JP5410045B2 - エンドグルカナーゼ活性を有する新規タンパク質、そのdna、及びそれらの利用 - Google Patents
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Description
また、子嚢菌がセルロースを分解した培地の濾液は、セルラーゼ混合物として市販されてもいる。
しかしながら、これまでにGHファミリー6と7に属するセロビオヒドロラーゼと(例えば、非特許文献1参照)、GHファミリー5と12に属する4つのエンドグルカナーゼ(例えば、非特許文献2、3参照)が生産されることが知られているに過ぎず、GHファミリー45に属するエンドグルカナーゼは見つかっておらず、また、詳細なセルロース分解の仕組みも判明していない。
<1> 担子菌由来のタンパク質であって、SDS−PAGEで測定した分子量が18kDaであり、かつ、エンドグルカナーゼ活性を有することを特徴とするタンパク質である。
<2> 担子菌が、ファネロケーテ クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)である前記<1>に記載のタンパク質である。
<3> エンドグルカナーゼ活性を有することを特徴とする、下記(a)から(d)のいずれかに記載のタンパク質である。
(a)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号:1で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質
(c)配列番号:1で示されるアミノ酸配列の27位〜206位のアミノ酸配列を含むタンパク質
(d)配列番号:1で示されるアミノ酸配列の27位〜206位のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質
<4> エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする、下記(a)から(f)のいずれかに記載のDNAである。
(a)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号:1で示されるアミノ酸配列の27位〜206位のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(d)配列番号:1で示されるアミノ酸配列の27位〜206位のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(e)配列番号:2で示される塩基配列を含むDNA
(f)配列番号:2で示される塩基配列を含むDNA、及び、前記DNAの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
(g)配列番号:2で示される塩基配列の79位〜621位の塩基配列を含むDNA
(h)配列番号:2で示される塩基配列の79位〜621位の塩基配列を含むDNA、及び、前記DNAの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
<5> 前記<4>に記載のDNAを含有することを特徴とする組換えベクターである。
<6> 前記<5>に記載の組換えベクターにより形質転換されたことを特徴とする形質転換体である。
<7> 前記<6>に記載の形質転換体を培養する工程と、前記培養物からエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程とを含むことを特徴とするエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法である。
<8> 前記<1>〜<3>のいずれかに記載のタンパク質、及び、担子菌の少なくともいずれかを用いて、バイオマス原料から糖を得ることを特徴とする糖の製造方法である。
<9> さらに前記<1>〜<3>のいずれかに記載のタンパク質以外のセルラーゼを用いる、前記<8>に記載の糖の製造方法である。
<10> 前記<8>〜<9>のいずれかに記載の糖の製造方法により得られた糖を、発酵させて、エタノールを得ることを特徴とするエタノールの製造方法である。
<11> 前記<1>〜<3>に記載のタンパク質の少なくともいずれかを含有することを特徴とする食品である。
<12> 前記<1>〜<3>に記載のタンパク質の少なくともいずれかを含有することを特徴とする飼料である。
<13> 前記<1>〜<3>に記載のタンパク質の少なくともいずれかを含有することを特徴とする洗剤である。
<14> 前記<1>〜<3>に記載のタンパク質の少なくともいずれかを用いて、セルロース含有織物を処理することを特徴とするセルロース含有織物の処理方法である。
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質は、担子菌由来のタンパク質であって、SDS−PAGEで測定した分子量が18kDaである。
また、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質には、配列番号:1に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質や、配列番号:1で示されるアミノ酸配列の27位〜206位のアミノ酸配列を含むタンパク質も含まれる。
そして、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質には、配列番号:1で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質や、配列番号:1で示されるアミノ酸配列の27位〜206位のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質も含まれる。
ここで、「数個のアミノ酸」とは、エンドグルカナーゼ活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、アミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加される領域としては、エンドグルカナーゼ活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号:1で示されるアミノ酸配列や、配列番号:1で示されるアミノ酸配列の27位〜206位のアミノ酸配列と配列同一性を有するものであってもよい。前記配列同一性としては、エンドグルカナーゼ活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、70%以上が好ましく、80%以上がより好ましく、90%以上がさらに好ましく、95%以上が特に好ましい。
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の分子量は、SDS−PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)により測定することができる。
前記SDS−PAGEの方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の方法を用いることができる。
前記SDS−PAGEに用いるポリアクリルアミドゲルとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、12%ポリアクリルアミドゲルなどが挙げられる。
前記電気泳動に用いる装置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Mini−Protein II(Bio−Rad社製)などが挙げられる。
本発明のタンパク質がエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質であることは、前記タンパク質のエンドグルカナーゼ活性を測定することにより確認することができる。
前記エンドグルカナーゼ活性を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、試料と基質を反応させ、得られた生成物を検出することにより、測定することができる。
前記基質としては、エンドグルカナーゼが分解することができるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、非晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、リケナン、大麦β−グルカン、グルコマンナンなどが挙げられる。
前記反応の温度としては、エンドグルカナーゼが活性を有する温度であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、30℃などが挙げられる。
前記生成物としては、前記基質の分解物であり、例えば、還元糖などが挙げられる。
前記検出の方法としては、前記生成物を検出することができれば、特に制限はなく、目的に応じて選択することができ、例えば、p−hydroxybenzoic acid hydrazide(PHBAH)法による検出、薄層クロマトグラフィー(TLC)による検出、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による検出などが挙げられる。
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は、公知の方法により決定することができ、例えば、プロテインシーケンサー(Model 491 cLc;Applied Biosystems社製)を用いて決定することができる。
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の基質としては、例えば、非晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、リケナン、大麦β−グルカン、グルコマンナンなどが挙げられ、中でもリケナン、大麦β−グルカンが好適である。
前記基質の分解物としては、例えば、単糖から7糖の還元糖が挙げられ、中でも3糖〜5糖の還元糖を好適に得ることができる。
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を用いる温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、10℃〜70℃が好ましく、20℃〜60℃がより好ましく、30℃〜50℃が特に好ましい。前記温度が10℃未満であると、前記エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が機能しないことがあり、70℃を超えると、前記エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が失活することがある。一方、前記温度が前記特に好ましい範囲内であると、効率的に基質を分解することができる点で有利である。
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を用いるpHとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、2.0〜8.0が好ましく、3.0〜7.0がより好ましく、4.0〜6.0が特に好ましい。前記pHが2.0未満、又は8.0を超えると、酵素が失活することがある。一方、前記pHが前記特に好ましい範囲内であると、効率的に基質を分解することができる点で有利である。
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質は、他のセルラーゼと共に用いると、相乗作用により、基質を効率的に分解することができる。前記他のセルラーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ファネロケーテ クリソスポリウム(P.chrysosporium)のCel6Aなどが挙げられる。
併用する場合の本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質:前記他のセルラーゼのモル比としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、75:25〜25:75が好ましく、75:25がより好ましい。
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質は、担子菌の培養物から得ることができ、また、本発明の形質転換体を用いた方法により、好適に製造することもできる。
前記担子菌を用いたエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法は、担子菌を培養する工程(培養工程)と、前記培養物からエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程(採取工程)とを少なくとも含み、必要に応じてさらにその他の工程を含む。この前記製造方法は、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を製造する第1の形態である。
前記培養工程は、担子菌を培養する工程である。
前記担子菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、担子菌門 ハラタケ亜門に属する担子菌が好ましく、担子菌門 ハラタケ亜門 ハラタケ綱に属する担子菌がより好ましく、担子菌門 ハラタケ亜門 ハラタケ綱 コウヤクタケ目に属する担子菌が更に好ましく、ファネロケーテ クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)が特に好ましい。
前記液体培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、セルロースを含有するKremer and Wood培地(Kremer, S. M., and P. M. Wood. 1992. Evidence that cellobiose oxidase from Phanerochaete chrysosporium is primarily an Fe(III) reductase. Kinetic comparison with neutrophil NADPH oxidase and yeast flavocytochrome b2. Eur. J. Biochem. 205:133−138.)が挙げられる。
前記培養の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、20℃〜45℃が好ましく、30℃〜40℃がより好ましく、37℃が特に好ましい。前記培養の温度が20℃未満であると、担子菌の生育が遅くなることがあり、45℃を超えると担子菌が成育しないことがある。一方、前記培養の温度が前記特に好ましい範囲であると、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を効率よく製造できる点で有利である。
前記培養の日数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、1日〜30日が好ましく、2日〜14日がより好ましく、3日〜7日が特に好ましい。前記培養の日数が1日未満であると、担子菌数が少なく、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造量が少ないことがあり、30日を超えると、死菌となる担子菌数が多くなったり、製造されたエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が分解されてしまうことがある。一方、前記培養の日数が前記特に好ましい範囲であると、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を効率よく製造できる点で有利である。
前記採取工程は、前記培養工程で得られた培養物からエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程である。
前記採取の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が、菌体内または菌体表面に生産された場合は、培養物から菌体を分離し、その菌体を超音波破砕などの公知の処理をすることにより、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取することができる。また、例えば、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が、培養液中に生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することにより、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取することができる。
上記採取したエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質は、精製することが好ましい。前記精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過などの方法が挙げられる。
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を保存するために凍結乾燥する工程、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の濃度を上げるために濃縮する工程などが挙げられる。
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法は、後述する本発明の形質転換体を培養する工程(培養工程)と、前記培養物からエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程(採取工程)とを少なくとも含み、必要に応じてさらにその他の工程を含む。この前記製造方法は、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を製造する第2の形態である。
前記培養工程は、後述する本発明の形質転換体を培養する工程である。
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、寒天培地を用いた固体培養方法、液体培地を用いた液体培養方法などが挙げられる。中でも、液体培養方法が、タンパク質を多く製造できる点で、好ましい。
前記培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、用いる形質転換体に応じて選択することが好ましい。例えば、前記形質転換体として、組換えベクター中の発現制御配列がアルコール酸化酵素プロモータであるピキア・パストリス(Pichia pastoris)を用いる場合、前記培地としては、例えば、酵母エキスとペプトンとメタノールを含む培地を用いることが好ましい。また、例えば、形質転換体として、組換えベクター中の発現制御配列がGAL1プロモータであるサッカロミセス・セルビシエ用いる場合、前記培地としては、例えば、ラフィノースを炭素源とする液体最少培地を前培養の培地として用い、その後の培養の培地としては、ガラクトースとラフィノースを炭素源とする液体最少培地を用いることが好ましい。また、例えば、形質転換体として、組換えベクター中の発現制御配列がlacプロモータである大腸菌を用いる場合、前記培地としては、例えば、IPTGを含有する液体培地を用いることが好ましい。
前記採取工程は、前記培養工程で得られた培養物からエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程である。
前記採取の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が、菌体内または菌体表面に生産された場合は、培養物から菌体を分離し、その菌体を超音波破砕などの公知の処理をすることにより、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取することができる。また、例えば、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が、培養液中に生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することにより、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取することができる。
上記採取したエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質は、精製することが好ましい。前記精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過などの方法が挙げられ、また、前記エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質に精製用のタグ配列が付加してある場合には、付加されたタグに対応する精製の方法を用いることもできる。前記付加されたタグに対応する精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、付加されたタグが、ヒスチジン6残基の配列の場合、ニッケルカラムを用いた精製の方法を用いることができる。
前記その他の工程としては、本発明の効果を害しない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、上述の<担子菌を用いたエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法>に記載した工程などが挙げられる。
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAは、配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、配列番号:1で示されるアミノ酸配列の27位〜206位のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、配列番号:2で示される塩基配列を含むDNA、配列番号:2で示される塩基配列の79位〜621位の塩基配列を含むDNAである。
また、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAには、配列番号:1で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAや、配列番号:1で示されるアミノ酸配列の27位〜206位のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAも含まれる。ここで、「数個のアミノ酸」とは、上述と同様に、エンドグルカナーゼ活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、アミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加される領域としては、エンドグルカナーゼ活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
さらに、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAには、配列番号:2で示される塩基配列を含むDNA、及び、前記DNAの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAや、配列番号:2で示される塩基配列の79位〜621位の塩基配列を含むDNA、及び、前記DNAの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAも含まれる。
なお、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAは、配列番号:2で示される塩基配列を含むDNAや、配列番号:2で示される塩基配列の79位〜621位の塩基配列を含むDNAと配列同一性を有するものであってもよい。前記塩基配列の同一性としては、エンドグルカナーゼ活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、70%以上が好ましく、80%以上がより好ましく、90%以上がさらに好ましく、95%以上が特に好ましい。
前記塩基配列の同一性は、上述したアミノ酸配列の同一性と同様にして決定することができる。前記塩基配列の同一性を分析するプログラムとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、blastnプログラムが挙げられる。前記プログラムを用いて配列同一性を分析のする際のパラメーターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、デフォルト値を用いることができる。
なお、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。一方、塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合もある。本発明のDNAには、このような人工的に調製されたDNA、又は天然の変異DNAが含まれる。
前記ゲノムDNAの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の遺伝子を有する生物からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー(ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PAC等が利用できる)を作成し、これを展開して、配列番号:2に記載の塩基配列やゲノム上のその近傍の塩基配列を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製する方法が挙げられる。また、配列番号:2に記載の塩基配列やゲノム上のその近傍の塩基配列に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRを行うことによって調製することも可能である。
前記cDNAの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の遺伝子を有する生物から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、配列番号:2に記載の塩基配列情報を基に作成したプローブやプライマーを用いて、コロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製する方法が挙げられる。
このように、ハイブリダイゼーション技術やPCR技術によって単離し得る、配列番号:2に示される塩基配列を含むDNA、あるいは前記DNA、及び、前記DNAの相補鎖とハイブリダイズするDNAもまた、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードしている限り、本発明のDNAに含まれる。
前記ストリンジェントな条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ナトリウム濃度が25mM〜500mMが好ましく、25mM〜300mMがより好ましく、温度が42℃〜68℃が好ましく、42〜65℃がより好ましい。例えば、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃が挙げられる。
こうして単離されたDNAは、配列番号2に記載の塩基配列又は、配列番号:2で示される塩基配列の79位〜621位の塩基配列と高い配列同一性を有すると考えられる。高い配列同一性とは、塩基配列全体で、70%以上が好ましく、80%以上がより好ましく、90%以上がさらに好ましく、95%以上が特に好ましい。このような塩基配列は、本発明のエンドグルカナーゼと実質的に同等の活性を有するタンパク質をコードしていると考えられる。
本発明の組換えベクターは、本発明のDNAを少なくとも含有し、必要に応じてさらにその他のDNAを含有する。
また、前記ベクターは、本発明のDNAを発現可能な発現ベクターであることが好ましい。
前記マーカー遺伝子としては、例えば、URA3、niaDのように宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、アンピシリン、カナマイシンなどの薬剤に対する抵抗遺伝子などが挙げられる。
前記制御配列としては、例えば、プロモータ配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列などが挙げられる。前記プロモータ配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、天然状態において本発明のDNAの発現を制御している固有のプロモータ以外のプロモータも用いることができる。
前記精製用配列としては、例えば、ヒスチジンをコードする塩基配列などが挙げられる。
ベクターに上記DNAを挿入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが挙げられる。
本発明の形質転換体は、本発明のベクター(発現ベクター)を宿主中に導入することにより得ることができる。
酵母へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法などが挙げられる。
細菌へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
動物細胞へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などが挙げられる。
昆虫細胞へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
前記PCR法としては、例えば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行い、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、組換えベクターが宿主に導入されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認することもできる。
本発明の糖の製造方法は、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質、及び担子菌の少なくともいずれかを用いて、バイオマス原料から糖を得ること(糖取得工程)を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記糖取得工程は、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質、及び担子菌の少なくともいずれかを用いて、バイオマス原料から糖を得る工程であり、必要に応じて更に本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質以外のセルラーゼを用いることができる。
また、前記バイオマス原料は、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
また、前記担子菌の使用量としては、特に制限はなく、担子菌が生産するエンドグルカナーゼの量などを考慮して適宜選択することができる。
なお、前記セルラーゼをさらに使用する場合、該セルラーゼの使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて選択することができるが、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質:前記セルラーゼのモル比が、75:25〜25:75が好ましく、75:25がより好ましい。
前記糖液は、例えば、そのまま後述する本発明のエタノールの製造方法に供してもよいし、以下のようなその他の工程を経て、後述する本発明のエタノールの製造方法に供してもよい。
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記糖液を、後述する発酵工程に適切となるようなpHに調整する工程などが挙げられる。
本発明のエタノールの製造方法は、前記糖の製造方法により得られた糖を、発酵させて、エタノールを得ること(発酵工程)を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記糖を発酵させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記糖を含む溶液に酵母等のアルコール発酵微生物を添加して、アルコール発酵を行わせる方法が、特に好ましい。前記酵母としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サッカロミセス属酵母などが挙げられる。なお、前記酵母は、天然酵母であってもよいし、遺伝子組み換え酵母であってもよい。
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記発酵工程により得られたエタノールを分離精製する工程などが挙げられる。前記分離精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蒸留などが挙げられる。
本発明の食品、及び飼料は、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含んでなる。
前記食品、及び飼料における、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記食品、及び飼料の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記食品、及び飼料は、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を含むため、例えば、食品、及び飼料に含まれるセルロースなどを分解することができ、消化を効率よくすることができる。
本発明の洗剤は、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含んでなる。
前記洗剤における、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記洗剤の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記洗剤は、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を含むため、例えば、洗浄対象物のセルロース繊維に詰まった汚れを効率よく取り除くことができる。
本発明のセルロース含有織物の処理方法は、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の少なくともいずれかを用いて、セルロース含有織物を処理すること(処理工程)を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記セルロース含有織物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジーンズが挙げられる。
また、前記処理工程における、本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の使用量、温度、時間などは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
例えば、本発明のセルロース含有織物の処理方法で、前記ジーンズを処理することで、例えば、ストーンウォッシング加工などを行うことができる。
エンドグルカナーゼ活性を有する新規タンパク質の遺伝子を得るために、まず、担子菌のファネロケーテ クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium) K−3株(Johnsrud, S. C., and K. E. Eriksson. 1985. Cross breeding of selected and mutated homokaryotic strains of Phanerochaete chrysosporium K−3 − New cellulase deficient strains with increased ability to degrade lignin. Appl. Microbiol. Biotechnol. 21:320−327.)が生産するタンパク質を、以下のようにして調べた。
上記ファネロケーテ クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium) K−3株を、2%セルロース(CF11;Whatman社製)を含有するKremer and Wood培地(Kremer, S. M., and P. M. Wood. 1992. Evidence that cellobiose oxidase from Phanerochaete chrysosporium is primarily an Fe(III) reductase. Kinetic comparison with neutrophil NADPH oxidase and yeast flavocytochrome b2. Eur. J. Biochem. 205:134)で、Habu, N., K. Igarashi, M. Samejima, B. Pettersson, and K. E. Eriksson. 1997. Enhanced production of cellobiose dehydrogenase in cultures of Phanerochaete chrysosporium supplemented with bovine calf serum. Biotechnol. Appl. Biochem. 26:98の記載に基づいて、3日間培養した。
前記培養後の培養液をろ過し、ガラス繊維濾紙(ADVANTEC(登録商標) GA−100;東洋濾紙(株)製)を用いて菌糸体を分離した。そして、分離した菌糸体は液体窒素で凍結し、後述する全RNAの抽出に用いた。
培養液のろ液500μLを遠心ろ過装置(Ultrafree(登録商標)−0.5 Centrifugal Filter Device、Millipore社製)で濃縮し、その濃縮液(未精製のタンパク質約100μg)を、Bio−Rad社製の装置(Mini−Protean II)を用いて、12%ポリアクリルアミドゲルのSDS−PAGEを行った。その結果、ファネロケーテ クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium) K−3株は、図1に示すようなタンパク質を生産していることがわかった。なお、図1において、「矢印」は、後述するN末端アミノ酸配列の決定を行ったタンパク質を示す。
その後、前記転写したPcCel45AのN末端のアミノ酸配列を、プロテインシーケンサー(Model 491 cLc;Applied Biosystems社製)により、決定した。その結果、PcCel45AのN末端アミノ酸配列は、ATGGYVQQATであった。
前記配列同一性検索は、BLASTプログラムとして、tblastnを用い、データベースとして、ファネロケーテ クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)のゲノムデータベースv2.0(http://genome.jgi−psf.org/Phchr1/Phchr1.home.html)を用いて行った。tblastnの設定は、「expect value」を「1e−1」、「scoring matrix」を「PAM30」とした以外は、デフォルト値とした。
その結果、前記PcCel45AのN末端アミノ酸配列は、機能が知られていないファネロケーテ クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)の「Scaffold 6、1798263−1798234」と一致することがわかった。
次に、前記PcCel45AのcDNAのクローニングを以下のようにして行った。
まず、上述した、凍結した菌糸体から、ISOGEN((株)ニッポンジーン製)を用いて、製造者のマニュアルに基づいて、全RNAを約200mg抽出した。
前記抽出された全RNA1μgからOligotex(TM)−dT30<Super>(タカラバイオ(株)製)を用いてmRNAを精製した。
そして、前記mRNAから、逆転写酵素(ReverTraAce;東洋紡績(株)製)と、3’RACEアダプタープライマー(Invitrogen社製)とを用いて、製造者のマニュアルに基づいて、First−strand cDNAを合成した。
その後、前記First−strand cDNAを用いて、前記PcCel45Aをコードする領域と3’非翻訳領域をPCRによって増幅した(94℃2分を1サイクル、98℃10秒・68℃30秒を25サイクル、4℃で終了)。PCRは、ポリメラーゼとしてKOD−Plus(version2;東洋紡績(株)製)を用い、プライマーとして、ファネロケーテ クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)のゲノム配列に基づいて設計したプライマー(Pccel45A−F1、Pccel45A−F2)と、リバースプライマー(Invitrogen社製)とを用いて、製造者のマニュアルに基づいて行った。
プライマー:
Pccel45A−F1:ATGGCGAAGCTGTCGATGTTCTTGGG
Pccel45A−F2:CTGACCGTCTCCGAGAAGCGTG
リバースプライマー:Abridged Universal Amplification Primer(Invitrogen社製)
プライマー:
Pccel45A−5’−R1:CAGCCTTGCCGCAAGCAGGAGAGCCGC
Pccel45A−5’−R2:CGCAAGCAGGAGAGCCGCAGCCCGAAT
上記で得られたPCR産物は、Zero Blunt(登録商標) TOPO(登録商標) PCR cloning kit(Invitrogen社製)と大腸菌E.coli JM109株(タカラバイオ(株)製)を用いてクローン化した。
そして、前記PCR産物の塩基配列を、Thermo Sequence Primer Cycle Sequencing Kit(GE Healthcare社製)と、DNA sequencer SQ5500E((株)日立ハイテクノロジーズ製)を用いて調べた。
なお、図2中、灰色の反転表示(KR)は、Kex2プロテアーゼのプロセシング部位を示し、これまでのセクレトーム研究で見つかっている配列は、ボールド文字で示す。
−シグナルペプチド分析−
シグナルペプチドについては、the Center for Biological Sequence AnalysisのSignalP 3.0サーバー(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)を用いて調べた。
その結果、上述のPcCel45AのN末端アミノ酸配列(図2の二重下線部で示す。)と異なる最初の19アミノ酸(図2の一重下線部で示す。)がシグナルペプチドであることが示唆された。
N型糖鎖付加部位については、the Center for Biological Sequence AnalysisのNetNGlyc 1.0サーバー(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)を用いて調べた。
その結果、1つのN型糖鎖付加部位が予測された(図2の反転表示部(NYT)で示す)。
その結果、4つのO型糖鎖付加部位が予測された(図2の囲み部で示す)。
前記PcCel45Aのアミノ酸配列について、BLASTプログラムとして、blastpを用い、データベースとして、NCBIタンパク質データベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)を用いて、配列同一性検索を行った。なお、blastpの設定は、デフォルト値とした。
その結果、前記PcCel45Aのアミノ酸配列は、真菌のGHファミリー45(EGV)に属するエンドグルカナーゼに対して、低い配列同一性を有しているのみであり、前記PcCel45Aは、新規のタンパク質であることがわかった。
前記PcCel45Aと最も配列同一性が高かったのは、仮説のタンパク質を除くと、ヒポクレア ジェコリナ(H.jecorina(T.reesei))のEGVであり、22%だった。また、前記PcCel45Aには、真菌のGHファミリー45(EGV)に属するエンドグルカナーゼに保存されている推定ドメインが含まれていないこともわかった。
5つのタンパク質
・コプリノプシス シネレア(Coprinopsis cinerea)の仮説のタンパク質(以下、「CcHP」と称することがある。)。
・ウスティラゴ メイディス(Ustilago maydis)の仮説のタンパク質(以下、「UmHP」と称することがある。)。
・アスペルギルス ニヅランス(Aspergillus nidulans)の仮説のタンパク質(以下、「AnHP」と称することがある。)。
・アスペルギルス フミガツス(Aspergillus fumigatus)の仮説のタンパク質(以下、「AfHP」と称することがある。)。
・ヒポクレア ジェコリナ(Hypocrea jecorina)のCel45A(以下、「HjCel45A」と称することがある。)。なお、仮説のタンパク質を除くと、前記HjCel45Aが、上述の18kDaのタンパク質のアミノ酸配列と最も配列同一性が高かったものである。
次にPcCel45Aのアミノ酸配列と、blastp検索において関連性を示した、真菌GHファミリー45のエンドグルカナーゼのサブファミリーB(以下、「Cel45−subB」と称することがある。)に属する酵素と、植物のエクスパンシン(Expansin)と、CAZy server上で真菌GHファミリー45のサブファミリーA(以下、「Cel45−subA」と称することがある。)に属する酵素と、真菌のスウォレニン(Swollenin)とを系統学的に分析した結果を図5に示す。
図5の系統樹は、最小距離法(minimum linkage method)により、MAFFTサーバー上のマルチプルアライメントの結果から作成し、FigTree(version1.1.2; http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)を用いて作成した。
また、図5に示すように、PcCel45Aが含まれる分岐群は、担子菌の中でコプリノプシス シネレア(Coprinopsis cinerea(EAU91056))、ウスティラゴ メイディス(Ustilago maydis(XP_761686))由来の仮説のタンパク質のみを含んでいた。
以上から、PcCel45Aは、GHファミリー45の新たなサブファミリーに分類される新規のタンパク質であることがわかった。以下に、PcCel45Aの製造方法の一例を挙げる。
−組換えベクター(発現ベクター)の作製−
PcCel45Aの成熟体の塩基配列に基づいて、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。
オリゴヌクレオチドプライマー
Pccel45A−XhoI−F:TTTCTCGAGAAAAGACTGACCGTCTCCGAGAAGCGTG
Pccel45A−NotI−R:TTTTGCGGCCGCTCACGAAGGGGCAGTCCCCTTGTT
PcCel45A遺伝子を含むベクターを鋳型とし、上記オリゴヌクレオチドプライマーと、ポリメラーゼとしてKOD−Plus(version2;東洋紡績(株)製)を用いて、PCRを行い(94℃2分を1サイクル、98℃10秒・68℃30秒を20サイクル、4℃で終了)、発現ベクターに挿入するDNA断片を増幅した。
前記増幅したDNA断片を酵母(Pichia)の発現ベクターpPICZα(Invitrogen社製)のXhoIとNotI部位に挿入し、組換えベクター(発現ベクター)を得た。
上記で得られた発現ベクター約5μgをBpu1102I(タカラバイオ(株)製)を用いて、直鎖化した。そして、エレクトロポレーションにより、酵母(Pichia pastoris)KM71H株(Invitrogen社製)へ、前記直鎖化した組換えベクターを導入した後、形質転換体の選別を行った。前記エレクトロポレーション、及び形質転換体の選別は、EasySelect(トレードマーク) Pichia expression kit(version G;Invitrogen社製)のマニュアルに基づいて行った。これにより、前記発現ベクターにより形質転換された形質転換体を得た。
上述の形質転換体を25μg/mLのZeocinを含むYPG培地(1%酵母エキス、2%ポリペプトン、1%グリセロール)10mLで30℃、300rpmで往復振とう培養器で24時間培養し、200mLのYPG培地の入った三角フラスコに接種した後、回転振とう培養器(30℃、150rpm)でさらに24時間培養した。遠心分離(3,000g、10分)によって菌体を回収した後、50mLのYPM培地(1%酵母エキス、2%ポリペプトン、1%メタノール)に菌体を移し、24時間ごとに終濃度1%になるようにメタノールを加えながら、さらに回転振とう培養器(30℃、150rpm)で96時間培養した。
前記培養液を遠心分離(30分、5,000×g)し、得られた培養上清を粗酵素液とした。前記粗酵素液に、最終濃度が1Mとなるように硫酸アンモニウムと、最終濃度が20mMとなるように酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)とを加えた。
1Mの硫酸アンモニウムを含有する20mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)で平衡化したPhenyl−Toyopearl 650Sカラム(26mm×120mm、東ソー(株)製)を用いて、前記溶液を分画した。PcCel45Aは、300mLの逆勾配で、20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)へ溶出した。
その後、前記PcCel45Aを含む分画を集め、20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に対して平衡化した。そして、20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で平衡化したSuperQ−Toyopearl 650S カラム(9mm×120mm、東ソー(株)製)に前記平衡化したPcCel45Aを含む溶液を加えた。PcCel45Aは、0M〜0.5Mの塩化ナトリウム100mLの直線勾配でカラムから溶出した。
得られたPcCel45Aの精製度は、SDS−PAGE(12%ポリアクリルアミドゲル)で分析した。また、得られたPcCel45AのN末端のアミノ酸配列は、プロテインシーケンサー(Model 491 cLc;Applied Biosystems社製)により確認した。その結果、形質転換酵母で得られたPcCel45AのN末端アミノ酸配列は、ATGGYVQQATであり、担子菌ファネロケーテ クリソスポリウム(P.chrysosporium)で得られた天然のものと同じであることがわかった。
次に、上記で得られたPcCel45Aがエンドグルカナーゼ活性を有するか否かを以下の酵素試験により確認した。
−各種基質に対する加水分解活性−
上記で得られたPcCel45A 1.0μMと、0.5%の以下の各基質とを50mM酢酸ナトリウム溶液(pH5.0)250μL中、30℃で120時間まで反応させた。
基質:
・結晶性セルロース(Funacel II、フナコシ(株)製。以下、「MCC」と称することがある。)
・非晶性セルロース(リン酸膨潤セルロース、結晶性セルロースから、Wood,T.M.1988.Preparation of crystalline, amorphous, and dyed cellulase substrates.Methods Enzymol.160:19−25に記載の方法により調製した。以下、「PASC」と称することがある。)
・カルボキシメチルセルロース(7LFD、Hercules社製。以下、「CMC」と称することがある。)
・リケナン(Sigma−Aldrich社製)
・大麦β−グルカン(Sigma−Aldrich社製)
・グルコマンナン(和光純薬工業(株)製)
・キシラン(Sigma−Aldrich社製)
前記反応を1時間行った後、等体積量の1.0M水酸化ナトリウム溶液を加え、反応を止めた。そして、p−hydroxybenzoic acid hydrazide(PHBAH)法(Lever, M. 1972. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Anal. Biochem. 47:273−279.)により、標準としてグルコース(和光純薬工業(株)製)を用いて還元糖量を測定した。結果を表1に示す。
一方、PcCel45Aは、MCC、及びキシランに対しては、加水分解活性を有していないことがわかった。
また、PcCel45Aのβ−1,3/1,4−グルカン(リケナン、大麦β−グルカン)に対する初速度(活性)は、β−1,4−グルカン(PASC、カルボキシメチルセルロース)より高いことがわかった。
−−薄層クロマトグラフィー(TLC)分析−−
PcCel45Aと、各基質とを以下のように反応させた後に得られるオリゴ糖(加水分解産物)について、TLCにより分析した。
PcCel45A 1.0μMと、0.5%の各基質(MCC、PASC、CMC、リケナン、大麦β−グルカン、グルコマンナン、キシラン)とを50mM酢酸ナトリウム溶液(pH5.0)250μL中、30℃で1時間、又は120時間反応させた。
前記反応液を5分間煮沸することにより反応を止め、該反応液を遠心分離し(×15,000g)、得られた上澄みをpre−coated silica gel 60 TLC plate(Merck社製)にアプライした。展開溶媒として、EtOAc/CH3COOH/H2O(3/2/1 体積比)を用いて展開した後、Kawai, R., K. Igarashi, M. Kitaoka, T. Ishii, and M. Samejima. 2004. Kinetics of substrate transglycosylation by glycoside hydrolase family 3 glucan (1−>3)−β−glucosidase from the white−rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Carbohydr. Res. 339:2852−2853.に記載の方法でオルシノール試薬により還元糖を検出した。結果を図6、図7に示す。
図6、及び図7中、「1」は基質が「MCC」の場合を示し、「2」は基質が「PASC」の場合を示し、「3」は基質が「CMC」の場合を示し、「4」は基質が「リケナン」の場合を示し、「5」は基質が「大麦β−グルカン」の場合を示し、「6」は基質が「グルコマンナン」の場合を示し、「7」は基質が「キシラン」の場合を示す。また、「+」は、「PcCel45A有り」の場合を示し、「−」は、「PcCel45A無し」の場合を示す。
図6、及び図7から、PcCel45Aは、基質がβ−1,4−グルカン(PASC、CMC)の場合にオリゴ糖を生成することがわかった。
PcCel45Aと、基質としてPASCとを以下のように反応させた後に得られる単糖〜7糖までのそれぞれの糖の量について、HPLCにより分析した。
PcCel45A 1.0μMと、0.5%のPASCとを50mM酢酸ナトリウム溶液(pH5.0)250μL中、30℃で30分間、60分間、120分間、180分間、240分間のそれぞれの時間反応させた。そして、各反応液を5分間煮沸した後、遠心分離(×15,000g)した。得られた上澄みをアセトニトリル/H2O(60/40から50/50、体積/体積)の直線勾配で、Shodex(登録商標) Asahipak NH2P−50(昭和電工(株)製)で分離した。前記分離されたものの量は、ポリマー化度(DP)=2〜7のセロオリゴ糖(生化学工業(株))を標準として用いて定量した。
なお、HPLCの装置は、Corona(トレードマーク) Chaged Aerosol Detector(トレードマーク)(ESA Biosciences社製)を用いたLC−2000(日本分光(株)製)を使用した。結果を図8に示す。
図8の結果から、PcCel45Aは、PASCを基質とした場合に、ポリマー化度(DP)=3〜5のセロオリゴ糖(3糖〜5糖)を多く生成することがわかった。一方、2糖(DP=2)や単糖(DP=1)はわずかしか生成されなかった。なお、DP=6〜7のセロオリゴ糖(6糖〜7糖)の生成も少なかったが、これらは可溶性が低かったためだと思われる。
酵素として、PcCel45Aと、メタノール資化性酵母(Pichia pastoris)で発現させた組換えファネロケーテ クリソスポリウム(P.chrysosporium) Cel6A(以下、「Cel6A」と称することがある。)とを用い、基質として、PASCを用いた場合の、基質の加水分解産物について調べ、PcCel45Aの相乗効果を以下のようにして試験した。
−−−Cel6A遺伝子のクローニング−−−
NCBIデータベース上にあるファネロケーテ クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)由来Cel6A遺伝子(AAB32942)をもとに、以下のプライマーを設計した。
プライマー:
PcCel6A−EcoRI−F:TTTGAATTCCAGGCGTCGGAGTGGGGACAG(配列中、「GAATTCC」は制限酵素EcoRI切断配列)
PcCel6A−NotI−R:TTTGCGGCCGCCTACAGCGGCGGGTTGGCAGC(配列中、「GCGGCCGC」は制限酵素NotI切断配列)
上記プライマーを用い、PcCel45Aと同様に調製したcDNAを鋳型にしてPCRを行い(94℃2分を1サイクル、98℃10秒・68℃1分30秒を25サイクル、4℃で終了)、PcCel6Aの成熟体タンパク質をコードする部分(21番アミノ酸以降)を得た。
上記で得られたPCR産物は、Zero Blunt(登録商標) TOPO(登録商標) PCR cloning kit(Invitrogen社製)と大腸菌E.coli JM109株(タカラバイオ(株)製)を用いてクローン化した。
ミニプレップを行って調製されたPcCel6A遺伝子を含むベクター、及び酵母発現用ベクターpPICZαA(Invitrogen社製)を制限酵素EcoRI、及びNotI(タカラバイオ(株)製)によって切断し、得られたフラグメントをアガロース電気泳動で分離したのちゲル抽出によって得た。
制限酵素処理されたpPICZαAとPcCel6A遺伝子それぞれ20ngをDNA Ligation Kit<Mighty Mix>(タカラバイオ(株)製)によってライゲーションし、大腸菌E.coli JM109株(タカラバイオ(株)製)を用いてクローン化した。ミニプレップを行って調製されたPcCel6A遺伝子を含む酵母発現用ベクターpPICZαA(以下、「pPICZαA/PcCel6A」と称することがある。)からSte13シグナル切断サイトを切除するために、以下のプライマーを設計し、pPICZαA/PcCel6Aを鋳型としてPCRを行った(94℃2分を1サイクル、98℃10秒・68℃1分30秒を15サイクル、4℃で終了)。
プライマー:
PcCel6A−Kex2−F:GAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGACAGGCGTCGGAGTGGGGACAG
PcCel6A−Kex2−R:CTGTCCCCACTCCGACGCCTGTCTTTTCTCGAGAGATACCCCTTC
増幅された遺伝子断片を制限酵素DpnIによって処理し、大腸菌E.coli JM109株(タカラバイオ(株)製)を用いてクローン化した。
ミニプレップを行って得られた、Ste13シグナル切断サイトを切除したpPICZαA/PcCel6A−Ste(−)を制限酵素BstXI(タカラバイオ(株)製)によって直鎖化し、エレクトロポーレーション法によって酵母(Pichia pastoris) KM−71H株に導入した。形質転換体の選抜は抗生物質(Zeocin)耐性を指標に行った。
上述の形質転換体を25μg/mLのZeocinを含むYPG培地(1%Yeast extract、2%Polypeptone、1%Glycerol)10mLで30℃、300rpmで往復振とう培養器で24時間培養し、200mLのYPG培地の入った三角フラスコに接種した後、回転振とう培養器(30℃、150rpm)でさらに24時間培養した。遠心分離(3,000g、10分)によって菌体を回収した後、50mLのYPM培地(1%Yeast extract、2%Polypeptone、1%Methanol)に菌体を移し、24時間ごとに終濃度1%になるようにMethanolを加えながら、さらに回転振とう培養器(30℃、150rpm)で96時間培養した。遠心分離(3,000g、10分)によって得られた培養上清を粗酵素液とした。
上述のようにして得られた粗酵素液に硫酸アンモニウムを70%飽和になるように加え、遠心分離(15,000g、30分)によって沈殿を回収した。前記沈殿を1M硫酸アンモニウムを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に溶解させた。
1Mの硫酸アンモニウムを含有する20mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)で平衡化したPhenyl−Toyopearl 650Sカラム(26mm×120mm、東ソー(株)製)を用いて、前記溶液を分画した。PcCel6Aは、300mLの逆勾配で、20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)へ溶出した。
その後、前記PcCel6Aを含む分画を集め、20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)に対して平衡化した。そして、20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)で平衡化したSuperQ−Toyopearl 650S カラム(9mm×120mm、東ソー(株)製)に前記平衡化したPcCel6Aを含む溶液を加えた。PcCel6Aは、0M〜0.5Mの塩化ナトリウム100mLの直線勾配でカラムから溶出した。
得られたPcCel6Aは、SDS−PAGE(12%ポリアクリルアミドゲル)で単一のバンドを与えた。また、得られたPcCel6AのN末端のアミノ酸配列は、プロテインシーケンサー(Model 491 cLc;Applied Biosystems社製)により確認した。その結果、形質転換酵母で得られたPcCel6AのN末端アミノ酸配列は、QASEWGQCGGIGであり、担子菌ファネロケーテ クリソスポリウム(P.chrysosporium)由来のCel6Aと同じであることがわかった。
PcCel45Aと、Cel6Aとの全酵素濃度を1.0μMとし、両者の割合をモル比100:0、75:25、50:50、25:75、0:100として、0.5%のPASCと、50mM酢酸ナトリウム溶液(pH5.0)250μL中、30℃で60分間、120分間、180分間、240分間の各時間反応させた。そして、反応液を5分間煮沸した後、遠心分離(×15,000g)した。
得られた上澄みに含まれるセロオリゴ糖を、上述のHPLC分析と同様にして分析した。結果を図9、及び図10に示す。
図9の結果から、PcCel6Aによって、PASCから生成される主産物はセロビオース(DP=2)であることがわかった。また、PcCel45Aと、PcCel6Aとを共に用いた場合でも、PASCから生成される主産物は、同様にセロビオース(DP=2)であることがわかった。
図10の結果から、PcCel45Aと、PcCel6Aとを共に用いると、両者を単独で用いた場合の合計値よりも、加水分解産物(セロオリゴ糖)が多く得られることがわかった。反応時間120分、PcCel45Aと、PcCel6Aとのモル比が75:25では、加水分解産物の量は、計算値(図10の点線)より3.6倍高くなり、反応時間120分、PcCel45Aと、PcCel6Aとのモル比が50:50では、加水分解産物の量は、計算値(図10の点線)より2.7倍高くなっていた。
この結果から、PcCel45Aは、他のセルラーゼと併用すると相乗効果を有することがわかった。また、PcCel45Aは、PcCel6Aの活性を増強すると考えられる。
Claims (13)
- ファネロケーテ クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)由来のタンパク質であって、SDS−PAGEで測定した分子量が18kDaであり、かつ、エンドグルカナーゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。
- エンドグルカナーゼ活性を有することを特徴とする、下記(a)から(d)のいずれかに記載のタンパク質。
(a)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号:1で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質
(c)配列番号:1で示されるアミノ酸配列の27位〜206位のアミノ酸配列を含むタンパク質
(d)配列番号:1で示されるアミノ酸配列の27位〜206位のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質 - エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする、下記(a)から(h)のいずれかに記載のDNA。
(a)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号:1で示されるアミノ酸配列の27位〜206位のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(d)配列番号:1で示されるアミノ酸配列の27位〜206位のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
(e)配列番号:2で示される塩基配列を含むDNA
(f)配列番号:2で示される塩基配列を含むDNAの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
(g)配列番号:2で示される塩基配列の79位〜621位の塩基配列を含むDNA
(h)配列番号:2で示される塩基配列の79位〜621位の塩基配列を含むDNAの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA - 請求項3に記載のDNAを含有することを特徴とする組換えベクター。
- 請求項4に記載の組換えベクターにより形質転換されたことを特徴とする形質転換体。
- 請求項5に記載の形質転換体を培養する工程と、前記培養物からエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程とを含むことを特徴とするエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
- 請求項1〜2のいずれかに記載のタンパク質、及び、ファネロケーテ クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)の少なくともいずれかを用いて、バイオマス原料から糖を得ることを特徴とする糖の製造方法。
- さらに請求項1〜2のいずれかに記載のタンパク質以外のセルラーゼを用いる、請求項7に記載の糖の製造方法。
- 請求項7〜8のいずれかに記載の糖の製造方法により得られた糖を、発酵させて、エタノールを得ることを特徴とするエタノールの製造方法。
- 請求項1〜2のいずれかに記載のタンパク質の少なくともいずれかを含有することを特徴とする食品。
- 請求項1〜2のいずれかに記載のタンパク質の少なくともいずれかを含有することを特徴とする飼料。
- 請求項1〜2のいずれかに記載のタンパク質の少なくともいずれかを含有することを特徴とする洗剤。
- 請求項1〜2のいずれかに記載のタンパク質の少なくともいずれかを用いて、セルロース含有織物を処理することを特徴とするセルロース含有織物の処理方法。
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