果需要或有利，可分离不包含全纤维素的至少部分或全部原料。但是，此对于组合物会可能经历的许多过程和条件不是必要的。
【纤维素结合结构域(CBD)】
本文采用的纤维素结合结构域一般源于纤维素酶。纤维素酶是催化1,4-β-D-糖苷键的水解的不同结构的糖基水解酶。多数纤维素酶包含3个结构域：（1）主要作为水解座位的催化性结构域，（2）常常辅助将全酶锚定到纤维素表面和/或将纤维素纤维定向到含有活性位点的隧道的纤维素-结合结构域，及（3）连接2个其他结构域和常常提供它们之间的足够的空间分离的糖基化的柔性的接头。接头也可辅助允许持续运动和/或辅助能量存储。
如本文所用，术语"纤维素结合结构域"或"CBD"是包括上述的（2）的实质性部分，但缺乏（1）的多数或全部实质性部分的部分纤维素酶。该纤维素结合结构域在一些实施方式中包括全部或至少部分接头（3），而在其他实施方式中接头（3）被修饰或自采用的纤维素结合结构域缺失。由此，用于本文使用的有用的CBD可常常通过以方便的方法诸如，例如，蛋白水解切割来切割CBD及，如果需要，来自纤维素酶的接头而从纤维素酶得到。依赖于切割方法，CBD可然后以方便的方式诸如，例如，过滤来回收。在一些实施方式中，纤维素结合结构域和催化性结构域的比是大于1:1，或大于2:1，或大于3:1，或大于5:1，或大于10:1。
采用的纤维素结合结构域的性质和类型不是特别关键的，只要它们以一些方式发挥减少纤维素的结晶度和/或辅助任何进一步处理诸如水解的功能。适合的CBS可源于由如下物种产生的适合的酶，如，例如，木霉属（Trichoderma）物种诸如瑞氏木霉（T.reesei），绿色木霉（T.viride），以及，例如，黄孢原毛平革菌（Phanerochaetechrysosporium），特异腐质霉（Humicola insolens），灰盖鬼伞（Coprinopsis cinerea），解纤维支顶孢（Acremonium cellulolyticus），红褐肉座菌（Hypocrea jecorina），Penicillium occitanis，乳色耙菌（Irpex lacteus），棘孢青霉（Penicillium echinulatum），埃杜拉香菇（Lentinula edodes），斜卧青霉（Penicillium decumbens）。
在一实施方式中，纤维素结合结构域源于纤维二糖水解酶I（cel7A），诸如由，例如，木霉属（Trichoderma）物种如瑞氏木霉（Trichoderma reesei）产生的。在另一实施方式中，纤维素结合结构域源于纤维二糖水解酶II（cel6A）。在其他实施方式中，纤维素结合结构域来源于，例如，下表5中的酶。在另一实施方式中，采用的纤维素结合结构域可为上述的2种或更多的混合物。
自瑞氏木霉（Trichoderma reesei）的纤维素酶的纤维素-结合结构域（CBD）（属于家族I CBD）形成楔-样折叠，其中平面提供与晶体纤维素强烈相互作用的关键（芳族）残基。可采用如下例中那些描述的该方法。此外，本公开的益处，本领域技术人员可采用其他物质的常规测试来鉴定有用的物质。替代性地或额外地，可对CBD进行蛋白加工。可然后开发CBD上的特定残基的突变（诸如在与纤维素结合或相互作用中涉及的那些和/或可实现更快的水解速度的任何），以开发剪裁为，例如，特定原料和/或处理条件的CBD。
【原料与包含纤维素结合结构域的溶液的混合】
包含纤维素结合结构域的溶液可以任何方便的方式制造及与原料混合。包含纤维素结合结构域的溶液的浓度依赖于特定原料，溶液的其他成分诸如缓冲剂，及待采用的条件而改变。一般而言，其应具有至少足以在处理条件减少纤维素的结晶度，但不高到干扰任何随后期望的处理步骤诸如水解的浓度。一般而言，至少约5，或至少约10，或至少约15达至多约100，或至多约75，或至多约55，或至多约45，或至多约35μg/ml的浓度可有效。也可在溶液中采用适合的缓冲剂，如果需要。采用与CBD协同作用至甚至还辅助减小纤维素的结晶度的缓冲剂可为有利。适合的缓冲剂常常包括低级烷基的酸诸如乙酸的盐或酯，和一般具有约4.5～约5.5的pH。在一实施方式中，溶液包含约25～约75mM的浓度的乙酸钠缓冲剂。
【CBD处理条件】
一旦制造包含一种或更多原料与包含纤维素结合结构域的溶液的混合物，然后使混合物经历足以减少全纤维素的结晶度和/或辅助随后水解的条件。这些条件可改变广泛依赖于原料的性质和类型和包含纤维素结合结构域的溶液中成分的类型和量。
一般而言，使混合物经历增加的温度经足以减少全纤维素的结晶度的时间。该温度改变，但可为至少约30℃，或至少约35℃达至多约60℃，或至多约50℃，或至多约45℃。一般而言，采用的温度越高，混合物必需加热的时间越短，且反之亦然。在之前描述的温度，使混合物经历增加的温度的适合的时间是至少约8小时，或至少约10小时，或至少约12小时，或至少约14小时，达至多约48小时，或至多约24小时，或至多约16小时。使用本公开，本领域技术人员可使用常规实验来测定用于特定原料和组合物的适当的时间和温度。
不限制于任何特定理论，认为纤维素结合结构域和类似蛋白减少结晶度程度，由此致使纤维素欠反抗酶攻击。本发明的上述的过程可单独或与其他技术组合使用，以降低结晶度到期望的水平。该技术可在本发明的方法之前，期间或之后使用，且包括，例如，(热)化学和/或机械技术（例如用磷酸,离子液体或有机溶剂,AFEX和球磨机研磨处理）。在一些实例中，纯化在水解步骤（例如用离子液体）之前可有益。在一些实例中，使混合物经历足够的搅拌使得基本上全部固体悬浮可为有利。例如，在一些实例中，使混合物经历在瓶中用搅棒，优选剧烈搅拌。在一些实施方式中，搅棒具有瓶内径的至少约45%，优选至少约50%，优选至少约55%的直径。
在另一实施方式中，本发明属于在例如，纤维素水解过程中的预处理步骤中使用包含纤维素结合结构域的溶液或组合物。包含纤维素结合结构域的溶液或组合物如以上及以下描述。类似地，预处理步骤如所述，即，首先将全纤维素原料与包含纤维素结合结构域的溶液或组合物混合以形成混合物，然后使混合物经历足以减少全纤维素的结晶度的条件。特定成分，条件，等可如在本文别处描述。
【实施例1～8】
【用于微晶纤维素的CBD处理的一般过程】
纤维二糖水解酶I（cel7A）是作为自还原端侧攻击纤维素链的外切葡聚糖酶的纤维素酶混合物的组分。下列发明的例采用自此酶，及更特别自瑞氏木霉（Trichoderma reesei）（例如，生物乙醇产生中通常使用的生物）的cel7A的纤维素-结合结构域（CBD）。研究CBD对纤维素的效应，即在包含CBD的溶液中纤维素温育，即，处理，对结晶度程度，及随后对用CBD-处理的纤维素进行的反应的酶促水解速度的结果。
Cel7A是由3个结构域构成：纤维素-结合结构域（CBD），催化性结构域（CD）、和接合CBD和CD的高度糖基化的接头。实施例涉及：
（1）经使用木瓜蛋白酶（半胱氨酸蛋白酶）的片段（加接头）自CD的蛋白水解切割由cel7A产生CBD；
（2）经过滤通过30kDa膜回收CBD（CBD+接头～61个残基;理论尺寸～6kDa;自实验估计的尺寸～14kDa，由于接头的O-糖基化;CD的估计的尺寸～50kDa，由于N-糖基化）；
（3）用包含CBD的溶液温育，即，处理，纤维素（微晶纤维素）；以及
（4）添加纤维素酶混剂（自瑞氏木霉（Trichoderma reesei））及监控水解速度（经葡萄糖含量）。
【用于CBD产生的一般过程】
在对自在例如，P.Tomme et al,Eur.J.Biochem.,1988,170,575-581中使用的核心蛋白的CBD切割过程之后，在下列条件下采用木瓜蛋白酶来进行蛋白水解消化：
1．在50mM NH4OAc缓冲剂pH6.0中于30℃活化木瓜蛋白酶30min；
2．将木瓜蛋白酶于30℃添加到cel7A溶液（在50mM NaOAc缓冲剂中,pH5.0），木瓜蛋白酶/cel7A比是1:5（w/w,v/v）；
3．于30℃搅拌2h；以及
4．通过30kDa膜过滤反应混合物（以4000rpm，15min），以在滤出液中收集纤维素结合结构域（附接于接头）。
切割反应发现在2h之后完成，且无法通过SDS-PAGE可检测残留cel7A（～64kDa），如显示于图1。反应导致形成单强条带，其具有～50kDa的分子量。木瓜蛋白酶成功地自核心蛋白（CD）切割下CBD+接头；但是，未通过SDS-PAGE检测到此小蛋白片段（～14kDa）（序列显示可用通常使用的考马斯染料-染色反应的非常少残留物）。但是，经微BCA蛋白测定（双金鸡宁酸）在滤出液中检测到CBD（<30kDa）（表1,100%回收）。
表1．木瓜蛋白酶切割之后的Cel7A片段回收
 蛋白片段   总质量(mg)
 Cel7A（+木瓜蛋白酶）反应之前   4.6mg
 过滤通过膜之后的CD(+木瓜蛋白酶)浓缩物>30kDa   3.8mg
 过滤通过膜之后的CBD滤出液<30kDa   0.6mg
 预期的CBD(自64kDa的~10～14kDa)   0.6～0.9mg
【实施例1A：用包含纤维素结合结构域（CBD）的溶液处理微晶纤维素和经X-射线衍射测量结晶度】
不束缚于任何特定理论，认为CBD的活性涉及纤维素的非-水解性分裂及纤维素中氢-键合网络的减弱及分裂。下列调查确定是否活性对于减小纤维素结晶度足够强。
用CBD溶液（如上述获得的）处理微晶纤维素，及随后经X-射线衍射使用我们最近开发的在例如，Bansal et al.,Multivariatestatistical analysis of X-ray data from cellulose:A new method todetermine degree of crystallinity and predict hydrolysis rates.Bioresource Technol,101,4461-4471中描述的分析方法测定回收的纤维素的结晶度的程度。
如下进行纤维素处理步骤：将CBD溶液（50mM NaOAc缓冲剂,pH5）中的微晶纤维素（20mg/ml）于37℃搅拌2天。将混合物以4000rpm离心15min，并将回收的纤维素冷冻干燥。通过以上所述的X-射线衍射方法分析粉。
微晶纤维素是具有约60%的平均结晶度的微晶纤维素。用CBD溶液处理之后，观察到微晶纤维素结晶度的显著减小，如显示于下表2。用对应于自在7ml缓冲剂中3.3mg cel7A的切割获得的4.7ml的滤出液的样品4获得最高13%的减小。
表2．与纤维素-结合结构域（CBD）或催化性结构域(CD)温育（2天）之后微晶纤维素的结晶度（CrI）程度
Figure BDA00001904761600091
＊样品1～4涉及不同实验。1和2以低CBD浓度运行，3～4以更高CBD浓度运行
【实施例1B：实施例1A的CBD处理的样品的酶促水解】
将相比未处理的微晶纤维素显示显著更低结晶度值的纤维素样品（3和4,表2）使用自瑞氏木霉（Trichoderma reesei）的纤维素酶混剂（补充了β-葡萄糖苷酶来防止产物抑制）交付于酶促水解。在水解之前用CBD溶液处理的样品观察到速度的显著增加，经反应过程总体速度相比未处理的微晶纤维素2倍更高，如显示于图2。由此，用CBD溶液处理微晶纤维素之后观察到的结晶度减小与对酶促攻击降低的反抗，由此更快的葡萄糖转变良好关联。
【测量各种CBD处理条件的效应的一般过程】
下列显示各种CBD处理条件对水解速度的效应。随着结晶度显示减小，未进行额外的结晶度测量，由此在CBD处理时间过后将纤维素酶直接添加到反应混合物，即在调查水解速度之前未冷冻干燥样品，也不进行缓冲剂更换或溶液稀释。如下进行连续CBD处理和水解过程：
1．于37℃经各种时间长度将微晶纤维素与CBD溶液温育；
2．温度变化到50℃；
3．添加纤维素酶混剂和β-葡萄糖苷酶及于50℃搅拌；以及
4．以各种时间间隔取用于葡萄糖定量的反应混合物等份。
【实施例2：温育时间，CBD浓度和缓冲剂对水解速度的效应】
为了发现更多会导致水解速度更高增加的最佳CBD处理时间，导致13%结晶度减小的48h温育时间（见以上）改变自8h～24h和检查酶促水解速度。贯穿这些实验使用一种单CBD溶液，从而它们以恒定CBD浓度（～42μg/ml）进行。于37℃温育8h和13h之间获得CBD的正面效应。超过13h，未观察到速度的进一步增加，如显示于图3。依赖于温育时间，观察到葡萄糖含量最大20～25百分点差异（对应于在8h及≥13h CBD处理时间之间速度的50～60%增加）。
但是，缓冲剂中的温育也发现具有对水解速度的正面效应。尽管相比与CBD溶液温育更低转变，在缓冲剂中温育13h的样品的转变相比在缓冲剂中1h温育之后更高，如显示于图4。当CBD处理的样品的转变相比缓冲剂-处理1h的样品（1h水解之后）达2倍更高，CBD处理13h的样品和缓冲剂处理13h的样品之间的差异欠显著（1.3～1.4倍更高）。
缓冲剂对水解速度的效应显示为时间-依赖性，但是在缓冲剂中13h和48h的温育之间未观察到主要差异，尽管温育24h导致最高速度，如显示于图5。有趣的是，水温育（18h）显示对速率的正面效应（相比在缓冲剂中1h温育更高转变），但是，相比在缓冲剂中以类似温育时间欠显著。怀疑pH转移，由于水具有5.5的pH，相比缓冲剂的pH（50mM NaOAc pH5）高0.5U。
然后对分别在仅缓冲剂和仅水中预温育的纤维素样品进行结晶度测量。于37℃温育24h之后观察到相比未处理的微晶纤维素无显著变化（除了结晶度轻微增加达63%之外,其在许多情况中与速度增加无关）。
接下来，CBD浓度自参照体积开始改变（添加到反应混合物的Vr,对应于24μg/ml的最终CBD浓度）。检查更高浓度（达4Vr）和更低浓度（低至0.14Vr）。总体上，CBD的效应相比之前实施例欠显著，如显示于图6。
用0.28Vr获得最高速度，然而更低和更高浓度（0.14Vr和4Vr分别）导致更低转变。以更高CBD转变，其中酶添加以进行水解的纤维素由于多结合的CBD的存在而具有在纤维素表面可利用的更少结合斑点，发生CBD和纤维素酶之间的竞争性吸附。在0.5和2Vr之间未发现主要差异。最低CBD浓度（0.14Vr）表现得与水近似，及最高CBD浓度（4Vr）表现得与缓冲剂近似。
【实施例3～8的CBD的CBD产生】
在实施例3～6中采用的CBD如下制造：从自瑞氏木霉（Trichoderma reesei）的纤维素酶的混合物得到Cel7A，并利用阴离子交换柱层析使用HiPrep Q FF柱纯化。通过蛋白水解使用木瓜蛋白酶切割纯化的蛋白，和通过离心经过30kDa膜从催化性结构域分离纤维素结合结构域（附接于接头），并收集进浓度125～175μg/ml的滤出液。
【实施例3：CBD处理时间的效应】
在缓冲剂（NaOAc 50mM pH5.0）中与CBD（24μg/ml）一起于37℃，并在轻轻搅拌下，在24ml玻璃瓶中温育微晶纤维素（20mg/ml）。经各时期（8h,13h,24h和48h）研究处理的效应。
通过将纤维素酶（24μl/ml,3.4mg/ml总蛋白,3.8FPU/ml）和β-葡萄糖苷酶（15U/ml）添加到混合物和于50℃进行反应来对CBD处理的微晶纤维素（20mg/ml）进行纤维素水解。通过DNS测定以各间隔（1h,2.5h和4h）监控葡萄糖产生。对照为干微晶纤维素（无CBD处理）及仅在缓冲剂中温育（1h,13h和48h）的样品。
在缓冲剂中温育发现对水解有益，由于相比对干纤维素水解，已在1h温育之后获得更高葡萄糖浓度。在13h温育之后效应更显著，及达48h无获得进一步增加。CBD中微晶纤维素的温育相比缓冲剂单独（20～35%）给惊人及预料不到的增加。CBD处理在13h温育之后达到最大效应。结果显示于图7。
【实施例4：CBD浓度的效应】
在缓冲剂（NaOAc 50mM pH5.0）中，与各种浓度（3.4,6.9,12,24,48和96μg/ml）的CBD一起，于37℃及，并在轻轻搅拌下在24ml玻璃瓶中温育微晶纤维素（20mg/ml）18h。通过将纤维素酶（24μl/ml,3.4mg/ml总蛋白,3.8FPU/ml）和β-葡萄糖苷酶（15U/ml）添加到混合物和于50℃进行反应来对CBD处理的微晶纤维素（20mg/ml）进行纤维素水解。以各间隔（1h,2.5h和4h）通过DNS测定监控葡萄糖产生。CBD温育对纤维素水解的效应发现以7μg/ml更佳，达48μg/ml，然而更高浓度给更低葡萄糖产生的增加，尤其以96μg/ml，其中处理相比在仅缓冲剂中欠有效。结果显示于图8。
【实施例5：连续添加的效应】
将微晶纤维素（30mg/ml）在缓冲剂（NaOAc 50mM pH5.0）中，于37℃并在轻轻搅拌下在24ml玻璃瓶中温育18h，之后是添加相同的缓冲剂中的CBD溶液（48μg/ml），对应于20mg/ml的微晶纤维素终浓度。将混合物再于37℃搅拌12h。
通过将纤维素酶（24μl/ml,3.4mg/ml总蛋白,3.8FPU/ml）和β-葡萄糖苷酶（15U/ml）添加到混合物和于50℃进行反应来进行对CBD处理的微晶纤维素（20mg/ml）的纤维素水解。以各间隔（1h和2.5h）通过DNS测定监控葡萄糖产生。
在仅缓冲剂中第1温育之后CBD的连续添加导致相比同时在缓冲剂中温育和CBD添加更高转变。此效应在更高转变程度更显著（相比在2.5h水解之后在仅缓冲剂中温育约35%更高葡萄糖产生）。结果与实施例6的结果一起显示于图9。
【实施例6：CBD去除的效应】
将微晶纤维素（20mg/ml）在缓冲剂（NaOAc 50mM pH5.0）中，与各种浓度（6.9和48μg/ml）的CBD一起于37℃并在轻轻搅拌下，在24ml玻璃瓶中温育18h。通过加热在1.1%SDS溶液中纤维素（通过离心回收的），之后是用EtOH（75%）和水多次洗涤来去除吸附到纤维素的CBD。
通过将纤维素酶（24μl/ml,3.4mg/ml总蛋白,3.8FPU/ml）和β-葡萄糖苷酶（15U/ml）添加到在缓冲剂（NaOAc 50mM pH5.0）中纤维素（20mg/ml）的溶液和于50℃进行反应来对CBD处理的及洗涤的微晶纤维素进行纤维素水解。以各间隔（1h和2.5h）通过DNS测定监控葡萄糖产生。
CBD去除过程对纤维素水解具有有害效应，由于产生的葡萄糖量显著少于用未去除CBD处理之后获得的，及稍微少于在仅缓冲剂中温育之后获得的。结果与实施例5的结果一起显示于图9。
【实施例7：温育温度的效应】
将微晶纤维素（20mg/ml）在缓冲剂（NaOAc 50mM pH5.0）中与各种浓度（24和48μg/ml）的CBD一起和温度（45和50℃）并在轻轻搅拌下在24ml玻璃瓶中温育24h。
通过将纤维素酶（24μl/ml,3.4mg/ml总蛋白,3.8FPU/ml）和β-葡萄糖苷酶（15U/ml）添加到混合物和于50℃进行反应来进行对CBD处理的微晶纤维素（20mg/ml）的纤维素水解。以各间隔（1h,2.5h和4h）通过DNS测定监控葡萄糖产生。
用CBD于45℃处理导致相比37℃更高葡萄糖产生，然而50℃显示相比45℃更低葡萄糖产生。于50℃，CBD浓度效应不同于在37℃的；以24μg/ml的CBD温育相比以48μg/ml的欠有效。此外，以48μg/ml的CBD温育相比于45℃进行欠良好。结果显示于图10和11。
【实施例8：用CBD的柳枝稷处理】
将基于自来自瑞氏木霉（Trichoderma reesei）的纤维二糖水解酶I（Cel7A）的纤维素-结合结构域（CBD）的处理应用于木质纤维素材料（柳枝稷），之后是将纤维素酶添加到CBD处理混合物而进行水解。此导致相比在水解之前不用CBD处理（"干样品"），木质纤维素酶促水解的增加，如作为经时产生的还原端的量测量。
简言之，将柳枝稷（20mg/ml）在补充了CBD（24μg/ml）的乙酸钠缓冲剂（pH5.0,50mM）中，并在轻轻搅拌下，在24ml玻璃瓶中于45℃温育16h。通过将纤维素酶（24μl/ml,3.4mg/ml总蛋白,3.8FPU/ml）和β-葡萄糖苷酶（15U/ml）添加到混合物和于50℃进行反应来对CBD-处理的柳枝稷（20mg/ml）进行水解。通过以各间隔（1h,2.5h,4h和6h）使用DNS测定测量经时产生的还原端的量（作为葡萄糖当量）来研究CBD处理的效应。对照为干柳枝稷（无CBD处理），同时添加CBD和纤维素酶的干柳枝稷及在仅缓冲剂中温育（16h）的样品。
发现在缓冲剂中温育对于水解稍微有益，如在16h温育之后相比对干柳枝稷水解获得更高还原端浓度（在1h转变之后最大25%增加）。当CBD在温育混合物中存在时效应更显著得多（在2.5h转变之后相比干样品还原端浓度达65%增加）。在用CBD温育柳枝稷16h之后，在2.5h转变之后还原端浓度相比在单独缓冲剂（40～45%）中温育之后获得的呈现实质性增加。同时添加CBD和纤维素酶相比干样品未产生任何转变差异。结果显示于图12。
【实施例9：微晶纤维素和自棉绒的纤维状纤维素的CBD处理】
微晶纤维素PH-101，自棉绒的纤维状纤维素（Sigma C6288,培养基），自瑞氏木霉（Trichoderma reesei）的纤维素酶（159FPU.mL-1），及β-葡萄糖苷酶（自杏仁,2.32U.mg-1）获自Sigma（St Louis,MO,USA）。（微）BCA蛋白检定试剂盒和考马斯（Bradford）蛋白检定试剂盒获自Thermo Fischer Scientific（Rockford,IL,USA）。木瓜蛋白酶作为自番木瓜（Carica papaya）的冷冻干燥的粉（9.84U.mg-1）获自Fluka。具有聚醚砜膜的离心装置来自Pall Life Sciences（AnnArbor,MI,USA）。至少以一式两份运行全部实验和测定。
【Cel7A纯化】
Cel7A利用例如，Hall et al.,2010.Cellulose crystallinity-a keypredictor of the enzymatic hydrolysis rate.Febs Journal,277,1571-1582中公开的阴离子交换层析纯化自瑞氏木霉（Trichodermareesei）纤维素酶混剂。通过SDS-PAGE确认纯度。纯化之后，将Cel7A缓冲剂使用聚醚砜膜（10kDa的分子量截止值）在Macrosep装置中更换为乙酸钠缓冲剂（50mM,pH5）。
【纤维素酶蛋白水解和CBD分离】
使用木瓜蛋白酶的纤维素酶切割根据例如，Lemos et al.,2000.Asimple method to separate cellulose-binding domains of fungalcellulases after digestion by a protease.Biotechnology Letters,22,703-707中公开的方法改良。将纤维素酶制备物（自瑞氏木霉（Trichoderma reesei）的混合物）（5X）在乙酸钠缓冲剂（50mM,pH5）中稀释，及在Jumbosep离心装置（聚醚砜膜,30kDa的分子量截止值）中浓缩而去除更小分子。将木瓜蛋白酶在乙酸铵缓冲剂（50mM,pH6）中于30℃和170rpm活化30min，并添加到纤维素酶溶液（w/w 1:5,v/v1:5）。于30℃进行消化2h（经SDS-PAGE检查完成）。然后通过30kDa膜过滤混合物，及使用微BCA测定分析滤出液和浓缩物的蛋白含量。
【X-射线衍射和结晶度测量】
用X'Pert PRO X-射线衍射仪（PANanalytical BV,Almelo,Netherlands），于室温（自10～35℃），使用以45kV和40mA的Cu/Kα1辐射
Figure BDA00001904761600161
记录冷冻干燥（于-55℃和0.03mbar，经16小时）之后获得的纤维素样品（缓冲剂和CBD预处理的）的X-射线衍射图案。扫描速度是0.021425°.s-1，步长是0.0167°。使用例如，Bansalet al.,Multivariate statistical analysis of X-ray data from cellulose:Anew method to determine degree of crystallinity and predicthydrolysis rates.Bioresource Technol.,101,4461-4471中描述的分析方法，自X-射线衍射数据测量纤维素的结晶度指数。
【纤维素预处理和水解】
将纤维素-结合结构域以各种量（达12μg.mg-1）加入玻璃瓶（含有搅棒）中的乙酸钠缓冲剂（50mM,pH5）中的纤维素（微晶纤维素或纤维状纤维素,总56mg,40mg.mL-1）。将混合物于各种温度，在170rpm的摇床温育器中温育15h，然后用缓冲剂稀释，以降低纤维素浓度到20mg.mL-1用于随后水解。在预处理步骤之后，通过将纤维素酶（24mL.L-1,3.4g.L-1总蛋白）和β-葡萄糖苷酶（15kU.L-1）添加到反应混合物，及于50℃和170rpm进行来起始水解。通过对30min，1h和2.5h之后取的小等份进行DNS测定监控反应过程，如描述于，例如，Hall et al.,2010.Cellulose crystallinity-a key predictor of theenzymatic hydrolysis rate.Febs Journal,277,1571-1582。
为热稳定性实验，将纤维素酶和催化性结构域于50℃温育15h，然后添加（300μg.mL-1和125μg.mL-1,分别）到已于50℃以900rpm温育1h的纤维素混合物（微晶纤维素,在乙酸钠缓冲剂中20mg.mL-1,50mM,pH5）。以50℃和900rpm运行水解，并在6h和22h之后通过对上清液进行DNS测定来监控转变。
【酶吸附实验】
将乙酸钠缓冲剂（50mM,pH5）中的微晶纤维素样品（20mg.mL-1）于50℃以900rpm温育1h，然后冷却到4℃。以各种量添加纤维素酶（已在乙酸钠缓冲剂中于50℃温育15h或自购买存储于4℃），并将混合物于4℃进一步搅拌30min。离心之后，收集上清液及使用BCA蛋白检定试剂盒进行蛋白含量分析。
【实施例9的结果】
【纤维素酶蛋白水解和CBD分离】
在使用木瓜蛋白酶作为切割剂的蛋白水解实验中使用纤维素酶混合物（内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶）及自瑞氏木霉（Trichodermareesei）的纯化的纤维二糖水解酶Cel7A。在两种情况中均切割完全（如通过全长酶消失观察），通过过滤的CBD分离产生了CBD的混合物或纯CBDCel7A，并可通过SDS-PAGE观察自渗余物的对应催化性结构域（CD），如显示于图13。
【用CBD的纤维素温育和结晶度】
在实施例9中，使用摇床温育器和将搅棒添加到系统来提供剧烈搅拌。微晶纤维素（CrI 60%）和纤维状纤维素（CrI 72%）的高晶体含量允许监控预处理期间发生的变化。在缓冲剂中，于42℃，在剧烈搅拌下，用CBD的纤维素的预处理15h之后，收集样品，并含量通过X-射线衍射（XRD）评定它们的结晶度，而分析上清液中可溶性还原端的存在。无还原端从缓冲剂对照样品释放。当用CBD获得的可溶性还原端的量非常低（<120μg.mL-1,始于20mg.mL-1纤维素浓度）时，其一致，且在缓冲剂背景以上。家族I CBD最可能不具有任何水解性活性；反之，小可溶性寡聚体在CBD的结合/处理之后从纤维素表面释放。不用CBD不可观察到破坏活性，例如，无聚结物形成，也无更快的沉淀。在仅缓冲剂中温育（对照）之后，两种类型的纤维素（微晶纤维素和纤维状纤维素）的结晶度显示稍微增加，如显示于下表3。
表3．用缓冲剂和纤维素-结合结构域15h温育对纤维素结晶度（CrI）的效应，如经X-射线衍射测定。
  纤维素基材   微晶纤维素   纤维状纤维素
  干样品(未处理的)上的CrI   60%   72%
  在缓冲剂a中温育之后的CrI   65%   74%
  用CBD预处理之后的CrI   58%   68%
  用CBDCel7A b预处理之后的CrI   53～56%   n.d.
  用CDCel7A b温育之后的CrI   64%   n.d.
a乙酸钠（pH5.0,50mM）。b更长温育时间（>48h）.n.d.未测定
不束缚于任何特定理论，结晶度增加可由于称之为"再结晶"的现象，如描述于，例如，Ouajai,S.,Shanks,R.A.,2006.Solvent andenzyme induced recrystallization of mechanically degraded hempcellulose.Cellulose,13,31-44。增加（微晶纤维素是平均从60%达65～66%,及纤维状纤维素是72%达74%）不可能归因于自纤维素的非-晶体物质的去除，由于在缓冲剂对照样品中无可溶性还原端释放。而且，冷冻干燥对纤维素结晶度不具有效应，从而仅在缓冲剂中延长的温育导致该结晶度指数的显著增加（额外地,将缓冲剂和CBD预处理的样品在XRD分析之前冷冻干燥）。使用CBD（在典型预处理步骤中以40mg.mL-1纤维素达10μg.mg-1）导致不同趋势，如其不仅防止底物免于再结晶，而且减小初始纤维素的结晶度。用CBD的混合物温育之后微晶纤维素结晶度达到58%，而纤维状纤维素结晶度达到68%，自在仅缓冲剂中温育之后获得的结晶度指数显著降低。当将纤维素与自纤维二糖水解酶I Cel7A（CBDCel7A）的纯CBD温育经延长的温育时期（>48h）时，用微晶纤维素获得甚至结晶度的更高减小（下降到53%），如显示于图14。
尽管谱之间的差异呈现限于XRD图案的一部分，用于解析纤维素的XRD数据的上述分析方法允许结晶度指数的精确的确定。在22.5°的布拉格角观察到的强度下降（（200）平面）解释结晶度的总体减小。由此，自瑞氏木霉（Trichoderma reesei）的CBD（属于家族I CBD,随着自黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）或微紫青霉（Penicillium janthinellum）的纤维素酶的CBD），尽管用纤维素不催化性地有活性，对纤维素结构具有强效应，如总体结晶度显著减小。有趣的是，晶面（200）似乎是被这些变化影响的仅一个方面，如显示于图14。总体上，CBD负责分子间氢键断裂到纤维素结晶度显著地减小的程度。不束缚于任何特定理论，此最可能经动态过程进行（需要的纤维素表面上的持续运动），其仍知之甚少。
【CBD预处理的纤维素的水解】
将用CBD温育15h的纤维素通过将纤维素酶（补充了β-葡萄糖苷酶）添加到预处理混合物来水解（一锅处理法）。40mg.mL-1的微晶纤维素的预处理影响转变，如显示于图15a，在30min水解时间后，自CBD预处理的样品释放的糖的量（58%的减小的结晶度,表3）25%高于自缓冲剂预处理的样品释放的（65%的增加的结晶度,表3）（分别7.9mg.mL-1对比6.3mg.mL-1葡萄糖）。该增加可潜在地导致酶促过程的成本的减小，其为由生物质的生物燃料产生中的主要成本贡献因子之一。
有趣的是，当使用CBD的混合物时，甚至当CBD浓度增加到12μg.mg-1时，在20mg.mL-1微晶纤维素浓度，可监控相比在仅缓冲剂中温育，无显著速度差异（图15a）。用纤维状纤维素观察到类似行为：以20mg.mL-1FC浓度温育相比在仅缓冲剂中温育未给显著转变变化（图15b），然而相比缓冲剂温育，以40mg.mL-1FC的CBD温育之后获得23%增加（分别相关于68%对比74%结晶度,表3）。相比微晶纤维素在FC转变中获得更慢得多的速度可部分解释为更高初始结晶度（对于未处理的样品是72%对比60%;但是,表面积和粒径也可贡献）。
观察到用CBD预处理8h代替>15h未导致水解步骤期间释放的葡萄糖的量相比缓冲剂温育的样品的显著变化。用CBD温育开启了纤维素预处理中的新可能性及避免粗糙的条件（诸如高温或酸浓度）的使用或用纤维素酶水解之前自预处理混合物纤维素的分离。
家族I CBD的确切的氨基酸序列似乎对于速度改善欠重要：用均质CBDCel7A预处理产生了与用CBD的混合物处理的那些可比较的结果：相比仅缓冲剂增加的速度（i）于42℃（及也37℃）用CBDCel7A预处理之后，（ii）30min水解（7.5mg.mL-1对比6mg/mL-1）之后：葡萄糖浓度的25%增加,及（iii）在类似条件（34mg.mL-1微晶纤维素浓度相比40mg.mL-1用混合物）下。但是，以更低纤维素浓度（20mg.mL-1）进行的预处理也产生的更快的转变，如在以20mg.mL-1预处理的样品的情况中有仅少数速度减小（相比40mg.mL-1，如显示于图16）。
不束缚于任何特定理论，在水解之前进行的稀释后CBD的解吸可是负责用40mg.mL-1的CBD混合物预处理之后的更高速度（相比以20mg.mL-1无改善）。该解吸会释放纤维素表面上纤维素酶的结合点，由此增加总体水解速度。相比采用无预处理的干纤维素观察到，尽管在缓冲剂中温育导致总体纤维素结晶度的增加而非减小（表3），其提供样品的水合和水解速度的几乎2-倍增加。由此，用CBD预处理之后获得的速度增加可为来自缓冲剂的水合效应和来自CBD的结晶度减小的组合。
预处理期间增加的CBD浓度导致在水解步骤中葡萄糖的增强的产生，如显示于图17。本9μg.mg-1装载不饱和表面，由于以1230μg.mg-1的总装载的150μg.mg-1纤维素酶结合于纤维素表面，如显示于Hall,etal，2010.Cellulose crystallinity-a key predictor of the enzymatichydrolysis rate.Febs Journal,277,1571-1582。而且无采用达470μg.mg-1CBDCel7A的微晶纤维素的饱和度（对应于49μg.mg-1结合的CBD），如显示于Stahlberg,et al.,1991.A New Model forEnzymatic-Hydrolysis of Cellulose Based on the 2-Domain Structureof Cellobiohydrolase-I.Bio-Technology,9,286-290。
在预处理期间缺失搅拌（但当仍提供振摇）时，总体反应速度40%更低，且用CBD温育意外地未导致葡萄糖浓度增加，如显示于图18。如瓶内径的72%大的搅棒的使用导致在缓冲剂中达1.5倍更高转变水平，CBD温育的正面效应，但减小的重复性（最可能由于反应瓶中的几何约束所致的不均一的搅拌）。此后，使用瓶内径的55%的搅棒。可能，搅拌缺失下持续的对流的缺乏阻止CBD分子的侧位移，由此限它们的有效性，假定作为CBD沿着纤维素表面移动的潜在能源的催化性事件的缺失。
意外地，用CBD的纤维素预温育降低了其结晶度指标，并导致随后水解反应中更高葡萄糖浓度。而且，观察到同时将CBD添加到非-预处理的纤维素样品未显示任何转变水平的改善。由此，预处理步骤中CBD的使用，而非组合添加CBD和全长酶的一步过程，意外地有效。不束缚于任何特定理论，其可为，将CBD同时添加到水解混合物防止由于与纤维素酶的竞争性结合和/或纤维素被纤维素酶的水解而结晶度被CBD减小。
【CBD的热稳定性】
与预处理的纤维素的酶促水解中使用的条件类似地，也于50℃进行用CBD的预处理。于50℃预处理15h和水解30min之后，观察到转变仅稍微少于于42℃预处理之后，指示CBD可认为是相对热稳定的。用结合实验确认此观察，其中全长纤维素酶显示于50℃温育15h之后，相比存储于4℃类似地结合于微晶纤维素，如显示于下表4。
表4．于50℃温育15h对纤维素酶和催化性结构域（CD）的催化性活性及纤维素酶结合于微晶纤维素的效应（相比存储于4℃的标准品）。
Figure BDA00001904761600211
但是，纤维素酶的活性，被于50℃相同的温育时期影响（在6h水解之后1.8倍减小,在22h之后达2.3）。于50℃温育之后，CD的催化性活性甚至更减少（在6h和22h之后，葡萄糖浓度分别2.4和3.1倍减小）。可由此得出，纤维素酶的观察的不耐热性是通常由于催化性活性的损失而非结合容量的损失，由于用CBD的纤维素的预处理可于50℃进行。
CBDCel7A是小肽（37个残基），且由不规则的三链反平行β-折叠片组成，如报道的于，例如，Kraulis,et al.,1989.Determination of the3-Dimensional Solution Structure of the C-Terminal Domain ofCellobiohydrolase-I from Trichoderma-Reesei-a Study UsingNuclear Magnetic-Resonance and Hybrid Distance GeometryDynamical Simulated Annealing.Biochemistry,28,7241-7257。不束缚于任何特定理论，其可为，在更高温度的稳定性可至少部分由于其紧凑结构和/或2个二硫桥。
【结论】
温育之后纤维素-结合结构域影响了纤维素结构。用CBD预处理之后，不同类型的纤维素（微晶和纤维状）的结晶度减少，致使获得在水解期间底物欠反抗酶促水解，且葡萄糖浓度增加达约25%。这些惊人及预料不到的结果显示，可将纤维素结合结构域用作纤维素材料的预处理方法。发明的预处理采用生物学分子和相对弱条件代替粗糙的化学品和条件。此外，发明的预处理可以使得其不需要变化溶剂的方式使用。而且，于50℃延长的温育之后CBD的结合容量保留，而有显著的催化性活性的损失。
【图例】
图1．自瑞氏木霉（Trichoderma reesei）纯化的cel7A和木瓜蛋白酶切割之后的cel7A催化性结构域的SDS-PAGE。泳道1：阶梯，泳道2：纯化的cel7A，泳道3：通过30kDa膜过滤之后浓缩物中的催化性结构域（CD）（考马斯染色）。
图2．CBD处理之后微晶纤维素的酶促水解（数指自表2的纤维素样品）。反应如下运行：20mg/ml微晶纤维素，50mM NaOAc pH5，50℃（#3和4用作冷冻干燥的粉剂,产生用于X-射线衍射分析）。全部样品在将酶添加到反应混合物之前于50℃温育1h。
图3．CBD温育时间效应（在报道的时期之后,将酶添加到CBD和微晶纤维素的混合物，并通过测量葡萄糖含量监控水解,表示为转变%）。
图4．相比CBD温育（13h）缓冲剂温育对水解速度的效应。将微晶纤维素在CBD溶液中或在缓冲剂中温育13h（也在缓冲剂中1h）。然后将纤维素酶添加到反应混合物，并监控葡萄糖含量达2.5h。
图5．缓冲剂温育时间对水解速度的效应。将微晶纤维素经各时间在缓冲剂中温育。然后将纤维素酶添加到反应混合物，并监控葡萄糖含量达4h。
图6．CBD浓度优化实验（Vr代表开始浓度）。图b由作为图的相同的数据组成，只不过是作为连接数据点的线。
图7．各CBD处理时间的水解。
图8．各CDB浓度的效应。
图9．连续添加和CBD去除的效应。
图10．45℃处理的效应。
图11．50℃处理的效应。
图12．在用CBD处理，用缓冲剂处理，无用同时添加CBD处理和无处理（干样品）之后，使用纤维素酶和β葡萄糖苷酶，自柳枝稷的还原端的产生。
图13．纤维素酶的木瓜蛋白酶切割之前及之后的SDS-PAGE。泳道1：阶梯，泳道2：通过30kDa膜过滤之后自瑞氏木霉（Trichodermareesei）的纤维素酶混剂，泳道3：纤维素酶的催化性结构域（CD），泳道4：阴离子交换层析之后纯化的Cel7A，泳道5：纯化的Cel7A的CD，泳道6：阶梯，泳道7和8：通过30kDa过滤之后自瑞氏木霉（Trichoderma reesei）的纤维素酶混剂及对应CD的更高装载，泳道9：纯化的Cel7A（更低装载）。
图14．用CBDCel7A（纤维素-结合结构域自纯化的Cel7A），CDCel7A（催化性结构域）或缓冲剂处理的微晶纤维素样品的XRD谱。光谱数据已根据Bansal et al.,2010.Multivariate statistical analysis ofX-ray data from cellulose:A new method to determine degree ofcrystallinity and predict hydrolysis rates.Bioresource Technology,101,4461-4471标准化。1和2指称重复的实验。
图15a．用CBD的混合物于42℃预处理15h之后微晶纤维素的水解特征（于50℃和20mg.mL-1纤维素运行水解.纤维素浓度指称预处理期间的实际浓度）。
图15b．用CBD的混合物于42℃预处理15h之后纤维状纤维素（FC）的水解特征（于50℃和20mg.mL-1纤维素运行水解.纤维素浓度指称预处理期间的实际浓度）。
图16．于42℃用CBDCel7A预处理15h之后微晶纤维素的水解特征（于50℃和20mg.mL-1纤维素运行水解.纤维素浓度指称预处理期间的实际浓度）。
图17．在预处理步骤中（15h于42℃）各种CBD浓度对水解速度的效应（于50℃和20mg.mL-1纤维素运行水解.纤维素浓度指称预处理期间的实际浓度）。
图18．用CBD的纤维素的预处理期间搅棒对水解速度的效应。无搅棒（10μg.mg-1），或用大搅棒（7.5μg.mg-1）于42℃运行预处理15h。于50℃和20mg.mL-1纤维素浓度运行水解。
图19．主要生物的CBD的氨基酸序列。经BLAST搜索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#）鉴定图19的序列（AltschulSF,Gish W,Miller W,Myers EW,Lipman DJ:Basic Local AlignmentSearch Tool.Journal of Molecular Biology 1990,215:403-410）。使用clustalW比对序列（Thompson JD,Higgins DG,Gibson TJ:CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressive multiplesequence alignment through sequence weighting,position-specific gappenalties and weight matrix choice.Nucleic Acids Res 1994,22(22):4673-4680）。酶和物种的名称，图19中的序列是其一部分（根据比对xx中的数|其中xx表示数;例如,瑞氏木霉（Trichodermareesei）Cel7A CBD序列指定为图19中显示的1|1/1-36，是下表5中的编号1）。
表5
  编号   酶(物种)
  1   Cel7A[瑞氏木霉（Trichoderma reesei）]
  2   纤维二糖水解酶I[绿色木霉（Trichoderma viride）]
  3   纤维二糖水解酶I[木霉属（Trichoderma sp.）XST1]
  4   双功能脱乙酰壳多糖酶-纤维素酶[绿色木霉（Trichoderma viride）]
  5   Cip 1[红褐肉座菌（Hypocrea jecorina）]
  6   纤维二糖水解酶I[绿色肉座菌（Hypocrea virens）]
  7   纤维二糖水解酶[白色肉座菌（Hypocrea lixii）]
  8   纤维二糖水解酶I[洁丽香菇（Neolentinus lepideus）]
  9   外切纤维二糖水解酶[黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）]
  10   内-1,4-木聚糖酶D[绳状青霉（Penicillium funiculosum）]
  11   内切葡聚糖酶[烟曲霉（Aspergillus fumigatus）Af293]
  12   木聚糖酶/纤维二糖水解酶[绳状青霉（Penicillium funiculosum）]
  13   纤维二糖水解酶I[Penicillium occitanis]
  14   糖基水解酶家族45蛋白[费希新萨托菌（Neosartorya fischeri）NRRL 181]
  15   纤维素结合蛋白[黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）]
  16   CBHI[草菇小包脚菇（Volvariella volvacea）]
  17   内-1,4-β-木聚糖酶[烟曲霉（Aspergillus fumigatus）Af293]
  18   纤维素结合铁还原酶[灰盖鬼伞（Coprinopsis cinerea Okayama）7#130]
  19   乙酰木聚糖酯酶[红褐肉座菌（Hypocrea jecorina）]
  20   纤维素酶[乳色耙菌（Irpex lacteus）]
  21   内切葡聚糖酶IV[绿色木霉（Trichoderma viride）]
  22   内切葡聚糖酶IV[木霉属（Trichoderma sp.）SSL]
  23   内切葡聚糖酶1[棘孢青霉（Penicillium echinulatum）]
  24   内切葡聚糖酶II[绿色木霉（Trichoderma viride）]
  25   内切葡聚糖酶III[绿色木霉（Trichoderma viride）]
  26   内切葡聚糖酶III[红褐肉座菌（Hypocrea jecorina）]
  27   内切葡聚糖酶II[红褐肉座菌（Hypocrea jecorina）]
  28   糖苷水解酶家族5[血球丛赤壳菌（Nectria haematococca）]
  29   糖基水解酶家族61[禾生病霉（Glomerella graminicola）Ml.001]
  30   纤维素酶[乳色耙菌（Irpex lacteus）]
  31   内-1,4-β-木聚糖酶C前体[黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）]
  32   内切葡聚糖酶I[草酸青霉（Penicillium oxalicum）]
  33   内切葡聚糖酶I[斜卧青霉（Penicillium decumbens）]
  34   纤维素结合蛋白[爱默生踝节菌（Talaromyces emersonii）]
  35   纤维素-结合β-葡萄糖苷酶[黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）]
  36   乙酰木聚糖酯酶[烟曲霉（Aspergillus fumigatus）Af293]
  37   糖基水解酶家族62蛋白[灰盖鬼伞（Coprinopsis cinerea Okayama）7#130]
  38   家族61内切葡聚糖酶[黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）]
  39   真菌纤维素结合结构域蛋白[棒曲霉（Aspergillus clavatus）NRRL 1]
  40   纤维素酶CEL7A[埃杜拉香菇（Lentinula edodes）]
  41   外切葡聚糖酶[棉黄萎轮枝菌（Verticillium albo-atrum）VaMs.102]
  42   纤维二糖水解酶II[解纤维支顶孢（Acremonium cellulolyticus）Y-94]
  43  糖基水解酶家族7蛋白[费希新萨托菌（Neosartorya fischeri）NRRL 181]
  44  纤维素酶CEL6B[埃杜拉香菇（Lentinula edodes）]
要求保护的主题不限于通过本文所述的特定实施方式的范围。的确，除了本文所述的那些之外的本发明的各种修饰对于本领域技术人员而盐自上述描述是显而易见的。该修饰旨在落到随附的权利要求的范围之内。
本文引用的全部参考文献通过引用整体并入本文，至无不一致的程度，且作为全部目的，至与如各个体出版物，专利或专利申请以全部目的特别和个别指示通过引用整体并入本文相同的程度。
任何出版物的引用用于其在提交日之前的公开，且不应解释为准许本发明依靠在先发明居先该出版物。

Claims (15)

1.处理包含全纤维素的原料的方法，其中所述方法包括：
（a）将原料与包含纤维素结合结构域的溶液混合以形成混合物；以及
（b）使混合物经历足以减少全纤维素的结晶度的条件。
2.权利要求1的方法，其中纤维素结合结构域源于纤维二糖水解酶I（cel7A）或纤维二糖水解酶II（cel6A）。
3.权利要求1的方法，其中纤维素结合结构域源于由瑞氏木霉（Trichoderma reesei）产生的纤维二糖水解酶I（cel7A）。
4.权利要求1～3之任一项的方法，其中使混合物经历大于30℃的温度经足以减少全纤维素的结晶度的时间。
5.权利要求1～3之任一项的方法，其中使混合物经历增加的温度至少8小时。
6.权利要求1～3之任一项的方法，其中使混合物经历搅拌使得基本上全部固体悬浮。
7.权利要求1～3之任一项的方法，其中包含纤维素结合结构域的溶液具有5～55μg/ml的纤维素结合结构域浓度。
8.权利要求1～3之任一项的方法，其中包含纤维素结合结构域的溶液还包含适合的缓冲剂及其中溶液具有4.5～5.5的pH。
9.权利要求1～3之任一项的方法，其还包括水解权利要求1中步骤（b）的产物，以产生包含至少一种可发酵的糖的组合物，且相比不采用纤维素结合结构域的可比较的方法，其中所述组合物中的所述至少一种可发酵的糖是至少10%更多。
10.权利要求1～3之任一项的方法，其中纤维素结合结构域和催化性结构域的比是大于1:1。
11.适合于减少纤维素的结晶度的组合物，其包含：
纤维素，
适合的浓度的包含纤维素结合结构域的溶液，及
适合的缓冲剂。
12.权利要求11的组合物，其中纤维素结合结构域源于由瑞氏木霉（Trichoderma reesei）产生的纤维二糖水解酶I（cel7A）。
13.权利要求11～12之任一项的组合物，
其中包含纤维素结合结构域的溶液具有5～55μg/ml的浓度，
其中缓冲剂包含25～75mM乙酸钠缓冲剂，且
其中溶液具有5的pH。
14.权利要求11～12之任一项的组合物，其中包含纤维素结合结构域的溶液具有大于1:1的纤维素结合结构域和催化性结构域的比。
15.权利要求11～12之任一项的组合物，其中包含纤维素结合结构域的溶液具有大于5:1的纤维素结合结构域和催化性结构域的比。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114525317A (zh) * 2022-03-10 2022-05-24 杨兴 一种无化学改性天然纤维素的新型纳米化方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9179709B2 (en) 2012-07-25 2015-11-10 R. J. Reynolds Tobacco Company Mixed fiber sliver for use in the manufacture of cigarette filter elements
US9119419B2 (en) 2012-10-10 2015-09-01 R.J. Reynolds Tobacco Company Filter material for a filter element of a smoking article, and associated system and method
DK3027742T3 (da) 2013-07-29 2020-02-24 Danisco Us Inc Enzymvarianter
CN107109386A (zh) * 2014-10-27 2017-08-29 丹尼斯科美国公司 与β‑葡糖苷酶相关的组合物和方法
US10524500B2 (en) 2016-06-10 2020-01-07 R.J. Reynolds Tobacco Company Staple fiber blend for use in the manufacture of cigarette filter elements

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090042266A1 (en) * 2005-12-22 2009-02-12 Roal Oy Treatment of cellulosic material and enzymes useful thererin

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0812267A2 (pt) * 2007-05-31 2014-10-14 Novozymes Inc Célula hospedeira fúngica filamentosa, método para produzir uma composição de proteína celulolítica, composição de proteína celulolítica, e, métodos para degradar ou converter um material, contendo celulose e para produzir um produto de fermentação

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090042266A1 (en) * 2005-12-22 2009-02-12 Roal Oy Treatment of cellulosic material and enzymes useful thererin

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHOU ET AL: "Optimization of cellulase mixture for efficient hydrolysis of steam-exploded corn stover by statistically designed experiments", <<BIORESOURCE TECHONOLGY>>, vol. 100, 31 December 2008 (2008-12-31), pages 819 - 825 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114525317A (zh) * 2022-03-10 2022-05-24 杨兴 一种无化学改性天然纤维素的新型纳米化方法

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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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