MX2012006408A - Metodos mejorados para tratar biomasa por hidrolisis enzimatica. - Google Patents

Abstract

La presente invención es un proceso para tratar una materia prima que comprende holocelulosa. El proceso comprende mezclar la materia prima con una solución que comprende dominios de unión a celulosa para formar una mezcla. La mezcla entonces es sometida a condiciones suficientes para reducir la cristalinidad de holocelulosa. La hidrólisis enzimática posterior puede mostrar una velocidad y o rendimiento de azúcar fermentable mejorados cuando se compara un proceso que no emplea el proceso.

Description

METODOS MEJORADOS PARA TRATAR BIOMASA POR HIDROLISIS ENZIMATICA Campo de la Invención La présente invención pertenece a métodos mejorados para tratár una materia prima que comprende holocelulosa utilizando, por ejemplo, una solución que comprende dominios de unión a celulosa previos a la hidrólisis enzimática.

Antecedentes de la Invención La hidrólisis enzimática de celulosa a glucosa ha ganado un interés acrecentado por los últimos diez años, y el crecimiento de la demanda por puntos de biocombustibles económicamente sostenibles a una necesidad urgente de reducir costos en su producción. La celulosa, un polisacárido fabricado por varias plantas, es uno de los compuestos orgánicos más abundantes en la Tierra y por lo tanto representa una potencial mina de oro para la industria de biocombustibles. Sin embargo, la degradación presente enzimática de la celulosa encara mayores problemas que prevenir su amplia utilización para producir, por ejemplo, un biocombustible económicamente competitivo. Tales problemas pueden incluir, por ejemplo, una baja velocidad de reacción y/o conversión.

Ventajosamente, los inventores han descubierto un proceso y composición que cumple las metas antes mencionadas No. ef.: 231337 y más. En términos generales la invención presente pertenece en una modalidad a un proceso para el tratamiento de una materia prima que incluye dominios de unión a celulosa para formar una mezcla. La mezcla es después sometida a condiciones suficientes para reducir la cristalinidad de holocelulosa. La hidrólisis enzimática posterior puede mostrar una velocidad mejorada y/o rendimiento de azúcar fermentable cuando se compara al proceso en el que no se emplea el proceso de tratamiento CBD.

Breve Descripción de las Figuras La Fig. 1 ilustra un gel SDS-PAGE de cel7A purificado a partir de Trichoderma reesei y el dominio catalítico cel7A después de la división de papaína.

La Fig. 2 ilustra la hidrólisis enzimática de Avicel después del tratamiento CBD.

La Fig. 3 ilustra el efecto de varios tiempos de incubación de CBD.

La Fig. 4 muestra el efecto de la incubación de la solución amortiguadora sobre la velocidad de hidrólisis comparada a la incubación CBD (13 h) .

La Fig. 5 muestra el efecto del tiempo de incubación de la solución amortiguadora sobre las velocidades de hidrólisis.

Las Figs . 6A-6B muestran el resultado de un experimento de optimización de concentración de CBD.

La Fig. 7 muestra la hidrólisis para varios tiempos de tratamiento de CBD.

La Fig. 8 muestra el efecto de varias concentraciones de CBD .

La Fig. 9 muestra el efecto de la adición secuencial y remoción de CBD.

La Fig. 10 muestra el efecto de un tratamiento a 45 °C.

La Fig. 11 muestra el efecto de un tratamiento a 50°C.

La Fig. 12 muestra la cantidad de finales reducidos producidos a partir de pasto varilla utilizando celulasas y ß-glucosidasa después de un tratamiento con CBD, tratamiento con solución amortiguadora, sin tratamiento con adición simultánea de CBD, y sin tratamiento (muestra seca) .

La Fig. 13 muestra el SDS-PAGE antes y después de la división de papaína de celulasas.

La Fig. 14 muestra el espectro XRD para muestras Avicel tratadas con CBDCei7A (dominio de unión a celulosa a partir de Cel7A purificado) , CDCei7A (dominio catalítico) o solución amortiguadora .

La Fig. 15A muestra el perfil de hidrólisis de Avicel después del pretratamiento con una mezcla de CBDs por 15 h a 42°C.

La Fig. 15B muestra el perfil de hidrólisis de celulosa fibrosa (FC) después del pretratamiento con una mezcla de CBDs por 15 h a 42 °C.

La Fig. 16 muestra el perfil de hidrólisis de Avicel después del pretratamiento con CBDCei7A por 15 h a 42 °C.

La Fig. 17 muestra el efecto de varias concentraciones de CBD en el paso de pretratamiento (15 h a 42 °C) sobre la velocidad de hidrólisis.

La Fig. 18 muestra el efecto de la barra de agitación durante el pretratamiento de celulosa con CBDs sobre las velocidades de hidrólisis.

La Fig. 19 muestra las secuencias de aminoácidos de varios CBDs que pueden ser útiles en las invenciones presentes .

Descripción Detallada de la Invención En términos generales la invención presente pertenece en una modalidad al proceso para el tratamiento de una materia prima que incluye holocelulos . El proceso comprende mezclar la materia prima con una solución que comprende dominios de unión a celulosa para formar una mezcla. La mezcla es entonces sometida a condiciones suficientes para reducir la cristalinidad de la holocelulosa. La hidrólisis enzimática posterior puede mostrar una velocidad mejorada y/o rendimiento de azúcar fermentable cuando se compara al proceso que no emplea el proceso de tratamiento de CBD previo a la hidrólisis posterior. Ventajosamente, el azúcar fermentable en la composición hidrolizada y/o la velocidad de hidrólisis puede ser de por lo menos aproximadamente 10%, o por lo menos aproximadamente 15%, o por lo menos aproximadamente 20%, más que un proceso comparable que no emplea dominios de unión a celulosa. Siguiendo la hidrólisis para producir uno o más azúcares fermentables tales como glucosa, procesos tales como la fermentación pueden ser empleados para producir, por ejemplo, bioetanol .

, Materia prima que Comprende Holocelulosa La naturaleza de la materia prima empleada en el proceso y- composiciones aquí no es particularmente crítica siempre que la materia prima incluya holocelulosa. Como se utiliza aquí, "holocelulosa" significa que al menos una porción de carbohidrato insoluble en agua de una biomasa, en este caso, la porción de la biomasa que no es lignina, extractivos, o ceniza, sino más bien, incluye sustancias tales como polisacáridos . La composición precisa de holocelulosa puede variar dependiendo de la materia prima específica empleada. Sin embargo, la holocelulosa útil aquí normalmente incluye varias cantidades de celulosas tales como alfa-celulosa y hemicelulosa y puede contener varios polímeros pentosan o hexosan. Así, virtualmente cualquier masa lignocelulósica que comprenda celulosa puede ser empleada como la materia prima en los procesos y composiciones de la presente invención. La invención puede ser ventajosamente empleada en composiciones que incluyen celulosa en que la cristalinidad de la celulosa está en necesidad de reducción.

En una modalidad una materia prima es particularmente preferible una biomasa de planta. La biomasa viene en muchos tipos diferentes, que pueden ser agrupados dentro de algunas categorías principales: madera o residuos forestales, incluyendo aserraderos y desechos de fábricas de papel, desperdicios municipales de papel, algas, residuos agrícolas, incluyendo rastrojo de maíz (tallos y paja) , y bagazo de caña de azúcar, y cultivos dedicados a la energía, que son compuestos en su mayoría de pastos altos de crecimiento rápido tales como, por ejemplo, pasto varilla. Cualquiera de los antes mencionados puede encontrar un uso en la presente invención. Una biomasa particularmente preferible comprende una con alto contenido de celulosa.

Dependiendo de la naturaleza de la materia prima puede ser deseable reducir por lo menos una porción de este en tamaño con el fin de exponer un área de superficie adicional para tratamiento. Tal reducción puede hacerse en cualquier forma conveniente tal como moler, cortar, picar, etc. El tamaño deseado de la materia prima varía dependiendo del tipo de ingredientes y otras especificaciones de las invenciones presentes. Normalmente, el menor tamaño de las materias primas puede reaccionar rápidamente pero costar más para producir. Generalmente, esto es ventajoso si la materia prima es reducida previo al tratamiento de CBD y/o previo a la hidrólisis.

De manera similar, es con frecuencia ventajoso, o puede incluso ser necesario, en algunas situaciones primero purificar al menos una porción de la materia prima. Por purificación significa limpiar parcialmente con el fin de remover al menos algunos contaminantes que puedan afectar negativamente el proceso corriente abajo. Esta purificación puede ayudar en reducir o eliminar cualquier reacción indeseable en los pasos siguientes. El tipo de purificación dependerá de la fuente de materia prima, así como, la cantidad y naturaleza de las impurezas y los siguientes pasos a los que estará sometida. Con frecuencia, un simple lavado de la materia prima lignocélulósica es suficiente. Tal purificación, si se hace, puede ser llevada a cabo previo a, junto con, o posterior a cualquier reducción de tamaño. Adicionalmente, si se desea o ventajosamente, al menos una porción de toda la materia prima que no incluye holocelulosa puede ser separada. Sin embargo, esto no es necesario para muchos procesos y condiciones a los que la composición probablemente será sometida.

Dominio de Unión a Celulosa (CBD) Los dominios de unión a celulosa (CBD, por sus siglas en inglés) aquí empleados son normalmente derivados de celulasas. Las celulasas son glicosil hidrolasas de estructura variable que catalizan la hidrólisis de enlaces 1 , 4 - ß -D-glicosídicos . La mayoría de celulasas incluyen tres dominios: (1) un dominio catalítico que sirve principalmente como el lugar de hidrólisis, (2) un dominio de unión a celulosa que con frecuencia ayuda en el anclaje de la enzima completa dentro de la superficie de celulosa y/o en orientar la fibra de celulosa directo al túnel que contiene el sitio activo, y (3) un conector flexible glicosilado que conecta los otros dos dominios y con frecuencia proporcionan suficiente separación espacial entre ellos. El conector puede también ayudar en permitir el movimiento procesivo y/o ayudar en el almacenamiento de energía.

Como se utiliza aquí el término "dominio de unión a celulosa" o "CBD" es una porción de celulasa que incluye una porción substancial del antes mencionado (2) pero pierde una porción substancial, la mayoría, o todo de (1) . Tales dominios de unión a celulosa en algunas modalidades incluyen todos o al menos una porción del conector (3) mientras en otras modalidades el conector (3) es modificado o ausente del dominio de unión a celulosa empleado. Entonces, CBD útil para utilizarse aquí puede con frecuencia ser obtenido a partir de celulasa mediante la división de CBD y, si se desea, el conector a partir de la celulasa en un método conveniente tal como, por ejemplo, división proteolítica . Dependiendo del método de división, el CBD puede entonces ser recuperado en una manera conveniente tal como, por ejemplo, filtración. En algunas modalidades, la proporción de dominios de unión a celulosa con respecto a un dominio catalítico es mayor que 1:1, o mayor que 2:1, o mayor que 3:1, o mayor que 5:1, o mayor que 10:1.

La naturaleza y tipo de dominio de unión a celulosa empleada no es particularmente ¦ crítica siempre que ellas funcionen de forma que reduzcan la cristalinidad de la celulosa y/o faciliten cualquier procesamiento adicional tal como la hidrólisis. Los CBSs apropidos pueden ser derivados a partir de una enzima apropiada producida- por especies como, por ejemplo, una especie de Trichoderma tal como T. reesei, T. viride, así como, por ejemplo, Phanerochaete chrysosporium, Humicola insolens, Coprinopsis cinérea, Acre onium cellulolyticus, Hypocrea jecorina, Penicillium occitanis, Irpex lacteus, Penicillium echinulatu , Lentinula edodes, Penicillium decumbens .

En una modalidad los dominios de unión a celulosa son derivados de celobiohidrolasa I (cel7A) tal como producidos medainte, por ejemplo, una especie de Trichoderma como Trichoderma reesei. En otra modalidad los dominios de unión a celulosa son derivados de celobiohidrolasa II (cel6A) . En otra modalidad los dominios de unión a celulosa son derivados, por ejemplo, a partir de una enzima en la Tabla 5 abajo. En otra modalidad los dominios de unión a celulosa empleados pueden ser una mezcla de dos o más de los mencionados anteriormente . El CBD Los dominios de unión a celulosa (CBDs) de celulasas de Trichoderma reesei (pertenecientes a la familia I CBD) forman un pliegue tipo cuña, en donde la cara plana proporciona residuos clave (aromáticos) que interactúan fuertemente con la celulosa cristalina. Tales métodos como aquellos descritos en los ejemplos de abajo pueden ser empleados. Además, con el beneficio de la presente descripción, una de las técnicas puede emplear una prueba de rutina de otras sustancias para identificar materiales útiles. Alternativamente o adicionalmente, la ingeniería de proteínas puede llevarse a cabo en CBD. Las mutaciones de ciertos residuos en CBD (tales como aquellos involucrados en la unión o interacción con celulosa y/o cualquiera que pueda afectar una velocidad más rápida de hidrólisis) pueden entonces ser explotados para desarrollar CBD a la medida de, por ejemplo, materias primas específicas y/o condiciones de proceso.

Mezclado de la materia prima con una solución que comprende dominios de unión a celulosa La solución que comprende dominios de unión a celulosa puede hacerse y mezclarse con la materia prima en cualquier forma conveniente. La concentración de la solución que incluye dominios de unión a celulosa varía dependiendo de la. materia prima particular, otros ingredientes de la solución tales como solución amortiguadora, y las condiciones a ser empleadas. Generalmente, debería tener una concentración al menos lo suficiente para reducir la cristalinidad de la celulosa a las condiciones del tratamiento pero no tan alta que interfiera con cualquiera de los pasos posteriores deseados tales como hidrólisis. Generalmente, una concentración de por lo menos aproximadamente 5, o por lo menos aproximadamente 10, o por lo menos aproximadamente 15 hasta como máximo aproximadamente 100, o como máximo aproximadamente 75, o como máximo aproximadamente 55, o como máximo aproximadamente 45, o como máximo aproximadamente 35 pg/ml puede ser efectiva. Una solución amortiguadora apropiada también puede ser empleado en la solución si se desea. Puede ser ventajoso emplear una solución amortiguadora que actúe sinergísticamente con el CBD para además facilitar la reducción de la cristalinidad de la celulosa. Las soluciones amortiguadoras apropiadas con frecuencia incluyen sales o ésteres de ácidos de alquilo inferior tales como ácido acético y normalmente tienen un pH desde aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 5.5. En una modalidad, la solución comprende una solución amortiguadora de acetato de sodio a una concentración desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 75 mM.

Condiciones de Tratamiento de CBD Una vez que está hecha la mezcla que comprende una o más materias primas con una solución que comprende dominios de unión a celulosa, entonces la mezcla es sometida a condiciones suficientes para reducir la cristalinidad de la holocelulosa y/o facilitar una hidrólisis posterior. Esas condiciones pueden variar ampliamente dependiendo de la naturaleza y tipo de materia prima y el tipo y cantidad de ingredientes en la solución que comprenden dominios de unión a celulosa.

Típicamente, la mezcla es sometida a un incremento de temperatura por un tiempo suficiente para reducir la cristalinidad de la holocelulosa. Tales temperaturas varían pero pueden ser por lo menos aproximadamente 30 °C, o por lo menos aproximadamente 35° hasta . como máximo aproximadamente 60°C, o como máximo aproximadamente 50°C, o como máximo aproximadamente 45°C. Generalmente, entre se emplee temperatura más alta, más corto deberá ser el tiempo que la mezcla sea calentada y viceversa. A las temperaturas previamente descritas, los tiempos apropiados a los cuales la mezcla es sometida a la temperatura incrementada por lo menos aproximadamente 8 horas, o por lo menos aproximadamente 10 horas, o por lo menos aproximadamente 12 horas, o por lo menos aproximadamente 14 horas, hasta como máximo aproximadamente 48 horas, o como máximo aproximadamente 24 horas, o como máximo aproximadamente 16 horas. Utilizando la presente descripción, una persona experimentada en la técnica puede utilizar experimentación de rutina para determinar tiempos apropiados y temperaturas para una materia prima y composición particulares.

Sin desear ser limitado por cualquier teoría particular, se cree que los dominios de unión a celulosa y proteínas similares reducen el grado de cristalinidad, y entonces vuelven la celulosa menos recalcitrante al ataque enzimático. Los procesos mencionados anteriormente de la presente invención pueden ser utilizados solos o en combinación con otras técnicas para disminuir la cristalinidad a un nivel deseado. Tales técnicas pueden utilizarse antes, durante, o después de los procesos de la invención presente e incluyen, por ejemplo, técnicas (termo) químicas y/o mecánicas (por ejemplo tratamiento con ácido fosfórico, líquidos iónicos o solventes orgánicos, AFEX, y triturado por molino de bolas) . En algunos casos la purificación puede ser benéfica antes del paso de hidrólisis (por ejemplo, con líquidos iónicos) . En algunos casos puede ser. ventajoso someter la mezcla a un agitado suficiente de forma que substancialmente todos los sólidos son suspendidos. Por ejemplo, en algunos casos la mezcla es sometida a agitación, preferiblemente vigorosa, en un frasco con una barra de agitación. En algunas modalidades la barra de agitación tiene un diámetro de por lo menos aproximadamente 45%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 50%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 55%, del diámetro interno del frasco.

En otra modalidad, la presente invención pertenece al uso de una solución o composición que incluye dominios de unión a celulosa en un paso de pre- tratamiento en, por ejemplo, un proceso de hidrólisis de celulosa. La solución o composición que comprende dominios de unión a celulosa es descrita arriba y abajo. De manera similar, el paso de pre- tratamiento es como se describió, en este caso, primero mezclando una materia prima holocelulósica con la solución o composición que comprende dominios de unión a celulosa para formar una mezcla y después someter la mezcla a condiciones suficientes para reducir la cristalinidad de la holocelulosa. Los ingredientes, condiciones específicos etc. pueden ser descritos aquí en otra parte.

Ejemplos EJEMPLOS 1-8 Procedimiento General para el tratamiento de CBD de Avicel La celobiohidrolasa I (cel7A) es un componente de una ' mezcla de celulasa que es una exoglucanasa que ataca las cadenas de celulosa a partir del lado del extremo reductor. Los siguientes ejemplos inventivos emplean los dominios de unión a celulosa (CBD) a partir de esta enzima, y más específicamente cel7A de Trichoderma reesei, un organismo comúnmente utilizado en la producción de, por ejemplo, bioetanol . El efecto de CBD en celulosa fue investigado, en este caso, la consecuencia de la incubación de celulosa, en este caso, tratamiento, en una solución que comprende CBD en el grado de cristalinidad, y subsecuentemente en la velocidad de hidrólisis enzimática de la reacción llevada a cabo con la celulosa tratada con CBD.

Cel7A está constituida de tres dominios: un dominio de unión a celulosa (CBD) , un dominio catalítico (CD, por sus siglas en inglés) y un ligando altamente glicosilado que une el CBD al CD. Los ejemplos involucran: (1) producir CBD de cel7A, por medio de división proteolítica de un fragmento (más un ligando) a partir de CD utilizando papaína (una cisteína proteasa) ; (2) recuperar CBD mediante filtración a través de una membrana de 30 kDa (CBD .+ ligando ~ 61 residuos; tamaño teórico ~ 6 kDa; tamaño estimado de los experimentos ~ 14 kDa debido a O-glicosilación del ligando; tamaño estimado de CD ~ 50 kDa debido a la iV-glicosilación) ; (3) incubar, en este caso, tratar la celulosa (Avicel) con una solución que incluye CBD; y (4) adicionar un coctel de celulosa (a partir de Trichoderma reesei) y monitorear la velocidad de hidrólisis (mediante el contenido de glucosa) .

Procedimiento General para la producción de CBD Siguiendo el procedimiento en la división de CBD a partir del núcleo de la proteína como utiliza en, por ejemplo, P. Tomme et al., Eur. J. Biochem. , 1988, 170, 575-581, fue empleada papaína para llevar a cabo la digestión proteolítica bajo las siguientes condiciones: 1. Activación de papaína en 50 mM de solución amortiguadora NaOAc pH 6.0 a 30°C por 30 min; 2. Adición de papaína a la solución cel7A (en 50 mM de solución amortiguadora NaOAc, pH 5.0) a 30°C, proporción papaína/cel7A 1:5 (peso/peso, v/v) ; . 3. Agitación por 2 h a 30°C; y 4. Filtración de la mezcla de reacción a través de una membrana de 30 kDa (4000 rpm por 15 min) para colectar el dominio de unión a celulosa (unido al ligando) en el filtrado .

Se encontró que la reacción de división fue completada después de 2 h, y cel7A (~ 64 kDa) no remanente podría ser detectado por un SDS-PAGE como se mostró en la Figura 1. La reacción permitió la formación de una banda única fuerte, con un peso molecular de ~ 50 kDa. La papaína dividió exitosamente CBD + ligando del núcleo de proteína (CD) ,· sin embargo, este pequeño fragmento de proteína (~ 14 kDa) no fue detectado por SDS-PAGE (la secuencia muestra muy pocos residuos que pueden reaccionar con el comúnmente utilizado colorante de teñido Coomassie) . Sin embargo, CBD fue detectado mediante un ensayo de proteína micro BCA (ácido bicinconínico) en el filtrado (< 30 kDa) (Tabla 1, 100% de recuperación) .

Tabla 1. Recuperación de fragmentos de Cel7A después de la división de papaína Fragmentos ' de proteína Masa total (mg) Cel7A (+ papaína) 4.6 mg antes de la reacción CD (+ papaína) concentrado 3.8 mg después de la filtración a través de la membrana > 30 kDa CBD filtrado 0.6 mg después de la filtración a través de la membrana > 30 kDa CBD esperado 0.6-0.9 mg (~ 10 - 14 kDa a partir de 64 kDa) Ejemplo 1A - tratamiento de Avicel con una solución que comprende dominio de unión a celulosa (CBD) y medición de la cristalinidad mediante difracción de rayos X Aún cuando no se desee estar unido a ninguna teoría particular se cree que la actividad de CBD se refiere a una disrupción no proteolítica de celulosa y a un debilitamiento y fraccionamiento de la cadena de unión a hidrógeno en celulosa. La siguiente investigación determinó si esa actividad fue lo suficientemente fuerte para reducir la cristalinidad de celulosa.

Avicel fue tratado con una solución CBD (obtenida como se describió arriba) , y el grado de cristalinidad de la celulosa recuperada fue posteriormente determinado mediante difracción por rayos X utilizando nuestro recientemente descubierto método analítico descrito en, por ejemplo, Bansal et al., Multivariate statistical análisis of X-ray data from cellulose: A new method to determine degree of cristallinity and predict hydrolysis rates. Bioresource Technol., 102, 4461-4471.

El paso de tratamiento de celulosa fue llevado a cabo como sigue: Avicel (20 mg/ml) en solución de CBD (50 mM de solución amortiguadora NaOAc, pH 5) fue agitada a 37°C por 2 días. La mezcla fue centrifugada a 4000 rpm por 15.min y la celulosa recuperada fue secada por congelación. El polvo fue analizado por el método de difracción por rayos X referido arriba.

Avicel es una celulosa microcristalina con un grado promedio de cristalinidad de aproximadamente 60%. Del tratamiento con una solución de CBD, un decremento significativo en la cristalinidad de Avicel fue observado como se mostró en la Tabla 2 abajo. El decremento más alto del 13% fue obtenido con la muestra 4 que corresponde a 4.7 mi del filtrado obtenido del rompimiento de 3.3 mg cel7A en 7 mi de solución amortiguadora.

Tabla 2. Grado de cristalinidad (CrI) de Avicel después de la incubación (2 días) con dominio de unión a celulosa (CBD) o dominio catalítico (CD) Crl(%)* CBD CD Sin tratamiento antes de la hidrólisis 1 57.2 59.6 2 57.4 60.3 3 56 61 4 52 62 * las muestras 1-4 se refieren a diferentes experimentos, 1 y 2 se corrieron a concentraciones bajas de CBD, 3-4 a concentración de CBD mayor.

Ejemplo 1B-Hidrólisis enzimática de muestras tratadas con CBD del Ejemplo 1A Las muestras de celulosa (3 y 4, Tabla 2) que presentaron un valor de cristalinidad significante menor comparado al Avicel sin tratar fueron sometidos a hidrólisis enzimática utilizando un coctel de celulasa a partir de Trichoderma reesei ( suplementado con ß-glucosidasa para prevenir inhibición del producto) . Fue observado un incremento significativo en la velocidad para las muestras tratadas con solución de CBD previo a la hidrólisis, con una velocidad total dos veces más alta que aquella del Avicel sin tratar arriba del curso de la reacción como se muestra en la Figura 2. Así, la disminución en cristalinidad observada después de tratar Avicel con la solución de CBD correlacionada bien con un recalcitrante reducido al ataque enzimático, y por tanto una rápida conversión a glucosa.

Procedimiento General para Medir el Efecto de Varias Condiciones de Tratamiento de CBD Lo siguiente muestra el efecto de varias condiciones de tratamiento de CBD en velocidades de hidrólisis. Como la cristalinidad mostró disminuir, no fue conducida ninguna medición adicional de cristalinidad y por tanto las celulasas fueron agregadas directamente a la mezcla de reacción después de que el tiempo de tratamiento CBD terminó, en este caso las muestras no fueron liofilizadas antes de la investigación de las velocidades de hidrólisis, no fue intercambiada la solución amortiguadora o la solución diluida. El tratamiento de CBD secuencial y proceso de hidrólisis fue llevado a cabo como sigue: 1. Incubar Avicel con ' solución de CBD sobre varias longitudes de tiempo a 37°C; 2. Cambiar la temperatura a 50 °C; 3. Agregar cocteles de celulasa y ß -glucosidasa y agitar a 50°C; y 4. Sacar alícuotas de la mezcla de reacción para la cuantificación de glucosa a varios intervalos de tiempo.

Ejemplo 2 - Efecto del tiempo de incubación, concentración de CBD, y solución amortiguadora en la velocidad de hidrólisis Para encontrar los tiempos de tratamiento CBD más óptimos que permitirían un mayor incremento en la velocidad de hidrólisis, el tiempo de incubación de 48 h que permite la disminución de 13% en cristalinidad (ver arriba) varió de 8 h hasta 24 h y las velocidades de hidrólisis enzimática fueron examinadas. Una solución única CBD fue utilizada durante todos esos experimentos, de manera que fueron llevados a cabo a concentración CBD constante (~ 42 g/ml) . Fueron obtenidos efectos positivos de CBD entre 8 h y 13 h de incubación a 37°C. Más allá de las 13 h, no se observó incremento adicional en las velocidades como se mostró en la Figura 3. Dependiendo del tiempo de incubación, una diferencia de puntos de porcentaje de 20-25 fue observada en el contenido de glucosa (correspondiente al 50-60% de incremento en velocidad entre los tiempos de tratamiento CBD 8 h y > 13 h) .

Sin embargo, se encontró que la incubación en solución amortiguadora también tiene un efecto positivo en la velocidad de hidrólisis. A pesar de la conversión baja comparada a la incubación con la solución de CBD, la conversión en la muestra incubada en solución amortiguadora por 13 h fue mayor que después de 1 h de incubación en solución amortiguadora como se muestra en la Figura 4. Cuando la conversión en la muestra tratada de CBD fue arriba de dos veces mayor que la tratada con la solución amortiguadora por 1 h (después de 1 h de hidrólisis) , la diferencia fue menos significativa entre la muestra tratada de CBD y la muestra tratada con la solución amortiguadora por 13 h (1.3-1.4, más veces) .

El efecto de la solución amortiguadora en la velocidad de hidrólisis mostró ser dependiente del tiempo, sin embargo, no se observó mayor diferencia entre 13 h y 48 h de incubación en la solución amortiguadora, aunque una incubación por 24 h dejó las velocidades más altas como se muestra en la Figura 5. De manera intersante, el agua de incubación (18 h) mostró un efecto positivo en la velocidad (una conversión más alta que con 1 h de incubación en solución amortiguadora) , sin embargo, menos pronunciada que con un tiempo de incubación similar en solución amortiguadora. Se sospechó un cambio de pH, cuando el agua tuvo un pH de 5.5, 0.5 unidades más alta que el pH de la solución amortiguadora (50 mM de NaOAc pH 5) .

Las mediciones de cristalinidad fueron entonces realizadas en muestras de celulosa preincubadas en únicamente solución amortiguadora y únicamente agua, respectivamente. No se observó un cambio significativo del Avicel no tratado después de 24 h de incubación a 37°C (aparte de un ligero incremento en la cristalinidad arriba del 63%, que no estaría relacionado a un incremento en la velocidad en muchos casos) .

En seguida, la concentración de CBD varió, comenzando de un volumen de referencia (Vr agregado a la mezcla de reacción, correspondiente a la concentración de CBD final de 24 µg/ml) . Concentraciones más altas (arriba de 4 Vr) y concentraciones más bajas (por debajo de 0.14 Vr) fueron examinadas. En general, el efecto de CBD fue menos pronunciado que en los ejemplos previos como se mostró en la Figuras 6A-6B.

Las velocidades más altas fueron obtenidas con 0.28 Vr, en donde ambas concentraciones altas y bajas (0.14 Vr y 4 Vr respectivamente) dejaron una conversión menor. Una conversión más alta de CBD, en donde las celulasas adicionadas para llevar a cabo la hidrólisis tienen menos sitios de unión disponibles en la superficie de la celulosa debido a la presencia de enlaces múltiples CBDs, en donde se produzca adsorción competitiva entre CBD y celulasas. No se encontró mayor diferencia entre 0.5 y 2 Vr . La menor concentración de CBD (0.14 Vr) se llevó a cabo de manera similar al agua, y la concentración más alta de CBD (4Vr) se llevó a cabo de manera similar a la solución amortiguadora. 4 Producción de CBD para el CBD de los Ejemplos 3 - 8 El CBD empleado en los Ejemplos 3 - 6 se efectuó como sigue: Cel7A fue obtenido a partir de una mezcla de celulasas a partir de Trichoderma reesei y purificada por medio de una cromatografía en columna de intercambio aniónico utilizando una columna HiPrep Q FF. La proteína purificada fue fraccionada por proteólisis utilizando papaína y el dominio de unión a celulosa (unido al ligando) fue separado del dominio catalítico por centrifugación a través de una membrana de 30 kDa y colectado en el filtrado a una concentración de 125-175 ig/ml.

Ejemplo 3 - Efecto del Tiempo de Tratamiento de CBD Avicel (20 mg/ml) fue incubado en solución amortiguadora (50 mM de NaOAc pH 5.0) junto con CBD (24 pg/ml) a 37 °C y bajo agitación suave en un vial de vidrio de 24 mi. El efecto del tratamiento fue investigado durante varios periodos de tiempo (8 h, 13 h, 24 h y 48 h) .

La hidrólisis de celulosa fue llevada a cabo en el Avicel tratado con CBD (20 mg/ml) por adición de celulasas (24 µ?/ml, 3.4 mg/ml de proteína total, 3.8 FPU/ml) y ß-glucosidasa (15 U/ml) a la mezcla y la reacción fue llevada a cabo a 50 °C. La producción de glucosa fue monitoreada por un ensayo DNS a varios intervalos (1 h, 2.5 h y 4 h) . Los controles se corrieron en Avicel secado (sin tratamiento de CBD) y sobre muestras incubadas únicamente en solución amortiguadora (por 1 h, 13 h y 48 h) .

Se encontró que la incubación en solución amortiguadora fue benéfica a la hidrólisis, como una concentración mayor de glucosa fue obtenida después de 1 h de incubación comparada a la hidrólisis en celulosa seca. Los efectos fueron más pronunciados después de 13 h de incubación, y no se obtuvo más incremento arriba de las 48 h. La incubación de Avicel en CBD dio un sorpresivo e inesperado incremento, comparado a la solución amortiguadora sola (20-35%) . El tratamiento de CBD alcanzó un máximo efecto después de 13 h de incubación. Los resultados se muestran en la Figura 7.

Ejemplo 4 - Efecto de la concentración de CBD El Avicel (20 mg/ml) fue incubado en solución amortiguadora (NaOAc 50 m pH 5.0) junto con CBD a varias concentraciones (3.4, 6.9, 12, 34, 48 y 96 g/ml) a 37°C y bajo agitación suave por 18 h en un vial de vidrio de 24 mi. La hidrólisis de la celulosa fue llevada á cabo en Avicel tratado con CBD (20 mg/ml) por ádición de celulasas (24 µ?/ml, 3.4 mg/ml de proteína total, 3.8 FPU/ml) y ß-glucosidasa (15 U/ml) a la mezcla y la reacción se llevó a cabo a 50°C. La producción de glucosa fue monitoreada por ensayo de DNS a varios intervalos (1 h, 2.5 y 4 h) . ' Se encontró que el efecto de la incubación de CBD en la hidrólisis de celulosa fue mejor q 7 g/ml, arriba de 48 g/ml, en donde las concentraciones más altas tienen un incremento menor en la producción de glucosa, especialmente a 96 g/ml en donde el tratamiento fue menos eficiente que únicamente en la solución amortiguadora. Los resultados se muestran en la Figura 8.

Ejemplo 5 - Efecto de la adición secuencial Avicel (30 mg/ml) fue incubado en solución amortiguadora (50 M de NaOAc pH 5.0) a 37 °C y bajo agitación suave por 18 h en un vial de vidrio de 24 mi, seguido por la adición de una solución de CBD en la misma solución amortiguadora (48 g/ml) , correspondiente a una concentración final de Avicel de 20 mg/ml. La mezcla fue agitada por otras 12 h a 37°C.

La hidrólisis de la celulosa fue realizada en Avicel tratado de CBD (20 mg/ml) por adición de celulasas (24 g/ml, 3.4 mg/ml de proteína total, 3.8 FPU/ml) y ß-glucosidasa (15 U/ml) a una mezcla y la reacción fue llevada a cabo a 50°C. La producción de glucosa fue monitoreada por ensayo de DNS a varios intervalos (l h y 2.5 h) .

La adición secuencial de CBD después de la primera incubación en solución amortiguadora sólo permitió a una mayor conversión que la incubación simultánea en solución amortiguadora y adición de CBD. Este efecto fue más pronunciado a grados mayores de conversión (aproximadamente 35% de producción más alta de glucosa comparada a la incubación sólo en solución amortiguadora después de 2.5 h de hidrólisis) . Los resultados son mostrados en combinación con los resultados del Ejemplo 6 en la Figura 9.

Ejemplo 6 - Efecto de eliminación de CBD Avicel (20 mg/ml) fue incubado en solución amortiguadora (50 mM de NaOAc pH 5.0) junto con CBD a varias concentraciones (6.9 y 48 pg/ml) a 37°C y bajo agitación constante por 18 h en un vial de vidrio de 24 mi. El CBD adsorbido a la celulosa fue removido por calentamiento de la celulosa (recuperada por centrifugación) en solución 1.1% SDS, seguida por lavados múltiples con EtOH (75%) y agua.

La hidrólisis de celulosa fue llevada a cabo en CBD tratada y lavada con Avicel por adición de celulasas (24 µ?/ml, 3.4 mg/ml de proteína total, 3.8 FPU/ml) y ß-glucosidasa (15 U/ml) a una solución de celulosa (20 mg/ml) en solución amortiguadora (50 mM de NaOAc pH 5.0) y la reacción fue llevada a cabo a 50°C. La producción de glucosa fue monitoreada por el ensayo DNS a varios intervalos (1 h y 2.5 h) .

El procedimiento de eliminación de CBD tuvo un efecto perjudicial en la hidrólisis de celulosa, como la cantidad de glucosa producida fue significativamente menor que la obtenida después del tratamiento con CBD sin eliminación, y ligeramente menor que el obtenido después de la incubación en únicamente solución amortiguadora. Los resultados son mostrados en combinación con los resultados del Ejemplo 5 en la Figura 9.

Ejemplo 7 - Efecto de la temperatura de Incubación Avicel (20 mg/ml) fue incubado en solución amortiguadora (50 mM de NaOAc pH 5.0) junto con CBD a varias concentraciones (24 y 48 g/ml) y temperaturas (45 y 50 °C) y bajo agitación suave por 24 h en un vial de vidrio de 24 mi.

La hidrólisis de celulosa fue llevada a cabo en Avicel tratado con CBD (20 mg/ml) por adición de celulasas (24 µ?/ml, 3.4 mg/ml proteína total, 3.8 FPU/ml) y ß-glucosidasa (15 U/ml) a la mezcla y la reacción fue llevada a cabo a 50 °C. La producción de glucosa fue monitoreada por ensayo DNS a varios intervalos (1 h, 2.5 h y 4 h) .

El tratamiento con CBD a 45 °C dio una mayor producción de glucosa comparado a 37°C, en tanto que a 50 °C mostró menor producción de glucosa comparado a los 45°C. A 50°C, el efecto de la concentración de CBD difiere a partir de uno a 37°C: la incubación de CBD a 24 xg/ml fue menos eficiente que a 48 g/ml . Además, la incubación de CBD a 48 g/ml fue llevada a cabo de manera menos buena que a 45 °C. Los resultados se muestran en las Figuras 10 y 11.

Ejemplo 8 - Tratamiento de pasto varilla con CBD El tratamiento basado en el dominio de unión a celulosa (CBD) de celobiohidrolasa I (Cel7A) a partir de Trichoderma reesei fue aplicado a materiales lignocelulósicos (pasto varilla) , seguidos por la adición de celulasas a la mezcla de tratamiento de CBD para llevar a cabo la hidrólisis. Esto dejó un incremento en la hidrólisis enzimática de lignocelulosa comparado a sin tratamiento con CBD ("muestra seca") previo a la hidrólisis, como medido como la cantidad de extremos reductores producidos con el tiempo.

En resumen, el pasto varilla (20 mg/ml) fue incubado a 45°C en solución amortiguadora de acetato de sodio (pH 5.0, 50 mM) suplementado con CBD (24 pg/ml) y bajo agitación suave en un vial de vidrio de 24 mi por 16 h. La hidrólisis se llevó a cabo en pasto varilla tratado con CBD (20 mg/ml) por adición de celulasas (24 pg/ml, 3.4 mg/ml de proteína total, 3.8 FPU/ml) y ß-glucosidasa (15 U/ml) a la mezcla y la reacción fue llevada a cabo a 50 °C. El efecto del tratamiento con CBD fue investigado al medir la cantidad de los extremos reductores producidos con el tiempo (como equivalentes de glucosa) utilizando el ensayo DNS a varios intervalos (1 h, 2.5 h, 4 h y 6 h) . Se corrieron los controles sobre pasto varilla seco (no tratado con CBD) , pasto varilla seco con adición simultánea de CBD y celulasas y sobre muestras incubadas sólo en solución amortiguadora (por 16 h) .

Se encontró que la incubación en solución amortiguadora fue ligeramente benéfica para la hidrólisis, así como fue obtenida una alta concentración final reducida después de 16 h de incubación comparada a la hidrólisis en pasto varilla seco (25% máximo de incremento después de 1 h de conversión) . Los efectos fueron mucho más pronunciados cuando CBD estuvo presente en la mezcla de incubación (arriba del 65% de incremento en la concentración final reducida después de 2.5 h de conversión comparado con la muestra seca) . La adición simultánea de CBD y celulasas no produjo ninguna diferencia en la conversión comparado con la muestra seca. Los resultados se muestran en la Figura 12. EJEMPLO 9 - Tratamiento de CBD de Avicel y Celulosa Fibrosa de Linteres de Algodón Avicel PH-101, celulosa fibrosa de linteres de algodón (Sigma C6288, mediano), celulasas de Trichoderma reesei (159 FPU-mL"1) ) , y ß -glucosidasa (de almendras, 2.32 U-mg"1) ) fueron obtenidas de Sigma (St Louis, MO, USA) . El kit de ensayo de proteína (micro) BCA y el kit de ensayo de proteína de Coomassie (Bradford) fueron obtenidos de Termo Fisher Scientific (Rockford, IL, USA) . La papaína fue obtenida de Fluka como un polvo liofilizado de Carica papaya (9.84 U-mg"1) . Los dispositivos de centrífuga con membranas de poliétersulfo.na fueron de Pall Life Sciences (Ann Arbor, MI, USA) . Todos los experimentos y ensayos se corrieron al menos duplicados.

Purificación de Cel7A Cel7A fue purificado de un coctel de Trichoderma reesei celulasa por medio de cromatografía de intercambio aniónico como se publicó en, por ejemplo, Hall et al., 2010. La cristalinidad de la celulosa - un factor clave de la velocidad de hidrólisis enzimática. FeJbs Journal, 277 , 1571-1582. La pureza fue confirmada por SDS-PAGE. Después de la purificación, la solución amortiguadora Cel7A fue reemplazada por solución amortiguadora de acetato de sodio (50 mM, pH 5) utilizando una membrana de poliétersulfona (peso molecular cerrado a 10 kDa) en un dispositivo Macrosep.

Proteólisis de Celulasa y aislamiento de CBD La división de celulasa utilizando papaína fue adaptado de procedimientos publicados en, por ejemplo, Lemos et al.-, 2000. Un método simple para separar los dominios de unión a celulosa de celulasas fúngicas después de la digestión por una proteasa. Biotechnology Letters, 22, 703-707. La preparación de celulasa (mezcla de Trichoder a reesei) fue diluida (5 X) en solución amortiguadora de acetato de sodio (50 mM, pH 5) y concentrada en un dispositivo para centrífuga Jumbosep (membrana de poliétersulfona, peso molecular fijado de 30 kDa) para remover partículas pequeñas. La papaína fue activada en solución amortiguadora de acetato de sodio (50 mM, pH 6) a 30°C y 170 rpm por 30 min y adicionada a la solución de celulasa (peso/peso 1:5, v/v 1:5) . La digestión se llevó a cabo a 30 °C por 2 h (terminación revisada mediante SDS-PAGE) . La mezcla entonces fue filtrada mediante una membrana de 30 kDa y ambos filtrado y concentrado fueron analizados para contenido de proteína utilizando el ensayo de BCA micro.

Difracción por rayos X y medición de cristalinidad Los patrones de difracción de rayos X de las muestras de celulosa (solución amortiguadora y CBD pretratado) obtenidas después del secado por congelación (a -55°C y 0.03 mbar por 16 horas) fueron documentados con un difractómetro de rayos X X'pert PRO (PANanalytical BV, Almelo, Países Bajos) a temperatura ambiente de 10 a 35 °C, utilizando irradiación Cu/Ko¡i (1.54 Á) a 45 kV y 40 mA. La velocidad de escaneo fue de 0.021425° . s"1 con un tamaño de paso de 0.0167°. El índice de cristalinidad de la celulosa fue medido de los datos de la difracción de rayos X utilizando un método analítico descrito a, por ejemplo, Bansal et al., Multivariate statistical análisis of X-ray data from cellulose: A new method to determine degree of cristallinity and predict hydrolysis rates . Bioresource Technol . , 101, 4461-4471.

Pretratamiento de celulosa e hidrólisis Los dominios de unión a celulosa fueron agregados en varias cantidades (arriba de 12 pg.ml"1) en solución amortiguadora de acetato de sodio (50 mM, pH 5) en un vial de vidrio (que contiene una barra de agitación) . La mezcla fue incubada por 15 h a varias temperaturas en una incubadora de agitación a 170 rpm y entonces fue diluida con solución amortiguadora a una concentración menor de celulosa de 20 rag.mL"1 para hidrólisis posterior. La hidrólisis fue iniciada después del paso de pretratamiento por adición de celulasas (24 mL.L"1, 3.4 g.LT1 de proteína total) y ß-glucosidasa (15 kU.L"1) a la mezcla de reacción, y fue llevada a cabo a 50 °C y 170 rpm. El curso de la reacción fue monitoreado llevando a cabo el ensayo DNS en pequeñas alícuotas tomadas después de 30 min, 1 h, y 2.5 h como se describió en, por ejemplo, Hall et al., 2010. La cristalinidad de la celulosa - factor clave de la velocidad de hidrólisis enzimática. Febs Journal, 277 , 1571-1582.

Para el experimento de termoestabilidad, las celulasas y los dominios catalíticos fueron incubados a 50°C por 15 h y después agregados (300 g.mL"1 y 125 pg.mL"1, respectivamente) a una mezcla de celulosa (Avicel, 20 mg.mL"1 en una solución amortiguadora de acetato de sodio, - 50 m , pH 5) que había sido incubada a 50 °C por 1 h a 900 rpm. La hidrólisis se corrió a 50°C y 900 rpm y la conversión fue monitoreada después de 6 h y 22 h llevando a cabo el ensayo DNS en el sobrenadante .

Experimentos de adsorción de enzimas Las muestras de Avicel (20 mg.mL"1) en solución amortiguadora de acetato de sodio (50 mM, pH 5) fueron incubadas a 50 °C por 1 h a 900 rpm, y después enfriadas a 4°C. Las celulasas (que habían sido incubadas en solución amortiguadora de acetato de sodio a 50°C por 15 h o almacenadas a 4°C desde su adquisición) fueron agregadas en varias cantidades y la mezcla fue además agitada por 30 min a 4°C. Después de la centrifugación, el sobrenadante fue colectado y el análisis de contenido de proteína fue llevado a cabo utilizando el kit de ensayo de proteína BCA.

Resultados el Ejemplo 9 Proteólisis de celulasa y aislamiento de CBD Ambas mezcla de' celulasa ( endoglucanasas y exoglucanasas ) y celobiohidrolasa purificada Cel7A de Trichoderma reesei fueron utilizadas en el experimento de proteólisis utilizando papaína como agente de división. La división fue completada en ambos casos (como se observó por la desaparición de enzimas de longitud completa) y el aislamiento de CBD a través de filtración produciendo una mezcla de CBDs o CBDCei7A puro, y dominios catalíticos correspondientes (CDs) a partir del retentado podría ser observado por SDS-PAGE como se mostró en la Figura 13.

Incubación de celulosa con CBDs y cri stal inidad En el Ejemplo 9, fue proporcionada agitación vigorosa utilizando una incubadora de agitación y la adición de una barra de agitación al sistema. El alto contenido cristalino de Avicel (Cri 60%) y celulosa fibrosa (Crl 72%) permite monitorear los cambios que ocurren durante el pretratamiento . Después del pretratamiento de celulosa con CBDs en solución amortiguadora a 42°C por 15 h bajo agitación vigorosa, las muestras fueron colectadas y su contenido de cristalinidad fue determinado por difracción de rayos X (XRD, por sus siglas en inglés) , mientras el sobrenadante fue analizado para la presencia de extremos reductores solubles. No fueron liberados extremos reductores de la muestra control de la solución amortiguadora. Mientras la cantidad de extremos reductores solubles obtenidos con CBDs fue muy baja (< 120 g.mL"1, comenzando de una concentración de celulosa a 20 mg.mL"1) , fue consistente por arriba de la solución amortiguadora de procedencia. Lo más probable es que la familia I CBDs no tenga ninguna actividad hidrolítica; además, pequeños oligómeros solubles fueron liberados de la superficie de celulosa sobre la unión/procesamiento de CBDs . No se pudo observarse actividad interrumpida por ejemplo ni formación de aglomerados tampoco precipitación rápida sin CBDs. Después de la incubación sólo con solución amortiguadora (control), la cristalinidad de ambos tipos de celulosa (Avicel y fribrosa) mostró tener un ligero incremento como se mostró en la Tabla 3 abajo.

Tabla 3. Efecto de 15 h de incubación con solución amortiguadora y dominios de unión a celulosa sobre cristalinidad de celulosa (CrI) como se determinó mediante difracción de Rayos X.

Acetato de sodio (pH 5.0, 50 mM) . b Tiempos de incubación largos (> 48 h) . n.d. No determinado Aún cuando no se desea se limitado a ninguna teoría en particular, el incremento de la cristalinidad podría deberse a un fenómeno que referido como "recristalización" descrito en, por ejemplo, Ouajai, S., Shanks, R.A. , 2006. Solvent and enzyme induced recristallization of mechanically degraded hemp cellulose. Cellulose, 13, 31-44. El incremento (de 60% a arriba de 65-66% en promedio por Avicel, y 72% arriba a 74% para celulosa fibrosa) no es probable atribuirlo a la eliminación de material no cristalino de la celulosa, puesto que ningunos extremos reductores solubles fueron liberados en la muestra de control de la solución amortiguadora. Además, el secado por congelamiento no tiene efecto en la cristalinidad de la celulosa de forma que sólo la incubación extendida en solución amortiguadora resultó en' un incremento dramático en el índice de cristalinidad (adicionalmente, ambos solución amortiguadora y muestras pretratadas CBD fueron secadas por congelación antes del análisis XDR) . El uso de CBDs (arriba de 10 pg.mg"1 a 40 pg.núV1 de celulosa en un paso típico de pretratamiento) resultó en una tendencia diferente, como no únicamente previno el sustrato de la recristalización, pero también redujo la cristalinidad inicial de celulosa. La cristalinidad de celulosa Avicel alcanzó el 58% después de la incubación con una mezcla de CBDs, mientras la cristalinidad de celulosa fibrosa alcanzó el 68%, una caída significativa de los índices de cristalinidad obtenidos después de la incubación en únicamente solución amortiguadora. Cuando la celulosa fue incubada con CBDs puro de celobiohidrolasa I Cel7A (CBDCei7A) durante periodos extensivos de incubación (> 48 h) , una incluso mayor reducción en cristalinidad fue obtenida con Avicel (debajo de 53%, como se mostró en la Figura 14) .

Aunque la diferencia entre el espectro pareciera limitada a una porción a los patrones de XRD, el método analítico descrito arriba para la interpretación de datos de XRD de celulosa permitió la determinación precisa del índice de cristalinidad. La caída en intensidad observada a un ángulo de Bragg de 22.5° ((200) plano) cuenta para la reducción total en cristalinidad. Entonces, CBDs de Trichoderma reesei (perteneciente a la familia I CBD, junto con CBDs de celulasas de Phanerochaete chrysosporium o Penicilliu janthinellum) , aunque no es catalíticamente activo con celulosa, tiene un fuerte efecto en la estructura de la celulosa, como la cristalinidad total fue reducida significativamente. De forma interesante, le plano cristal (200) parece ser el único afectado por esos cambios como se ilustró en la Figura 14. En general, los CBDs son responsables por el fraccionamiento de los enlaces de hidrógeno intermolecular de tal manera que la cristalinidad de la celulosa es reducida notablemente. Aunque no se desea estar limitado a ninguna teoría en particular es más probable que proceda mediante un proceso dinámico (movimiento procesivo sobre la superficie de celulosa requerida) , que es todavía poco entendida.

Hidrólisis de celulosa pretratada con CBD La celulosa incubada con CBDs por 15 h fue hidrolizada por adición de celulasas (suplementadas con ß-glucosidasa) a la mezcla pretratada (proceso de un paso) . El pretratamiento de Avicel a 40 mg.mL"1 afectó la conversión como se mostró en la Figura 15A, como la cantidad de azúcar liberada de muestras pretratadas con CBD (cristalinidad reducida de 58%, Tabla 3) fue 25% mayor que la liberada de muestras pretratadas con solución amortiguadora (incremento de cristalinidad de 65%, Tabla 3) después de 30 min de tiempo de hidrólisis (7.9 mg.mL"1 vs . 6.3 mg.mL"1 glucosa respectivamente) . Tal incremento podría potencialmente permitir una reducción en el costo del proceso enzimático que es uno de los mayores factores que contribuyen a los costos en producción de biocombustible a partir de biomasa.

De forma interesante, no hay diferencia significante en la velocidad comparada con la incubación con solución amortiguadora sólo podría ser monitoreada a 20 mg.mL"1 concentración de Avicel cuando se usa la mezcla de CBDs, incluso cuando la concentración de CBD fue incrementada a 12 g.mL"1 (Fig. 15A) . Un comportamiento similar fue observado con celulosa fibrosa: la incubación a 20 mg.mL"1 concentración de FC no dio un cambio significativo en la conversión comparado a la incubación sólo en solución amortiguadora (Fig. 15B) , mientras un incremento del 23% fue obtenido después de la incubación con CBDs a 40 mg.mL"1 FC comparado a la incubación en solución amortiguadora (relativo al 68% vs . 74% cristalinidad respectivamente, Tabla 3) . La velocidad mucho menor obtenida en la conversión de FC comparada a Avicel puede ser en parte explicada por la alta cristalinidad inicial (72% vs . 60% para muestras no tratadas; sin embargo el área de superficie y tamaño de partícula también pueden contribuir) .

Se observó que el pretratamiento con CBDs por 8 h en lugar de > 15 h no llevó a un cambio significativo en la cantidad de glucosa liberada durante el paso de hidrólisis comparado a la muestra incubada en solución amortiguadora. La incubación con CBDs abre nuevas posibilidades en el pretratamiento con celulosa y evita el uso de condiciones severas (tales como alta temperatura o concentración acida) o aislamiento de la celulosa de la mezcla de pretratamiento antes de la hidrólisis con celulasas.

La secuencia exacta de aminoácidos de la familia I CBDs parece menos importante para el mejoramiento de la velocidad: el pretratamiento con CBDCei7A produjo resultados comparables a aquellos con una mezcla de CBDs: velocidades incrementadas i) después del pretratamiento a 42 °C (e incluso 37°C) con CBDCei7A comparado sólo a la solución amortiguadora, ii) después de 30 min de hidrólisis (7.5 mg.mL"1 vs . 6 mg.mL"1) : 25% de incremento en la concentración de glucosa, y iii) bajo condiciones similares (34 mg.mL"1 concentración de Avicel comparada a 40 mg.mL"1 con la mezcla) . Sin embargo, el pretratamiento condujo a una menor concentración de celulosa (20 mg.mL"1) también produjo una rápida conversión, como hubo una menor caída en la velocidad en el caso de la muestra pretratada a 20 mg.mL"1 (comparada a 40 mg.mL"1 como se mostró en la Fig. 16) .

Aún cuando no se desea se limitado a ninguna teoría en particular la deserción de CBDs sobre la. dilución llevada a cabo previa a la hidrólisis puede ser responsable para velocidades más altas después del pretratamiento con una mezcla de CBD a 40 mg.mL"1 (comparada a un no mejoramiento a 20 mg.mL"1) . Tal deserción liberaría los sitios de unión para celulasas en la superficie de celulasa y entonces incrementar la velocidad de hidrólisis en general. Aunque la incubación en solución amortiguadora permitió un incremento más que decremento en la cristalinidad de la celulosa en general (Tabla 3), proporciona hidratación de la muestra y un incremento cercano a dos veces la velocidad de hidrólisis fue observado comparado a emplear celulosa seca sin pretratamiento. Entonces, el incremento en la velocidad obtenida después del pretratamiento con CBDs puede ser una combinación del efecto de hidratación de la solución amortiguadora y la reducción en cristalinidad de CBDs.

La concentración incrementada de CBD durante el pretratamiento permitió un aumento en la producción de glucosa en el paso de hidrólisis como se muestra en la Figura 17. La presente carga de 9 g.mL*1 no satura la superficie a partir de 150 pg.mL"1 de celulasa a una carga total de 1230 g.mL"1 unida a la superficie de celulosa como se mostró por Hall, et al, 2010. Cellulose crystallinity - a key predictor of the enzymatic hydrolysis rate. Febs Journal, 277, 1571-1582. Y no hubo saturación de Avicel empleando arriba de 470 g.mL"1 CBDCei7A (correspondiente a 49 g.mL"1 unido a CBD) como se mostró por Stahlberg, et al., 1991. A New Model for Enzymatic-Hydrolysis of Cellulose Base don the 2-Domain Structure of Cellobiohydrolase-I . Bio-Technology, 9, 286-290.

En la ausencia de agitación durante el pretratamiento (pero cuando la agitación fue aún proporcionada) , las velocidades de reacción en general fueron 40% menores y la incubación con CBDs de manera sorprendente no condujo a un incremento en la concentración de glucosa como se mostró en la Figura 18. El uso de barras de agitación 72% tan largas como el diámetro interno de los viales resultaron en arriba de 1.5 veces mayores niveles de conversión en solución amortiguadora, un efecto positivo de la incubación CBD, pero reproducibilidad reducida (lo más probable debida a la agitación no homogénea debido a limitaciones geométricas en el vial de reacción) . En adelante, las barras de agitación de 55% del diámetro interno del vial fueron utilizadas. Probablemente, la pérdida de convección continua en la ausencia de agitación previene el desplazamiento lateral de las moléculas de CBD y entonces limita su efectividad, dada la ausencia de eventos catalíticos como una fuente de energía potencial para el movimiento de CBD junto con la superficie de celulosa.

De manera sorpresiva e inesperada, la preincubación de celulosa con CBDs bajó este índice de cristalinidad y resultó en una mayor concentración de glucosa en la reacción subsiguiente de hidrólisis. Además, se observó que la adición simultánea de CBDs a muestras de celulosa no pretratadas no mostró ningún mejoramiento en los niveles de conversión. Entonces, el uso de CBDs en un paso de pretratamiento en lugar de un proceso de un solo paso combinando la adición de CBDs y enzimas de longitud completa es sorprendente e inesperadamente efectivo. Aún cuando no se desea se limitado a ninguna teoría en particular, puede ser que la adición simultánea de CBDs a la mezcla de hidrólisis evita la reducción de la cristalinidad por CBDs debida a la unión competitiva con celulasas y/o hidrólisis de celulosa por celulasas.

Termoestabilidad de CBDs De manera similar a las condiciones utilizadas a la hidrólisis enzimática de la celulosa pretratada, el pretratamiento con CBDs también fue llevado a cabo a 50 °C. Después de 15 h de pretratamiento a 50°C e hidrólisis por 30 min, se observó que la conversión fue sólo ligeramente menor que después del pretratamiento a 42 °C indicando que CBDs puede ser considerado relativamente termoestable . Esta observación fue confirmada con experimentos de unión, en donde celulasas de longitud completa mostraron unirse de manera similar a Avicel después de 15 h de incubación a 50 °C, comparadas al almacenamiento a 4°C como se muestra en la Tabla 4 abajo.

Tabla 4. Efecto de 15 h de incubación a 50°C en la actividad catalítica de celulasas y dominios catalíticos (CDs) y unión a celulasas en Avicel (comparado a almacenamiento estándar a 4°C) .

Temp. Actividad (conc. de glucosa Capacidad de unión de en mg.mL"1) (Celulasas unidas incubación Coctel de celulasa CDs g.mg"1) 4°C Después de 6 h:5.6 Después de 6 h:1.2 37.3 (90 µ?.p^'1 total agregados) Después de 22 h:8.2 Después de 22 h:2.2 38.4 (150 pg.mg"1 total agregados) 50° Después de 6 h:3.2 Después de 6 h:0.5 41.4 (90 g.mg"1 total agregados) Después de 22 h:3.6 Después de 22 h:0.7 44.0(150 pg.mg"1 total agregados) La actividad dé celulasas, sin embargo, fue afectada por el mismo periodo de incubación a 50°C (una reducción de 1.8 veces después de 6 h de hidrólisis, arriba de 2.3 después de 22 h) . La actividad catalítica de CDs fue incluso más reducida después de la incubación a 50°C (una reducción de 2.4 y 3.1 veces más en la concentración de glucosa después de 6 h y 22 h respectivamente) . Puede entonces concluirse que la termolabilidad observada de las celulasas es mayormente debida a la pérdida de la actividad catalítica más que la capacidad de unión, como el pretratamiento de celulosa con CBDs puede llevarse a 50 °C.

CBDCei7A es un péptido pequeño (37 residuos) y hecho de una hoja ß antiparalela de triple hebra irregular como se reportó en, por ejemplo, Kraulis, et al., 1989. Determination of the 3-Dimensional Solution Structure of the C-Terminal Domain of Cellobiohydrblase- I from Trichoderma-Reesei - a Study Using Nuclear Magnetic-Resonance and Hybrid Distance Geometry Dynamical Simulated Annealing. Biochemistry, 28, 7241-7257. Mientras no se desee estar unido a cualquier teoría en particular puede ser que la estabilidad a altas temperaturas pueda ser al menos en parte debido a su estructura compacta y/o los dos puentes disulfuro .

Conclusiones Los dominios de unión a celulosa tuvieron una estructura impactada de celulosa sobre la incubación. La cristalinidad de diferentes tipos de celulosa (microcristaliná y fibrosa) fue reducida después del tratamiento con CBDs, dejando los sustratos menos recalcitrantes a la hidrólisis enzimática, y fue obtenido un incremento por arriba de aproximadamente 25% en la concentración de glucosa durante hidrólisis. Esos sorpresivos e inesperados resultados mostraron que los dominios de unión a celulosa pueden ser utilizados como un método de pretratamiento para el material celulósico. El pretratamiento inventivo emplea moléculas biológicas y relativamente suaves condiciones en lugar de condiciones y químicos duros. Además, el tratamiento inventivo puede ser utilizado de tal manera que no requiera un cambio de solvente. Más aún, la capacidad de unión de CBDs es retenida después de incubación extensiva a 50°C mientras hay una pérdida significativa de actividad catalítica.

Leyendas de Figuras Fig. 1. SDS-PAGE de cel7A purificado de Trichoderma reesei y dominio catalítico cel7A después de la división con papaína. Carril 1: escala, carril 2: cel7A purificado, carril 3: dominio catalítico (CD) concentrado después de la filtración a través de una membrana de 30kDa (teñido por Coomassie) .

Fig. 2. Hidrólisis enzimática de Avicel después del tratamiento CBD (los números se refieren a la muestra de celulosa de la Tabla 2) . Las reacciones se corrieron como sigue: 20 mg/ml Avicel, 50 mM NaOAc pH 5, 50°C (#3 y 4 fueron utilizados como un polvo secado por congelación, generado por análisis de difracción de rayos X) . Todas las muestras fueron incubadas 1 h a 50°C antes de la adición de la enzima a la mezcla de reacción .

Fig. 3. Efectos del tiempo en la incubación CBD (después de reportar el periodo de tiempo, las enzimas fueron añadidas a la mezcla de CBD y Avicel y la hidrólisis fue monitoreada mediante la medición de contenido de glucosa, expresado como % conversión) .

Fig. 4. Efecto de la solución amortiguadora de incubación sobre la velocidad de hidrólisis comparado a la incubación CBD (13 h) . Avicel fue incubado en una solución CBD o en solución amortiguadora por 13 h (incluso 1 h' en solución amortiguadora) . Las celulasas fueron después agregadas a la mezcla de reacción y el contenido de glucosa fue monitoreado por arriba de 2.5 h.

Fig. 5. Efecto del tiempo de la solución amortiguadora de incubación sobre las velocidades de hidrólisis. Avicel fue incubado en solución amortiguadora más de varios periodos de tiempo. Las celulasas fueron entonces agregadas a la mezcla de reacción y el contenido de glucosa fue monitoreado por arriba de 4 h .

Figs . 6A-6B. Experimento de la optimización de la concentración de CBD (Vr representa la concentración de inicio) . La gráfica b consiste de los mismos datos como la gráfica a pero las líneas conectan los puntos de los datos.

Fig. 7. La hidrólisis de varios tiempos de tratamiento de CBD .

Fig. 8. El efecto de varias concentraciones de CDB .

Fig. 9. El efecto de la adición secuencial y eliminación de CBD.

Fig. 10. El efecto de un tratamiento a 45°C.

Fig. 11. El efecto de un tratamiento a 50°C.

Fig. 12. Producción de extremos reductores de pasto varillas utilizando celulasas y ß -glucosidasa después del tratamiento con CBD, tratamiento con solución amortiguadora, sin tratamiento con adición simultánea de CBD y sin tratamiento (muestra seca) .

Fig. 13. SDS-PAGE antes y después de la división de celulasas con papaína. Carril 1: escala, carril 2: dominios catalíticos (CDs) de celulasas, carril 4: Cel7A purificado después de la cromatografía de intercambio aniónico, carril 5: CD de Cel7A purificado, carril 6: escala, carriles 7 y 8: descarga del coctel de celulasa de Trichoderma reesei después de la filtración a través de una membrana de 30 kDa y CDs correspondientes, carril 9: Cel7A purificado (descarga baja).

Fig. 14. Espectro de XRD para muestras de Avicel tratado con CBDCel7A (dominio de unión a celulosa de Cel7A purificado) , CDCei7A (dominio catalítico) o solución amortiguadora. Los datos del espectro han sido normalizados de acuerdo a Bansal et al., 2010. Multivariate statistical análisis of X-ray data from cellulose: A new method to determine degree of crystallinity and predict hydrolysis rates . Bioresource Technology, 101, 4461-4471. 1 y 2 se refieren a experimentos duplicados.

Fig. 15A. Perfil de hidrólisis después de pretratamiento con mezcla de CBDs por 15 h a 42°C (la hidrólisis se corrió a 50°C y 20 mg.mL"1 de celulosa. La concentración de celulosa se refiere a la concentración real durante el pretratamiento) .

Fig. 15B. Perfil de hidrólisis de celulosa fibrosa (FC, por sus siglas en inglés) después del pretratamiento con una mezcla de CBDs por 15 h a 42°C (la hidrólisis se corrió a 50°C y 20 mg.mL"1 de celulosa. La concentración de celulosa se refiere a la concentración real durante el pretratamiento) .

Fig. 16. Perfil de hidrólisis de Avicel después del pretratamiento con una mezcla de CBDCei7A por 15 h a 42°C (la hidrólisis se corrió a 50°C y 20 mg.mL"1 de celulosa. La concentración de celulosa se refiere a la concentración real durante el pretratamiento) .

Fig. 17. Efecto de varias concentraciones CBD en el paso de pretratamiento (15 h a 42°C) sobre la velocidad de hidrólisis (la hidrólisis se corrió a 50°C y 20 mg.mL"1. La concentración de celulosa se refiere a la concentración real durante el pretratamiento) .

Fig. 18. Efecto de la barra de agitación durante el pretratamiento de celulosa con CBDs sobre las velocidades de hidrólisis. El pretratamiento se corrió a 42°C por 15 h sin barra de agitación (10 pg.mg"1), o con barras de agitación largas (7.5 g.mg"1) . La hidrólisis se corrió a 50°C y 20 mg.mL"1 de concentración de celulosa.

Fig. 19. Secuencias de aminoácidos de organismos mayores de CBD . Las secuencias de la Figura 19 fueron indentificadas mediante una búsqueda BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.g0v/Blast.cgi#) (Altschul SF, Gish W, Millar W, Myers E , Lipman DJ: Basic Local Alignment Research Tool . Journal of Molecular Biology 1990, 215:403-410). Las secuencias fueron alineadas utilizando clustalW (Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ: CLUSTAL : improving the sensitivity of progressive múltiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res 1994, 22 (22) : 4673-4880) . Los nombres de las enzimas y especies, de las cuales son parte las secuencias en la Fig. 19 (de acuerdo al número en la alineación xx | en donde xx denota el número; por ejemplo, la secuencia del Trichoder a reesei Cel7A CBD es designada l| 1/1-36 trazado en la Fig. 19 es el número 1 la Tabla 5 abajo) .

La materia objeto reclamada no debe ser limitada en alcance por las modalidades aquí descritas. De hecho, varias modificaciones de la invención además a aquellas aquí descritas serán evidentes para las personas experimentadas en la técnica a partir de la descripción precedente. Tales modificaciones intentan caer dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Todas las referencias aquí citadas están aquí incorporadas por referencia en su totalidad en la medida que no son inconsistentes y para todos los propósitos a la misma medida como si cada publicación individual, patente o aplicación patente fue específicamente e individualmente indicada a ser incorporada por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

La citación de cualquier publicación es para su descripción previa a la fecha de presentación y no debería ser construida como una admisión que la presente invención no es acreedora para tal publicación anterior en virtud de la invención previa.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un proceso para tratar materia prima que comprende holocelulosa, caracterizado porque comprende: a) mezclar la materia prima con una solución que comprende dominios de unión a celulosa para formar una mezcla; y b) someter la muestra a condiciones suficientes para reducir la cristalinidad de la holocelulosa

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los dominios de unión a celulosa son derivados de celobiohidrolasa I (cel7A) o celobiohidrolasa II (cel6A) .

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los dominios de unión a celulosa son derivados de celobiohidrolasa I (cel7A) producidos por Trichoderma reesei .

4. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la mezcla es sometida a una temperatura mayor de 30°C por un tiempo suficiente para reducir la cristalinidad de la holocelulosa.

5. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la mezcla es sometida a una temperatura incrementada por al menos 8 horas .

6. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la mezcla es sometida a una agitación tal que sustancialmente todos los sólidos son suspendidos.

7. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque los dominios de unión a celulosa tienen una concentración de dominios de unión a celulosa desde 5 hasta 55 pg/ml .

8. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la solución que comprende dominios de unión a celulosa además incluye una solución amortiguadora apropiada y en donde la solución tiene un pH desde 4.5 hasta 5.5.

9. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque además comprende hidrolizar el producto del paso Ib de conformidad con la reivindicación 1 para producir una composición que comprenda por lo menos un azúcar fermentable y en donde por lo menos un azúcar fermentable en la composición es por lo menos 10% más ' que un proceso comparable que no emplea dominios de unión a celulosa.

10. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la proporción de dominios de unión a celulosa para un dominio catalítico es mayor que 1:1.

11. Una composición apropiada para reducir la cristalinidad de la celulosa caracterizada porque comprende celulosa, una concentración apropiada de una solución que comprende dominios de unión a celulosa, y una solución amortiguadora apropiada.

12. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque los dominios de unión a celulosa son derivados de celobiohidrolasa I (cel7A) producidos por Trichoderma reese .

13. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-12, caracterizada porque la solución que comprende dominios de unión a celulosa tiene una concentración desde 5 hasta 55 µg/ml en donde la solución amortiguadora comprende una solución amortiguadora de acetato de sodio de 25 a 75 mM y en donde la solución tiene un pH de 5.

14. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-12, caracterizada porque la solución que comprende dominios de unión a celulosa tiene una proporción de dominios de unión a celulosa con respecto a dominio catalítico que es mayor que 1:1.

15. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-12, caracterizada porque la solución que comprende dominios de unión a celulosa tiene una proporción de dominios ' de unión a celulosa con respecto a un dominio catalítico que es mayor que 5:1.