CN1055740A - 用于治疗肿瘤疾病的二氟谷氨酸与叶酸及抗叶酸的轭合物 - Google Patents

用于治疗肿瘤疾病的二氟谷氨酸与叶酸及抗叶酸的轭合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及某些叶酸及抗叶酸与二氟谷氨酸的 轭合物，该轭合物在治疗患有某些肿瘤疾病的病人时 是十分有用的，这些肿瘤疾病包括有白血病，黑色素 瘤，癌，肉瘤和混合的瘤。

Description

本发明涉及新颖的二氟谷氨酸与叶酸及抗叶酸的轭合物，用该类轭合物治疗肿瘤疾病，以及涉及在制备该轭合物时所用的中间体。
叶酸及经典的抗叶酸如MTX1是被叶酸聚谷氨酸合成酶，在细胞内转化为聚（γ-谷氨酰基）代谢物的。
因为已知叶酸聚谷氨酸是叶酸正常代谢独特功能所必要的，且抗叶酸聚谷氨酸影响典型的抗叶酸如MTX的细胞毒作用，所以使叶酸聚谷氨酸合成酶成为研究叶酸的生物化学和生化药理学中十分重要的酶。在此方面，该酶对蝶酰和谷氨酸底物的专一性问题得到了广泛的研究。对蝶酰底物而言，杂环组份的结构可以有很大的变化，而到目前为止的所有文献中都认为末端L-谷氨酸基是底物活性所绝对必需的。对进来的氨基酸有很严格的专一性，但并非十分绝对，L-高胱氨酸及D.L-赤-或D，L-苏式-4-氟谷氨酸都可以作为有效的替代底物，但每种情况下，结合引起链的终止作用。用4-氟谷氨酸非对映异构体起链的终止作用表明，在γ-谷氨酰基-受体部位，对L-谷氨酸有严格的专一性。
用〔3H〕谷氨酸和用氨甲喋呤（4-NH2-10-CH3PteGlu）或四氢叶酸做底物时，二氟谷氨酸是聚（γ-谷氨酰化作用）的强有力的、浓度依赖性的抑制剂。申请人已测得二氟谷氨酸是作为替代底物而起作用的，相反，以前特指的替代底物4-氟谷氨酸（McGuire及Coward，J.Bio.Chem.260：6747（1985）），它不能终止聚谷氨酸链延长，而二氟谷氨酸促进链的延长。因此，当与有谷氨酸存在时的同样的反应相比时，在二氟谷氨酸存在时，从〔H〕氨甲喋呤合成的产物中，含有1和2个另外的氨基酸残基的比率非常高，特别明显的是含另外2个氨基酸残基的产物。加成率的增加不仅限于将二氟谷氨酸与内部的谷氨酸结合或与先前已结合上的二氟谷氨酸再连接起来的功能，因为谷氨酸结合到4-氨基-10-甲基Pt谷氨酸-γ-（3，3-二氟谷氨酸）上的比率也提高了。这些结果与二氟谷氨酸在引进氨基酸（谷氨酸类似物）或在γ-谷氨酰基受体种类的水平上，促进了聚（γ-谷氨酸）代谢物的合成相一致。因此，二氟谷氨酸是首选的谷氨酸类似物，用以促进由叶酸聚谷氨酸合成酶所催化的链的延长作用。
化合物3，3-二氟谷氨酸（F2Glu）用于制备它与某些叶酸和抗叶酸的具式Ⅰ的轭合物及其药学上可接受的盐类，
Figure 911022880_IMG7
其中R1是-NH2，H或-CH3;
R2是-NH2或-OH;
R3是H，（C1-C4）烷基，烯丙基或炔丙基，
且X，Y和Z各自独立地为氮原子或CH基团;
本结构式1轭合物可用于治疗肿瘤和牛皮癣。然而，化合物二氟谷氨酸及某些PABA-二氟谷氨酸是用于制备式1化合物的中间体。
本发明化合物中的二氟谷氨酸部分具有一个手性中心，因此，本发明化合物以一对立体化学异构体形式存在，而相应于天然构型L-谷氨酸的对映异构体是可取的，申请人认为两个单独的异构体以及该单独异构体的混合物，包括外消旋混合物是在本发明范围中的。除非另外指明，本申请书中化合物是两个立体异构体的混合物。进一步地，当式1化合物中Z为CH基团，且R3不是氢原子时，该化合物有第二个手性部位，围绕该第二个手性部位的立体化学构型并不重要，但是申请人再次打算将该分离的异构体和混合物包括在本发明的范围之中。对第二个手性部位而言，异构体外消旋的混合物是可取的。
含有2个羧酸片断的式1化合物可以形成单或双盐，举例说明，这些盐包括碱金属盐，如钠和钾盐;碱土金属盐，如钙和镁盐;ⅢA族轻金属盐包括，铝盐;以及有机伯，仲，叔胺盐，如三烷基胺，包括三乙胺，普鲁卡因，二苄胺，1-乙烯胺，N，N′-二苄基乙二胺，二氢松香胺，N-（低级）烷基哌啶，以及其它任何合适的胺。钠盐是可取的。
式1化合物还能与任何无毒的有机或无机酸构或药学上可接受的酸加成盐。举例说明，可构成合适盐的无机酸有盐酸，氢溴酸，硫酸和磷酸以及酸金属盐如正磷酸氢钠盐和硫酸氢钾盐。举例说明可构成合适盐的有机酸包括单，双及三羧酸，例如醋酸，乙醇酸，乳酸，丙酮酸，丙二酸，琥珀酸，戊二酸，富马酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，抗坏血酸，马来酸，羟基马来酸，苯甲酸，羟基苯甲酸，苯乙酸，肉桂酸，水杨酸，2-苯氧苯甲酸及磺酸如甲磺酸和2-羟基乙磺酸。盐酸盐是可取的。
从式2叶酸或抗叶酸衍生物的反应产物中除去保护基就能制得式Ⅰ化合物，
其中R1，R2，R3，X1，Y1，和Z定义同式1化合物中的定义。被合适保护的F2Glu衍生物，如具式3的叔-丁基酯衍生物，F2Glu（OtBu）2。
Figure 911022880_IMG9
从胺和羧酸制备酰胺的任何一种合适的方法，可用不完成式2化合物与式3被保护的F2Glu衍生物的偶合反应。申请人是采用氰磷酸二乙酯使式2和3化合物偶合的。该反应按下列步骤进行，将合适的式2化合物溶液慢慢滴加到（（EtO）2P（＝0）CN）溶液和酸清除剂如吡啶，或可取的三乙胺中。所得混合物在约0℃至约60℃下反应，较好地是在环境温度中反应约1-10小时，较好地为约2-5小时，直至式2化合物基本上与氰磷酸酯反应为止。然后向该混合液中加入F2Glu（OtBu）2溶液，反应进行约24-100小时，一般是在约0℃-60℃下反应约72小时，较好地是在环境温度下反应。分离出粗品，如用蒸发溶剂的方法，用水洗涤且干燥，该粗产物用三氟乙酸（纯净的）处理，以除去叔丁基酯保护基，分离出所需的式1化合物并纯制之，如用柱层析。对上述所述偶合反应而言，合适的溶剂包括能溶解各种反应物且不干扰反应的溶剂，例如二甲基甲酰胺（DMF）较为可取。
式1化合物中当Z为氮原子时，可用另一个方法制备，即用式4对氨基苯甲酸（PABA）衍生物
Figure 911022880_IMG10
其中R3同上述式1化合物的定义，与式3化合物，F2Glu（OtBu）2反应给出中间体式5化合物
5
其中R3同上述式1化合物中的定义。该偶合反应可按任何合适的方法步骤进行，例如用下述方法，McGuire，et
al.，Cancer
Research  1989，49，4517-4525;Galican  et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1985，82，2598-2602;Piper  and  Montgomery，J.Org.Chem.，42（2）208-211（1977）;Taylor，et  al.，J.Med.Chem.28，913-921（1985）;Taylor，et  al.，J.Med.Chem.28，1517-1522（1985）;Jones，et  al.，J.Med  Chem.32，847-852（1989）.
式5中间体随后与式6溴甲基衍生物缩合，
Figure 911022880_IMG12
其中R1，R2，X及Y同上述式1化合物中定义，生成叔丁氧基保护的化合物，该化合物经水解除去叔丁氧保护基，如用三氟乙酸法，生成所需的式1化合物。该反应可按下列步骤进行，将式5和6化合物及二甲基乙酰胺（Me2NAc）混合物反应约2-12小时，较好地为约4小时，反应温度约25℃-80℃，较好为50-55℃左右，而后在环境温度下将该混合物静置约6-24小时，较好为约12小时。然后减压除去Me2NAc，将粗品置于冰浴中用三氟乙酸处理，加酸后，让反应混合物升温至室温。在静置约1-6小时后，一般为约4小时后，减压除去三氟乙酸，给出所需的式1产物的粗品，该产物可用层析法（DEAE-纤维素，NH4HCO3梯度洗脱）纯制，该缩合反应更全面的描述，见于前一段中提到的文献内。
特定封闭基团的选择和利用是本领域内的普通专家熟知的。通常选择封闭基团应根据下列原则，它们能够在随后的合成步骤中有效地保护氨基或羟基，并能在不引起所需产物降解的条件下很容易地脱去。合适的羟基保护基团有C1-C6-烷基，四氢吡喃基，甲氧甲基，甲氧乙氧甲基，叔丁基，苯甲酰基和三苯甲基。术语C1-C6烷基指一至六个碳原子的直链或支链或环状构型的饱和烃基。苯甲酰化的衍生物可由未经保护的化合物与苯甲酰氯在吡啶存在下进行反应制得。合适的氨基保护基团有苯甲酰基，甲酰基，乙酰基，三氟乙酰基，邻苯二甲酰基，甲苯磺酰基，苯磺酰基，苄氧羰基，取代的苄氧羰基（例如对氯，对溴，对硝基，对甲氧基，邻氯，2，4-二氯以及2，6-二氯衍生物），叔丁氧羰基（BOC），叔戊氧羰基，异丙氧羰基，2-（对-联苯基）-异丙氧羰基，烯丙氧羰基，环戊氧羰基，环己氧羰基，金刚烷氧羰基，苯硫羰基以及三苯甲基。较好的氨基保护化合物包括有苯甲酰基衍生物，其可通过未保护化合物与苯甲酰氯反应制得，此外还有乙酰衍生物，其可通过未保护化合物与乙酸酐反应制得。
本发明提供了一种治疗肿瘤疾病患者的方法，其包括给予患者治疗上有效抗肿瘤剂量的式Ⅰ化合物。通过给予肿瘤疾病患者治疗有效抗肿瘤剂量的式Ⅰ化合物，即可获得抗肿瘤效果。术语“患者”是指热血动物，如灵长目动物，包括人类，羊，马，牛，猪，狗，猫，大鼠和小鼠。
这里所用的术语“肿瘤疾病”是指一种非正常的状态或情况，其特点是增生细胞生长迅速或为肿瘤。根据本领域专家的熟知并乐于采用的标准实验室实验技术和方法，以及与其它已知有效的化合物相比较发现，式Ⅰ化合物用于治疗肿瘤患者是很有效的，这种疾病通常可用叶酸或抗叶酸类化合物来治疗，如：氨甲喋呤，氨喋呤，5，10-二去氮杂叶酸及甲酰四氢叶酸。这类肿瘤包括有：白血病，包括（但并不限于）急性淋巴胚细胞癌，慢性淋巴细胞癌，急性骨髓胚细胞癌以及慢性骨髓细胞癌;癌瘤，包括（但并不限于）子宫颈癌，食管癌，胃癌，小肠癌，结肠癌和肺癌;肉瘤，包括（但不限于）骨癌，骨肉瘤，脂肪瘤，脂肪肉瘤，血管瘤和血管肉瘤;黑色瘤，包括无黑色素瘤及黑色素瘤;以及混合型肿瘤，如癌肉瘤，淋巴组织型瘤，网状滤泡癌，细胞肉瘤和Hodgkins病。当然，本领域内的专家会认识到并不是每一种式Ⅰ化合物都可以有效地治疗各种肿瘤疾病，如何选择最合适的化合物（不治疗疾病）是在本领域专家能力范围之内的，并且进行选择时还应考虑各种因素，包括对标准动物肿瘤模型的结果评价。一般来讲，式Ⅰ化合物在治疗通常应用叶酸或抗叶酸来治疗的肿瘤疾病方面是很有效的。本发明化合物可望比那些非叶酸或抗叶酸轭合物更具有效性和选择性。据信，本发明化合物增加的效力将来自于化合物促进谷酰基链延长的倾向，因而可引起细胞内有毒性的叶酸和抗叶酸的蓄积。
术语“抗肿瘤效果”和术语“治疗肿瘤疾病”是指控制肿瘤的生长或增殖，或者是指延长患者的存活时间（与缺乏这种治疗时相比）。借助于减慢，干扰，抑制或使其停止生长，增殖或转移等手段来达到控制肿瘤生长或增殖的目的。因此术语“治疗肿瘤疾病”并不表明彻底消除肿瘤疾病。可以相信，如能够明显延长患者的存活期，超出了病人自身感到的有益的效果，则说明肿瘤的生长已经得到了控制。
在有效治疗受上述肿瘤疾病折磨的患者时，具式Ⅰ的化合物能以任何可使化合物的生物利用程度达到有效治疗肿瘤剂量的剂型或方式给药，包括口服和非肠道途径。例如，具式Ⅰ化合物可经口服，局部表面，皮下，肌肉内，静脉，皮肤，鼻内，直肠等途径给药。最常选用的是口服给药。本领域内的专家可根据所选化合物的特性，待治疗的病况，病情严重程度以及其它有关情况，很容易地选择合适的剂型和方式给药。
在此，术语“治疗上有效抗肿瘤剂量”是指具式Ⅰ化合物可提供有效肿瘤作用的量。通过熟知技术的使用以及对相类似情况下结果的观察，本领域内的专家，如诊断医师可以很容易地决定治疗上有效的抗肿瘤剂量。在确定治疗上有效的抗肿瘤剂量时，以下一些因素（但并不限于此）是常被诊断医师们考虑的，其包括哺乳动物的物种;大小;年龄，一般健康状况;有否特殊疾病;病情的程度或严重性;个体患者的反应;给予的特定化合物;给药方式;所给予制剂的生物利用度特性;所选择的剂量规定;其它伴用药的使用以及其它有关的情况。
具式Ⅰ化合物的治疗上有效抗肿瘤的剂量从约0.1mg/kg/天至约500mg/kg/天变化。较好的剂量范围是约1-20mg/kg/天。这些有效剂量范围是针对口服给药而言的，但对于非肠道给药来说也是适用的。通常较好的给药是每日1-4次，每次活性化合物的含量为5-100mg。
氨甲蝶呤以及其它叶酸和抗叶酸制剂也可用来治疗牛皮癣，该病是以表皮细胞的增殖速度增加为特点的。具式Ⅰ的化合物可望成为一种新的治疗牛皮癣的制剂，其作用机理与其它药物相同。抗肿瘤剂量与抗牛皮癣剂量是相同的，所不同的是当具式Ⅰ化合物用于治疗牛皮癣时，多采用表面局部给药。
化合物既可以单独给药，也可以药物组合物的形式给药，上述药物组合物是与药学上可接受的载体或赋形剂相结合的，其比例和性质可通过所选化合物的溶解度及化学性质，所选择的给药途径以及标准制药过程来决定。为使具式Ⅰ的化合物有效，其可配成并以它们药学上可接受的酸加成盐的形式给药，以达到稳定，便于结晶和增加溶解度等目的。
具式Ⅰ化合物可作为组合物提供，其包含可检测剂量具式Ⅰ化合物，与一种或多种惰性载体形成的混合物。这些组合物是很有用的，例如作为检测标准，使原料药的运输更方便，或作为药用组合物。具式Ⅰ化合物的可检测量是指用标准的检测程序和技术很容易测定出来的量，上述程序及技术是本领域内的专家熟知并乐于采用的。具式Ⅰ化合物可检测量通常在大约0.001%-75%组合物重量这个范围内变化。惰性载体可以是任何不降解或与具式Ⅰ化合物不发生共价反应的物质。合适的惰性载体的例子有水;缓冲水溶液，例如那些常用于高压液相色谱（HPLC）分析中的溶液;有机溶剂，如乙腈，乙酸乙酯，己烷等;以及药学上可接受的载体和赋形剂。这些组合物是通过将式Ⅰ化合物与惰性载体用本领域内熟知和乐于采用的技术和方法相混合来制备的。
更具体讲，具式Ⅰ化合物可作为组合物提供，其含有治疗上有效抗肿瘤剂量的式Ⅰ化合物，及一种或多种药学上可接受的载体或赋剂。
该药物组合物是用制药领域中常用的方法制备的。载体或赋形剂可以是固体，半固体或液体物质，它们可以作为活性成份的载体或介质。合适的赋形剂是本领域中熟知的。药物组合物可经口服或非肠道应用，并可以片剂，胶囊，栓剂，溶液，悬浮液等剂型给予患者。
式Ⅰ化合物可经口服给药，例如，借助惰性稀释剂或可食用载体。它们也可封于硬胶囊中或压制成片剂。为了达到可口服给药治疗的目的，化合物可与赋形剂混合，以片剂，锭剂，胶囊，酏剂，悬浮液，糖浆剂，蜡剂及香口胶等形式给药。这些制剂应至少含有4%的本发明化合物作为活性成份，但上述量可根据特殊的剂型变化，常规地大约为4%-70%单位重量。本发明化合物在组合物中的量以可获得合适的剂量为宜。根据本发明，较好的组合物制剂可制成含有5.0-300mg本发明化合物的口服剂型。
片剂，药片，胶囊，锭剂等也可含有一种或多种下列辅助剂：粘接剂，如微晶纤维素，黄著胶或明胶;赋形剂，如淀粉或乳糖;崩解剂，如藻酸，淀粉羟乙酸钠，玉米淀粉等;润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotex;增滑剂，如胶体二氧化硅;增甜剂如蔗糖或糖精，或调味剂，如薄荷，水杨酸甲酯或橙子调味剂。当单位剂型为胶囊时，除上述类型的物质外，它还可以含有液体载体，如聚乙二醇或脂肪油。其它各种单位剂型可含有各种可改良单位剂量物理形式的物质，例如，包衣剂。因此，片剂或药丸可用糖，紫胶，或其它肠包衣剂进行包衣。除了本发明化合物，糖浆剂可含有蔗糖作为增甜剂，其还可含有某些防腐剂，染料，色素和调味剂。用于制备各种药物组合物的物质应为制药纯的，并在所用量情况下不产生毒性。
为达到非肠道给药治疗的目的，具式Ⅰ的化合物可制成溶液或悬浮液。这些制剂应至少含有0.1%的式Ⅰ化合物，但该量可在0.1-50%重量之间变化。这类组合物中本发明化合物的量以可获得合适的剂量为宜。根据本发明，较好的组合物和制剂可制成含有5.0-100mg本发明化合物的非肠道剂型。
溶液或悬浮液可包括一种或多种下列辅助剂：无菌稀释液，如注射用水，盐水，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶剂;抗菌剂，如苄醇或对羟苯甲酸甲酯;抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合剂，如乙二胺四乙酸;缓冲剂，如乙酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。非肠道制剂可封于安瓿中，也可封于一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
作为结构上相关的化合物的任何基团（其具有特别普通的效用），对于式1化合物来说，某些基团和构型，在它们的最终应用中是可取的。
申请人优选那些化合物，其中R1和R2各为-NH2基团，X，Y和Z各为氮原子，且R3为甲基。申请人还优选那些化合物，其中R1为-NH，R2为OH，R3为氢，X和Z各为-CH基团，且Y为氮原子。
实例1
N-〔4-（〔（2，4-二氨基-6-蝶啶基）甲基〕甲氨基）-苯甲酰基〕-4，4-D-氟谷氨酸
50-55℃下，将N-CH3PABA-F2Glu（OBu）2（0.201mmol）和2，4-二氨基蝶啶-6-溴甲基溴化氢盐（75mg，0.223mmol）组成的混合物于Me2NAC（2.5ml）中一起搅拌4小时，然后于室温下放置过夜。减压蒸除Me2NAC，将粗品置于冰浴中，于搅拌下加入2ml三氟乙酸。10分钟后，使反应混合物升温至室温，并继续搅拌4小时，减压蒸除三氟乙酸，得粗品。粗品经DEAE-纤维素柱层析纯化，以NH4HCO3进行梯度洗脱（15-600mM）。含所需产品的柱流出物经冷冻干燥，得所需纯品。
实例2
4-氨基-4-去氧-10-甲基蝶酰（D，L-赤，苏-4，4-（二氟）谷氨酸）（1，R1，R2＝NH2;X，Y，Z＝N;R3＝CH3）
在一个配有干燥管的15ml圆底烧瓶中放入2.5mlDMF，23ulEt3N（0.16mmol）和25ul（0.16mmol）氰磷酸酸二乙。向其中加入二氨基蝶酸酯（1，R1，R2＝NH2;X，Y，Z＝N;R3＝CH3）（0.16mmol），混合物于室温下搅拌3小时，再加入5ul（0.04mmol）氰磷酸二乙酯。将F2Glu（0.16mmol）溶于1mlDMF中，然后加到反应烧瓶中，继续在室温下搅拌72小时。减压蒸除DMF，将残渣溶于35mlCHCl3中，用1%的NH4OH（2×20ML）洗涤除去未反应的起始物。有机层用20ml水洗涤，Na2SO4干燥，减压浓缩，得块状粗品。将此连结在一起的产品溶于纯净的TFA（3ml）中，并用TLC来监测该脱酯化反应的进程。24小时后，于旋转蒸发器上蒸除TFA，真空下将残渣干燥。
将粗品溶于20mlH2O中，用稀NH4OH调PH至8，然后将样品体积扩大到160ml，以使在上DEAE-纤维拄（Whafman DE-52）（30×1cm）前获得足够低的电导值。用100ml水洗涤该柱，再以175ml 15mM的NH4HCO3和175ml 500mM的NH4HCO3作洗脱液进行线性梯度洗脱，即得所需的具式Ⅰ的化合物。
实例3
β，β-二氟谷氨酸双-L-丁酯
3a  2，2-二氟戊-4-烯酰胺
将2，2-二氟戊-4-烯酸（27.2g，0.2mol）置于含有200ml己烷的三颈瓶中，该瓶配有回流冷凝器及N2导管，搅拌下向其中加入DMF（20滴，催化用）和草酰氯（20ml，0.23mol）。混合物于室温下搅拌2小时，至无进一步的气体放出。将溶液于冰/盐浴中冷却，用空Cacl2管（捕集烧瓶中吹出的固体物质）代替N2导管，并使NH3流通过烧瓶。在最初的剧烈反应平息后，再使气流保持30分钟。将混合物倾倒在水（11）和Et2O（0.51）中。用H2O和Et2O洗涤玻璃器皿，并将洗涤液加到混合物中，加入硅藻土，滤除不溶性物质。将两相分离，Et2O相用盐水洗涤一次，Na2SO4干燥并浓缩。水相用CH2cl2提取两次。合并所得的提取物用盐水洗涤一次，Na2SO4干燥，并与醚相残渣合并，再浓缩。残渣经蒸馏得标题酰胺（20.6g，76%），bp100-110℃/10托，其为浅黄色油状物，冷却后可固化，m.p.33-35℃。
1H NMR（CDCl3）δ7.0-6.0（2H，br.d），5.75（1H，ddt，J＝18，9，6Hz），5.3（2H，m），2.87（2H，dt，J＝6，17Hz）.19F NMR（δC6F6＝O）δ-56.0（t，J＝17Hz）.
元素分析：理论值（C5H7F2NO）：C，44.45;H，5.22;N，10.37。实测值：C，42.03;H，4.74;N，9.33。
3b  2，2-二氟戊-4-烯醇腈
在N气保护并冰/盐浴冷却下，于1.5小时内向上述酰胺（3a）（20.6g，0.152mol）的干燥吡啶溶液（25ml，0.31mol）中滴加二氟乙酸酐（TFAA，23.5ml，0.166mol）。反应混合物变成固体后，使之在室温下放置4小时。将烧瓶配上有N2保护的蒸馏装置，然后将其置于油浴上（最终温度可达130℃）。收集蒸馏物，可得17.7g无色油状物，其在空气中发烟，b.p70-80℃/760托。NMR分析表明蒸馏物的组份为腈∶TFAA∶吡啶＝80∶12∶8，因此腈的产量为0.116mol（76%）。
1H NMR（CDCl3）6.0-5.5（1H，m），5.4（2H，m），2.93（2H，dt，J＝6，15Hz）.19F NMR（δC6F6＝O）δ-71.7（t，J＝15Hz）.
3c  4，4-二氟辛-1，6-二烯-5-基胺盐酸盐
将1-丙烯基溴化物（27.22g，0.225mol）的四氢呋喃溶液（225ml）加到镁屑（5.47g，0.225mol）中，加入速度以保持混合物温热而不沸腾为宜，用此方法来制备丙烯基镁溴化物。加完后，将混合物搅拌20分钟，用THF（300ml）稀释，并冷却至-15℃。向此混合物中加入实例3b中制得的腈（0.116mmol）的THF（80ml）溶液，加入速度以使反应混合物的温度保持在-15℃-10℃为宜。混合物在此温度范围内继续搅拌1小时，然后冷却至-40℃。将-40℃的NaBH4（6.4g，0.169mol）的甲醇冷溶液（650ml）和水（30ml）一次加入其中。移去冷却溶，混合物再搅拌2小时，然后将其倾入6NHcl（800ml）中。在旋转蒸发器上蒸去有机溶剂，水层用CH2cl2洗涤两次，然后用NaOH小粒（需在冰浴下进行）将溶液碱化至PH＝10，并用Nacl进行饱和。向其中加入硅藻土，滤除沉淀的Mg（OH）2。固体残渣用CH2cl2洗涤，滤液用CH2cl2提取三次，合并的提取物与残渣洗涤物用Na SO干燥，过滤，经Et2O/Hcl酸化，蒸发得标题胺盐，其为灰黄色固体（3g），到此为止该产品并未纯化。
3d  N-（t-叔丁氧羰基）-4，4-二氟辛-1，6-二烯-5-基胺
将实例3c（35g）中的粗品盐溶于水（200ml）和二噁烷（200ml）中，向其中加入固体KHCO3，使之对PH试纸呈中性，然后再加入KHCO3（12g，0.12mol）和二-叔丁基碳酸酯（34g，0.196mol）。混合物于室温下搅拌过夜，然后用NaCL饱和。将两相分离，水相用己烷（×3）提取，提取物与有机相合并，并用水洗涤（×3）。合并的水层洗涤物再用己烷提取一次。该提取物与有机相合并，用盐水洗涤，Na2SO4干燥，浓缩。残渣经闪式柱层析纯化（洗涤液CH2cl2/戊烷＝1/1）得标题氨基甲酸酯（19g，65%），Rf＝0.29，其为油状物，放置后固化。
1H NMR
（CDCl3）δ6.0-5.5（2H，m）;5.5-4.5（5H，m）;2.67（2H，dt，J＝7，16Hz）;1.73（3H，dd＊，J＝7，1Hz）;1.47（9H，s）.19F NMR（δC6F6＝0）δ-53.2（m）.
3e  β，β-二氟谷氨酸盐酸盐
向冰浴冷却的KMnO4（52.55g，0.33mol）水溶液（1.21）中加入实例3d中制得的氨基甲酸酯（10.95g，0.042mol）的AcOH（160ml）溶液。混合物于室温下搅拌过夜，在此过程中有棕色固体沉出。向其中加入二硫化钠使溶液脱色，然后加浓Hcl使溶液的PH值达到2。用EtO（3×500ml）提取该溶液，然后用Nacl饱和，再用EtO提取2次。合并有机组份，用盐水洗涤并浓缩。残渣用1NHcl（500ml）提取再浓缩。然后再用1NHcl提取残渣，将混合物加热，加入活性炭，将混合物搅拌10分钟，过滤，过液蒸发至干。用热的异丙醇提取残渣，得粗品氨基酸（2.22g）。用EtOH进一步提取异丙醇不溶物来得到任何有用的物质。
19F NMR（D2O：δCF3CO2H＝0）δ+23（ddt，J＝280，5，21Hz），+27（ddt，J＝280，22，9Hz）;+28（t）;relative integrals 5∶5∶3.
3f  β，β-二氟谷氨酸双叔-丁酯
将实例3e中制得的粗品酸（2.22g）悬浮于乙酸叔丁酯中（500ml），然后加入HClO4（2.16ml，70%的水溶液，25mmol）。混合物于室温下搅拌48小时，用H2O（2×200ml）提取。合并的提取物用CH2cl2（2×100ml）洗涤，然后用4N的NaOH使之碱化至PH＝10。该溶液再用CH2cl2（3×100ml）提取。合并的提取物用盐水洗涤，Na2SO4干燥，将体积浓缩至原来的1/3。此溶液无需纯化即可用于下一步反应。蒸发得更加充分的样品所显示的核磁数据如下：
1H NMR（CDCl3）δ4.10（1H，t，J＝14Hz），3.10（1H，t，J＝15Hz），3.00（1H，t，J＝15Hz），1.5（18H，2s）;19F NMR（δC6F6＝O）δ-58.7（dt，J＝14，15Hz）.
实例4
β，β-二氟谷氨酸盐酸盐
向实例3中所得的BOC-双双酯（300mg，0.76mmol）的干燥Et2O（10ml）溶液中加入饱和Et2O/Hcl（3ml）。混合物于室温下搅拌6天（有Cacl2管保护）。收集白色沉淀固体，用Et2O洗涤。TLC及NMR分析表明酯键的断裂是不完全的。用1NHCl（5ml）提取该物质，并在室温下搅拌过夜。反应仍不完全，加入几滴浓Hcl，将混合物搅拌3天。减压蒸除水，残渣经与CCl4共沸蒸发干燥。用二异丙醚研磨二次，得一浅绿色粉未，收集并用P2O5干燥，得标题氨基酸（175mg，100%）。
1H NMR（D2O）.Signals obscured by solvent.19F NMR（δ CF3CO2H＝O）δ+23（ddt，J＝280，5，21Hz），+27（ddt，J＝280，22，9Hz）.MS（CI，NH3）m/e 184（MH+，100%），140（75%），120（40%），102（40%）.Rf（HOAc/H2O/BuOH 1/1/3）0.19.
元素分析：理论值：（C5H7F2NO4.Hcl）C，27.35;H，3.67;N，6.38。实测值：C，28.13;N，3.58;N，6.25。

Claims (2)

1、制备式I的含叶酸和抗叶酸的轭合物及其
Figure 911022880_IMG1
药用盐的方法，
其中，R1为-NH2，H，或-CH3；
R2为-NH2或-OH
R3为H，(C1-C4)烷基，
X，Y和Z分别独立地为氮原子或CH基团；
该方法包括：
i)用氰化磷酸二乙酯(Eto)2P(=0)CN将式2
Figure 911022880_IMG3
化合物(其中R1，R2，R3，X，Y，Z如上定义)与式3化合物偶联，然后除去叔丁酯保护基；或
ii)将式4化合物
Figure 911022880_IMG4
其中R3如上定义，与式3化合物反应生成式5化合物，
其中R3如上定义，然后将式5化合物与式6化合物
其中R1，R2，X和Y如上定义，反应，所得叔丁氧基保护的化合物再水解脱保护，得所要的式I化合物。
2、制备用于治疗肿瘤疾病的药物组合物方法，该组合物包括：作为活性成份的式Ⅰ化合物和药用载体。
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