CN105586322A

CN105586322A - 一种用于木质纤维素解聚作用的组合物及其解聚方法

Info

Publication number: CN105586322A
Application number: CN201410604163.0A
Authority: CN
Inventors: 高乐; 李晨; 张东远; 陈树林
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2014-10-30
Filing date: 2014-10-30
Publication date: 2016-05-18
Anticipated expiration: 2034-10-30
Also published as: CN105586322B

Abstract

本发明涉及木质纤维素降解技术领域，特别涉及一种用于木质纤维素解聚作用的组合物及其解聚方法。公开了一种用于木质纤维素解聚作用的组合物包括脱氢酶和纤维素酶。在相同纤维素酶含量存在的情况下，很大程度上提高木质纤维素的降解效率。本发明还公开了利用组合物解聚木质纤维素的方法，为将所述组合物中的纤维素酶和脱氢酶添加入木质纤维素中进行降解反应，其中，1g所述底物添加10FPU的所述纤维素酶以及1g所述底物添加80-120μg脱氢酶。本发明申请人经过大量的试验，旨在为实际生产确定降解木质纤维素的比较适宜的组合物中脱氢酶和纤维素酶用量以及反应条件，最大程度充分利用组合物，提高木质纤维降解反应获得糖的产量，降低生产成本。

Description

一种用于木质纤维素解聚作用的组合物及其解聚方法

技术领域

本发明涉及木质纤维素降解技术领域，特别涉及一种用于木质纤维素解聚作用的组合物及其解聚方法。

背景技术

近年来，在深入研究纤维素酶主要组分的基础上，发现一些非水解酶活性的纤维素降解因子已经成为当前研究热点。在自然界对纤维素的生物降解过程中，除了主要的酶解机制外是否存在其他新型的纤维素酶协同降解因子？早在半个世纪前，Reese等(Reeseetal.，1950)提出应该存在破坏结晶纤维素的氢键酶，至今还未在微生物中得到很好的证实(高培基，2003)。闫伯旭等人在对拟康氏木霉和紫微青霉的CBHI的CBD区进行研究时发现CBD吸附于纤维素后会导致其超分子结构的破坏，同时不产生还原糖，即纤维素内的糖苷键未被水解(YanandSun，1997)。2002年Saloheimo等人在瑞氏木霉的胞外分泌蛋白组分中发现了Swollenin蛋白，该蛋白类似于植物中的Expansin蛋白，命名为膨胀因子(Swollenin)(Saloheimoetal.，1997)。Swollenin蛋白作用于滤纸和棉纤维素后，用光学显微镜观察到类似于超声波处理后的纤维结构破坏的现象，同时并没有还原糖的产生。虽然该蛋白分泌量极小，但是能够破坏纤维结晶结构，使纤维结构更无序，更膨胀，有利于纤维素酶和纤维素的结合，从而提高了纤维素酶水解木质纤维素的能力，但是Swollenin和纤维素酶协同作用程度有限(Yaoetal.，2008)。在陆生梭孢菌(Thielavia.terrestris)的胞外粗酶液中发现了GH61家族蛋白。在水解玉米秸秆的实验中，加入不到总酶量5％的GH61家族蛋白，可以使水解作用所需纤维素酶的用量减少到原来的1/2。使用表达了T.terrestrisGH61B蛋白的里氏木霉菌株，可以在减少酶用量1.4倍的情况下于120h内将90％纤维素转化为葡萄糖。GH61蛋白本身对酸处理玉米秸秆或者其它木质纤维素底物没有明显的可察觉的水解酶活性。这说明水解作用的提高不是由于GH61蛋白质本身具有内切或者外切葡聚糖酶的活性引起的。GH61的作用机理现在被推测为其可作为多糖单加氧酶，为纤维素酶解过程提供电子，发生氧化还原反应(Dimarogonaetal，2012)。Swollenin蛋白只存在于里氏木霉中，对其他高产纤维素酶真菌酶系改造指导意义不大。并且现已经发现纤维素酶降解因子与商业纤维素酶协同作用不太明显，作用机理还不透彻。所以亟待发现新型的纤维素酶协同降解因子，更加透彻解析木质纤维素降解机理。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种用于木质纤维素解聚作用的组合物。在相同纤维素酶含量存在的情况下，很大程度上提高木质纤维素的降解效率。

本发明目的之二在于提供利用所述组合物解聚木质纤维素的方法，本发明申请人经过大量的试验，旨在为实际生产确定降解木质纤维素的比较适宜的组合物中脱氢酶和纤维素酶用量以及反应条件，最大程度充分利用组合物，提高木质纤维降解反应获得糖的产量，降低生产成本。

该用于木质纤维素解聚作用的组合物在提高木质纤维素水解产糖量，降低生物质-糖的转化成本中的应用。

本发明提供的技术方案为：

一种用于木质纤维素解聚作用的组合物，其特征在于，所述组合物包括脱氢酶和纤维素酶。

优选的是，所述脱氢酶包含：

(a)组合物氨基酸序列：SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；

(b)在(a)限定的所述组合物中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与(a)所述多肽具有相同生物学功能的由(a)衍生的氨基酸序列。

优选的是，所述纤维素酶包括内切酶、外切酶以及β-葡萄糖苷酶。

一种利用组合物解聚木质纤维素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所述组合物中的纤维素酶和脱氢酶添加入木质纤维素中进行降解反应，其中，1g所述底物添加10FPU的所述纤维素酶以及1g所述底物添加80-120μg脱氢酶。

优选的是，1g所述底物添加110μg脱氢酶。

优选的是，所述降解反应所需温度为45～55。℃以及pH为4.4～5.2。

优选的是，所述降解反应所需温度为50℃以及pH为4.8。

优选的是，所述降解反应的产物是糖。

本发明的有益效果是：

脱氢酶本身并没有水解活性，由于分子量较小，可以透过木质纤维素的较小的间隙进入内部，同时通过其产生的自由基HO·可以攻击木素和氢键网络，使无定形的纤维素无序化，结构变得松散。有利于纤维素酶等酶蛋白和底物结合，快速地发生降解反应。自由基的作用是无选择性的，具有广泛的作用位点。一方面自由基可以破坏纤维素的β-1，4糖苷键，生成葡萄糖。另一方面脱氢酶产生的自由基具有强氧化性，当自由基进入木质纤维素内部后，靠羟基结合的氢键结构消失，链间的作用力变小，使木质纤维素结晶区趋于无定形化，大大降低了木质纤维素抗降解的屏障，为进一步酶解提供有利条件，所以脱氢酶与纤维素酶之间存在强烈的协同作用，是用于木质纤维素解聚作用效果比较好的组合物。本发明人经过试验证明，在纤维素酶中添加一定量的脱氢酶后可以显著提高木质纤维的降解效率。并且，本发明的组合物解聚木质纤维素的方法，为实际生产确定降解木质纤维素的比较适宜的组合物中脱氢酶和纤维素酶用量以及反应条件，最大程度充分利用组合物，提高木质纤维降解反应获得糖的产量，降低生产成本。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“氨基酸”意指构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使它的分子具有生化活性。蛋白质是生物体内重要的活性分子，包括催化新陈代谢的酶，两个或两个以上的氨基酸化学聚合成肽，一个蛋白质的原始片段，是蛋白质生成的前体，氨基酸广义上是指既含有一个碱性氨基又含有一个酸性羧基的有机化合物，正如它的名字所说的那样。但一般的氨基酸，则是指构成蛋白质的结构单位。在生物界中，构成天然蛋白质的氨基酸具有其特定的结构特点，即其氨基直接连接在α-碳原子上，这种氨基酸被称为α-氨基酸。在自然界中共有300多种氨基酸，其中α-氨基酸21种。α-氨基酸是肽和蛋白质的构件分子，也是构成生命大厦的基本砖石之一。

术语“缺失”意指一个正常染色体断裂后丢失了一个片段，这片段上的基因也随之失去，在本发明中意指氨基酸序列除了为SEQIDNo.1所示的氨基酸序列之外，还包括氨基酸序列中丢失一个或几个氨基酸的不影响其功能的新的氨基酸序列。

术语“插入”意指利用基因操作技术把一段DNA接入另一段DNA中或克隆载体中去，在本发明中意指氨基酸序列除了为SEQIDNo.1所示的氨基酸序列之外，还包括氨基酸序列中插入一个或几个氨基酸的不影响其功能的新的氨基酸序列。

术语“置换”意指一种基因重组载体，一般利用同源重组将基因组中的某段基因替换，而达到基因敲除的目的，在本发明中意指氨基酸序列除了为SEQIDNo.1所示的氨基酸序列之外，还包括氨基酸序列中一个或几个氨基酸被其他种类的氨基酸置换后的不影响其功能的新的氨基酸序列。

附图说明

图1为本发明所述用于木质纤维素解聚作用的组合物中分离自桧状青霉胞外脱氢酶的SDS-PAGE图。

图2为本发明所述用于木质纤维素解聚作用的组合物中分离自桧状青霉胞外脱氢酶蛋白与不同纤维素酶之间的协同作用的比较图。

图3为本发明所述用于木质纤维素解聚作用的组合物中的所述脱氢酶单独处理生物质时羟基自由基生成检测。

图4为本发明所述用于木质纤维素解聚作用的组合物中的脱氢酶单独水解木质纤维素后产物生成情况的分光光度法检测图。

图5为本发明所述用于木质纤维素解聚作用的组合物中的脱氢酶单独水解木质纤维素后产物生成情况的HPLC检测图。

图6为本发明所述用于木质纤维素解聚作用的组合物中的利用脱氢酶单独处理微晶纤维素前后结构的差异的FTIR分析图。

图7为本发明所述用于木质纤维素解聚作用的组合物中的利用脱氢酶单独处理玉米秸秆前后结构的差异的FTIR分析图。

图8为本发明所述用于木质纤维素解聚作用的组合物中的利用脱氢酶单独处理浒苔前后结构的差异的FTIR分析图。

图9为本发明所述用于木质纤维素解聚作用的组合物中的利用脱氢酶单独处理巨藻前后结构的差异的FTIR分析图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1

从桧状青霉的胞外酶液中分离提纯本发明组合物中的脱氢酶：

桧状青霉(Penicilliumpiceum)H16，保藏号：CGMCCNo.8339，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter)。

针对桧状青霉，最适的培养基条件如下：3.3％microcrystallinecellulose，1.7％corncobsteepliquor，0.5％(NH4)₂SO₄，0.6％KH₂PO₄，0.1％MgSO₄，0.25％CaCO₃，and0.2％Tween-80.发酵使用的玻璃容器一般选择300mL的三角瓶，培养50mL的培养液，于28度培养箱，水平震荡180rpm，5天。

脱氢酶分离纯化使用的仪器AKTApurifier(GE，Sweden)。使用pH值为4.8～5.0的物质的量浓度为18～22mM的醋酸-醋酸钠溶液，以0.15～0.3mL/min冲洗所述分子筛凝胶层析柱获得蛋白质为本发明所述脱氢酶。

利用分子筛在桧状青霉胞外粗酶液中分离纯化了分子量为23kDa蛋白，如图1是SDS-PAGE检测了纯化后的该蛋白已经达到电泳纯。通过MALDI-TOF鉴定蛋白质后，得到所述脱氢酶一段肽段序列“FVIESAATVR”，通过BLAST在NCBI数据库以及在桧状青霉基因组数据库中比对，鉴定该蛋白为脱氢酶蛋白。

实施例2

脱氢酶的酶活力测定实验：

应用本领域常规方法纤维素酶和半纤维素酶国标法测定方法将组合物-脱氢酶对羧甲基纤维素(CMC-Na)，水杨苷(Salicin)，PNPC，微晶纤维素(Avicel)，木聚糖(Xylan)、PNPG，和纤维二糖分别进行酶活力检测，检测结果如下表1所示：发现组合物并没有糖苷水解酶活性。

表1.脱氢酶的酶学性质初步分析

实施例3

本发明的脱氢酶的作用机理研究

将脱氢酶以40μg/mL蛋白浓度分别向里氏木霉和桧状青霉的粗酶液中添加，里氏木霉和桧状青霉粗酶液的水解效率分别提高了27％和35％。这是首次在纤维素酶系中发现脱氢酶，脱氢酶自身没有酶活力，与纤维素酶之间存在强烈的协同作用，所以脱氢酶属于纤维素酶协同组合物，如图2所示。

脱氢酶蛋白没有检测到水解酶活力，但是当其单独处理四种组分不同的木质纤维素材料后，用HPLC-42A分析水解产物时发现，水解产物中都有少量的D-葡萄糖和D-山梨醇，并且检测到自由基的产生，如图3所示。在这个过程中，发明人成功检测到了自由基的生成，再次验证了上述推测成立。发明人分别采用了两种方法检测自由基的生成，分别是分光光度法，和HPLC检测法。自由基较为活跃，不易捕获，不易检测。以水杨酸作为捕获剂，自由基可以氧化水杨酸生成2，5-二羟基水杨酸(2，5-DHBA)，其在OD560nm处有吸收峰。如图4和图5所示。

本发明人推测该脱氢酶蛋白参与了氧化还原反应，将D-葡萄糖还原成为D-山梨醇，并且伴有自由基的生成。

当脱氢酶单独处理浒苔，巨藻，玉米芯粉后，利用FTIR分析其处理后木质纤维素结构变化。如图6-9所示，FTIR显示，3000-4000cm^-1是氢键的特征区域透射值明显增大(吸收峰降低)，说明当脱氢酶处理浒苔和巨藻后，破坏生物质的氢键结构，导致氢键的吸收峰明显下降。微晶纤维素、玉米秸秆处理前后氢键吸收峰变化不大，结晶度降低了10％。而巨藻和浒苔结构相对疏松，通过脱氢酶单独处理后，结晶度大幅度降低，降低了70-100％。红外光谱图区别主要在1600-1000cm^-1的区域内，这一区间的信号峰大都来自木素和半纤维素。其中1515cm^-1，1424cm^-1来自于木素中芳香核的振动。1027cm^-1，827cm^-1附近的吸收峰是为木素的愈创木核的特征吸收，1328cm^-1，1223cm^-1，1123cm^-1处于木素的紫丁香结构单元有关。浒苔、巨藻、玉米芯粉经过脱氢酶处理后，木素的芳香环结构，愈创木酚基和紫丁香基特征位点透射值明显增大，说明脱氢酶可以破坏木素结构，导致木素的特征吸收峰明显下降。脱氢酶可以破坏木素结构和氢键结构，减少了木质纤维素的降解屏障，所以脱氢酶和商业纤维素酶之间存在强烈的协同作用。

结合通过HPLC分析脱氢酶处理木质纤维素后，有D-葡萄糖和D-山梨醇生成。而D-葡萄糖含有一个潜在的醛基，脱氢酶可以还原D-葡萄糖生成D-山梨醇，同时产生了强氧化性的自由基HO·，而自由基可以发生羟基化的反应。自由基有一个特点：其作用是无选择性的，具有广泛的作用位点。一方面自由基可以破坏纤维素的β-1，4糖苷键，生成葡萄糖。另一方面脱氢酶产生的自由基具有强氧化性，当自由基进入木质纤维素内部后，靠羟基结合的氢键结构消失，链间的作用力变小，使木质纤维素结晶区趋于无定形化，大大降低了木质纤维素抗降解的屏障，为进一步酶解提供有利条件，所以脱氢酶与商业纤维素酶之间存在强烈的协同作用。

通过脱氢酶这类组合物的试验证明了：脱氢酶本身并没有水解活性，由于分子量较小，可以透过木质纤维素的较小的间隙进入内部，同时通过其产生的自由基HO·可以攻击木素和氢键网络，使无定形的纤维素无序化，结构变得松散。有利于纤维素酶等酶蛋白和底物结合，快速地发生降解反应。

根据上述结论，本发明人针对纤维素酶和脱氢酶组成的降解木质纤维素的组合物进行试验研究，最终获得较为合适的脱氢酶和纤维素酶的添加量以及反应条件。

实施例4

一种利用组合物解聚木质纤维素的方法，包括以下步骤：

试验组1：将所述组合物中的纤维素酶和脱氢酶添加入木质纤维素中进行降解反应，其中，1g所述底物添加10FPU的所述纤维素酶以及1g所述底物添加80μg脱氢酶，所需温度为45℃以及pH为4.4。

对照组1：将纤维素酶添加入与试验组1相同质量的木质纤维素中进行降解反应，其中，1g所述底物添加10FPU的所述纤维素酶，所需温度为45℃以及pH为4.4。

实施例5

一种利用组合物解聚木质纤维素的方法，包括以下步骤：

试验组2：将所述组合物中的纤维素酶和脱氢酶添加入木质纤维素中进行降解反应，其中，1g所述底物添加10FPU的所述纤维素酶以及1g所述底物添加95μg脱氢酶，所需温度为50℃以及pH为4.4。

对照组2：将纤维素酶添加入与试验组2相同质量的木质纤维素中进行降解反应，其中，1g所述底物添加10FPU的所述纤维素酶，所需温度为50℃以及pH为4.4。

实施例6

一种利用组合物解聚木质纤维素的方法，包括以下步骤：

试验组3：将所述组合物中的纤维素酶和脱氢酶添加入木质纤维素中进行降解反应，其中，1g所述底物添加10FPU的所述纤维素酶以及1g所述底物添加110μg脱氢酶，所需温度为50℃以及pH为4.8。

对照组3：将纤维素酶添加入与试验组2相同质量的木质纤维素中进行降解反应，其中，1g所述底物添加10FPU的所述纤维素酶，所需温度为50℃以及pH为4.8。

实施例7

一种利用组合物解聚木质纤维素的方法，包括以下步骤：

试验组4：将所述组合物中的纤维素酶和脱氢酶添加入木质纤维素中进行降解反应，其中，1g所述底物添加10FPU的所述纤维素酶以及1g所述底物添加120μg脱氢酶，所需温度为55℃以及pH为5.2。

对照组4：将纤维素酶添加入与试验组2相同质量的木质纤维素中进行降解反应，其中，1g所述底物添加10FPU的所述纤维素酶，所需温度为55℃以及pH为5.2。

实施例4～7的试验数据见下表：

	木质纤维素的水解率(％)
		试验组1	68.5％
对照组1	40.1％
		试验组2	72.9％
对照组2	48.5％
		试验组3	82.6％
对照组3	58.1％
		试验组4	80.1％
对照组4	57.8％

由上述试验数据表明，本发明的用于降解木质纤维素解聚作用的组合物的木质纤维素的水解明显提高，取得了显著的技术进步，很大程度上提高了水解木质纤维的效率，可应用于大规模生产，降低生产成本。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims

1.一种用于木质纤维素解聚作用的组合物，其特征在于，所述组合物包括脱氢酶和纤维素酶。

2.根据权利要求1所述的用于木质纤维素解聚作用的组合物，其特征在于，所述脱氢酶包含：

(a)组合物氨基酸序列：SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；

3.根据权利要求1所述的用于木质纤维素解聚作用的组合物，其特征在于，所述纤维素酶包括内切酶、外切酶以及β-葡萄糖苷酶。

4.一种利用如权利要求1所述组合物解聚木质纤维素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的利用组合物解聚木质纤维素的方法，其特征在于，1g所述底物添加110μg脱氢酶。

6.根据权利要求4所述的利用组合物解聚木质纤维素的方法，其特征在于，所述降解反应所需温度为45～55℃以及pH为4.4～5.2。

7.根据权利要求6所述的利用组合物解聚木质纤维素的方法，其特征在于，所述降解反应所需温度为50℃以及pH为4.8。

8.根据权利要求4-7中任一项所述的利用组合物解聚木质纤维素的方法，其特征在于，所述降解反应的产物是糖。