CN105567838A - miR-331-5p作为急性HIV感染检测标志物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测miR-331-5p表达水平的物质在制备诊断或辅助诊断急性HIV感染患者产品中的用途,所述miR-331-5p核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本发明利用实时定量PCR技术,待测样品为待测者血浆,通过检测被测血浆中miR-331-5p的含量,并通过与正常人群miR-331-5p水平比较以诊断急性HIV感染。本发明提出的急性HIV感染标志物miR-331-5p预测急性HIV感染的AUC是0.801(95%置信区间:0.65-0.95),敏感度和准确度均为80%。灵敏性高,特异性强,操作方便,有利于临床应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种急性HIV感染检测标志物,具体地说是miR-331-5p作为急性HIV感染检测标志物中的应用。
背景技术
艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染所致的疾病,HIV感染后,病毒大量吞噬、破坏T4淋巴细胞,从而使整个人体免疫系统遭到破坏,最终人体丧失对各种疾病的抵抗能力而导致死亡。根据中国疾控中心发布的数据,截至2015年10月底,全国报告存活的艾滋病病毒感染者和病人共计57.5万例,死亡17.7万人。艾滋病不仅影响广大人民群众的生命健康,也给社会稳定和经济发展带来严重危害。
急性HIV感染的诊断有利于早期发现和治疗,在艾滋病的防治工作中具有重要作用。急性HIV感染时,HIV抗体尚未充分产生,诊断主要依靠HIV抗原和核酸检测,HIV抗原检测的敏感性为30~90%,仅为HIV感染的辅助诊断依据,而HIV核酸检测的价格昂贵。有关急性HIV感染的诊断方法有待进一步提高和完善(HoeniglMetal.,CostsperDiagnosisofAcuteHIVInfectioninCommunity-basedScreeningStrategies:AComparativeAnalysisofFourScreeningAlgorithms.ClinInfectDis2015;pii:civ912.)。
由于microRNA能以稳定的形式广泛存在于包括血液、唾液和尿液等体液中,是一种重要的生物标志物。因此,循环miRNA可以作为潜在的血液生物标记物,用于疾病检测,其优势在于非侵入性地提取组织标本。研究显示,microRNA作为一种潜在的疾病诊断生物标记物,在肿瘤、心血管疾病、糖尿病和感染性疾病诊断以及司法鉴定中具有重要的作用(FaruqOetal.,microRNA:DiagnosticPerspective.FrontMed(Lausanne)2015;2:51.doi:10.3389/fmed.2015.00051.)。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种检测miR-331-5p表达水平的物质的新用途。
本发明的第二目的在于提供一种含有上述物质的诊断或辅助诊断急性HIV感染的试剂盒。
为了实现上述发明目的,本发明采用如下技术方案:
检测miR-331-5p表达水平的物质在制备诊断或辅助诊断急性HIV感染患者产品中的用途,其中,所述miR-331-5p核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
检测miR-331-5p表达水平的物质在制备检测或辅助检测急性HIV感染的产品中的用途,其中,所述miR-331-5p核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。具体序列如下所示:
SEQIDNo.1CUAGGUAUGGUCCCAGGGAUCC
所述检测miR-331-5p表达水平的物质为如下a)或b)或c):
a)扩增所述miR-331-5p的引物和/或探针;
b)含有所述a)的PCR试剂组;
c)含有所述a)或所述b)的试剂盒。
所述引物包括序列如SEQIDNo.3所示的上游引物;及序列如SEQIDNo.4所示的下游引物。
上述具体序列如下:
SEQIDNo.3miR-331-5p-F:
GGCCTAGGTATGGTCCCAG
SEQIDNo.4miR-331-5p-R:
GTGCAGGGTCCGAGGT。
miR-331-5p作为标志物在制备诊断或辅助诊断急性HIV感染患者产品中的用途,所述miR-331-5p核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
一种检测miR-331-5p表达水平的物质,其中,所述检测miR-331-5p表达水平的物质为如下a)或b)或c):
a)扩增所述miR-331-5p的引物和/或探针;
b)含有所述a)的PCR试剂组;
c)含有所述a)或所述b)的试剂盒。
所述扩增miR-331-5p的引物包括序列如SEQIDNo.3所示的上游引物,及序列如SEQIDNo.4所示的下游引物。
一种诊断或辅助诊断急性HIV感染的试剂盒,其中,所述试剂盒包含上述的检测miR-331-5p表达水平的物质。
所述试剂盒组成为:上述SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示引物和PCR反应液。
所述PCR反应液12.5μL,其由SybergreenI荧光染料0.5-1X、DNA聚合酶100U/mL、dNTPs0.2mM、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐16.5mM、氯化钾89.3mM、氯化镁6mM和水组成。
试剂盒中上游引物(SEQIDNo.3)(10μM)1μL,下游引物(SEQIDNo.4)(10μM)1μL。
所述试剂盒还可以包括逆转录引物及内参体系,所述逆转录引物的序列如SEQIDNo.2所示;所述内参为U6,内参体系包括针对U6的逆转录引物及检测引物,逆转录引物序列如SEQIDNo.5所示;检测引物序列如SEQIDNo.6及SEQIDNo.7所示。
上述miR-331-5p表达水平为血浆表达水平。
本发明的有益效果如下:
本发明利用实时定量PCR技术,待测样品为待测者血浆,通过检测被测血浆中miR-331-5p的含量,并通过与正常人群miR-331-5p水平比较以诊断急性HIV感染。本发明提出的急性HIV感染标志物miR-331-5p预测急性HIV感染的AUC是0.941(95%置信区间:0.0.867-1.000),敏感度和准确度均为90%。灵敏性高,特异性强,操作方便,有利于临床应用。本发明所建立的急性期HIV感染诊断方法,为HIV感染的早期诊断提供了重要的参考依据。
附图说明
图1为U6和miR-331-5p的标准曲线。
图2为血浆miR-331-5p在HIV感染前后表达水平比较示意图。与HIV感染前相比,血浆miR-331-5p在HIV感染后显著升高。P=0.001。
图3为血浆miR-331-5p诊断急性HIV感染的ROC曲线(Receiveroperatingcharacteristiccurve,ROCcurve)及曲线下面积(Areaunderthecurve,AUC)。图中显示了急性HIV感染的ROC曲线、AUC、灵敏度(Sensitivity)和准确度(Specificity)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1临床血浆标本miR-331-5p表达与急性HIV感染的相关性实用性验证
1.材料与标本收集描述
标本均来自于佑安医院男男同性恋高危人群动态随访队列,每隔2个月随访一次,采集全血后分离血浆和外周血单个核细胞冻存,选取20例急性HIV感染者感染前后的标本,这些感染者均排除合并梅毒、乙肝和丙肝。
2.血浆miRNA提取
血浆RNA通过Qiagen的miRNeasySerum/PlasmaKit试剂盒按照试剂盒说明书操作步骤进行提取和纯化,具体步骤如下:
2.1解冻冻存的血浆样本。
2.2每100μL样本中加入500μLQIAzolLysisReagent试剂,采用移液器反复吹打混匀。
2.3将混匀样品在室温下孵育5分钟。
2.4加入100μL氯仿,振荡混匀15秒。
2.5室温孵育2~15分钟。
2.6在12000×g,4℃下离心15分钟。
2.7将上层液相物质转移至新的试管,在操作时避免吸入任何中间相或有机层物质;加入150μL100%乙醇,采用移液器反复吹打混匀。
2.8将样本加入RNeasyMinispin小柱以10000×g离心力,室温离心15秒。弃过滤液。
2.9重复2.8步骤离心一次。
2.10加入700μLRWT缓冲液,以10000×g离心力,室温离心15秒。弃过滤液。
2.11加入500μLRPE缓冲液,以10000×g离心力,室温离心15秒。弃过滤液。
2.12重复2.11步骤离心一次。
2.13将RNeasyMinispin小柱置于新的2mL离心管,12000g离心2分钟。
2.14将RNeasyMinispin小柱置于新的1.5mL离心管,30-50μLRNase-free水,以10000×g离心力,离心1分钟。将RNA洗脱备用。
3.RNA反转录
3.1在冰上融化RNA,室温下融化BufferMix和RNasefree水。
3.2在冰上配制反转录混合液:BufferMix10μL,miRNARTenzymeMix2μL,0.1%BSA2μL,模板RNA1μL,最后加入适量RNase-free水将总体积调至20μL。
3.3将PCR管中的逆转录混合液置于ABI7900HT型定量PCR仪进行反转录反应,在37℃孵育60分钟,在85℃下孵育5秒。
3.4将逆转录反应产物(cDNA)置于-20℃备用。
4.实时荧光定量PCR检测miR-331-5p表达水平
4.1反应体系配置:2XqPCRMix12.5μL,上游引物1μL,下游引物1μL,cDNA5μL,RNase-free水5.5μL。
4.2反应条件为:37℃→20分钟,95℃→10分钟;(95℃15秒,60℃1分钟)→40个循环。
4.3将PCR反应板置于快速荧光定量PCR仪(7900HT),按照4.2反应条件进行扩增。
4.4制作标准曲线:上述检测完成后,拷贝数以10为底取对数作为横坐标,Cq值作为纵坐标作图,绘制标准曲线,计算斜率S,根据公式E=10(-1/S)-1,计算扩增效率E。
4.5计算:选中样本和校对样本检测孔,应用实时定量PCR仪的随机软件得出样本阈值Cq和校对样本阈值Cq,根据公式Q=(E+1)-ΔCq,ΔCq=[Cq(T)-Cq(C)],得出基因的校正起始拷贝数Q,将miR-331-5p的Q值,与内参基因U6的Q值的几何平均数相比,得到miR-331-5p的相对表达量。
5.统计分析miR-331-5p相对表达量
采用t检验比较HIV感染前后miR-331-5p表达的差异,ROC曲线用于判断miR-331-5p在急性HIV感染诊断中的灵敏度和准确度。所用统计软件为SPSS20.0,当P小于0.05时,认为差异显著。
6.实验结果
(1)标准曲线见图1。
如图1所示,与内参U6水平(图1左)相比的血浆miR-331-5p归一化水平(图1右)在HIV感染前后具有显著差异(P<0.001)。
(2)miR-331-5p在急性HIV感染前后的表达水平比较。
如图2所示,20例样本HIV感染前后血浆miR-331-5p的均值和标准差分别为1.000±0.561和2.986±1.321,急性HIV感染后miR-331-5p的表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.001)。
(3)血浆miR-331-5p对于急性HIV感染的预测值
如图3所示,血浆miR-331-5p作为生物标志物对急性HIV感染的预测表现参见ROC曲线。20例样本血浆miR-331-5p预测急性HIV感染的AUC是0.941(95%置信区间:0.867-1.00),敏感度和准确度均为90%,说明本发明检测结果准确性高。
7.结论
(1)急性HIV感染后血浆miR-331-5p水平显著升高。
(2)血浆miR-331-5p的水平可以作为生物标志物来筛查和诊断急性HIV感染。
实施例2本发明试剂盒的制备及使用方法
本发明试剂盒的组成:
1.用于检测miR-331-5p表达水平的引物序列,检测引物序列如上游引物SEQIDNo.3(10μM)1μL及下游引物SEQIDNo.4(10μM)1μL所示。
2.PCR反应液可以为本领域技术人员公知组成,本发明推荐组成为:PCR反应液12.5μL,其中含SybergreenI荧光染料0.5-1X、DNA聚合酶100U/mL、dNTPs0.2mM、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐16.5mM、氯化钾89.3mM、氯化镁6mM和无菌水5.5μL。
本发明试剂盒使用方法:
1.待检样本中miRNA的提取:购买Qiagen的miRNeasySerum/PlasmaKit试剂盒按照试剂盒说明书操作步骤进行。参照实施例1材料与标本收集描述中血浆miRNA提取。采集待测者血浆样本,提取miRNA。
2.RT-PCR扩增
采用试剂盒及逆转录引物(SEQIDNo.2)对上述miRNA提取物进行反转录成cDNA。取5μLcDNA为模板进行PCR反应。
PCR反应体系如下:模板DNA5μL,PCR反应液12.5μL,上游引物(SEQIDNo.3)(10μM)1μL,下游引物(SEQIDNo.4)(10μM)1μL,无菌水5.5μL。
反应条件为:37℃→20分钟,95℃→10分钟;(95℃15秒,60℃1分钟)→40个循环。
内参基因U6的RT-PCR扩增,除引物采用相对应的逆转录引物和检测引物外,方法相同。内参基因U6逆转录引物如SEQIDNo.5所示,检测引物如SEQIDNo.6及SEQIDNo.7所示。
3.制作标准曲线:上述检测完成后,拷贝数以10为底取对数作为横坐标,Cq值作为纵坐标作图,绘制标准曲线,计算斜率S,根据公式E=10(-1/S)-1,计算扩增效率E。
4.计算:选中样本和校对样本检测孔,应用实时定量PCR仪的随机软件得出样本阈值Cq和校对样本阈值Cq,根据公式Q=(E+1)-ΔCq,ΔCq=[Cq(T)-Cq(C)],得出基因的校正起始拷贝数Q,将miR-331-5p的Q值,与内参基因U6的Q值的几何平均数相比,得到miR-331-5p的相对表达量。
5.检测结果
(1)若待测患者的miR-331-5p的表达量高于健康人,且二者有显著差异,则被测者为或候选为急性HIV感染患者;
(2)若被测者不满足上述步骤1)的条件,则被测者不为或候选不为急性HIV感染患者。
Claims (10)
1.检测血浆miR-331-5p表达水平的物质在制备诊断或辅助诊断急性HIV感染患者产品中的用途,其特征在于,所述miR-331-5p核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
2.检测miR-331-5p表达水平的物质在制备检测或辅助检测急性HIV感染的产品中的用途,其特征在于,所述miR-331-5p核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
3.如权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述检测miR-331-5p表达水平的物质为如下a)或b)或c):
a)扩增所述miR-331-5p的引物和/或探针;
b)含有所述a)的PCR试剂组;
c)含有所述a)或所述b)的试剂盒。
4.如权利要求3所述的用途,其特征在于,所述引物包括序列如SEQIDNo.3所示的上游引物,及序列如SEQIDNo.4所示的下游引物。
5.miR-331-5p作为标志物在制备诊断或辅助诊断急性HIV感染患者产品中的用途,其特征在于,所述miR-331-5p核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
6.一种检测miR-331-5p表达水平的物质,其特征在于,所述miR-331-5p核苷酸序列如SEQIDNo.1所示;所述检测miR-331-5p表达水平的物质为如下a)或b)或c):
a)扩增所述miR-331-5p的引物和/或探针;
b)含有所述a)的PCR试剂组;
c)含有所述a)或所述b)的试剂盒。
7.权利要求6述的检测miR-331-5p表达水平的物质,其特征在于,所述扩增miR-331-5p的引物包括序列如SEQIDNo.3所示的上游引物,及序列如SEQIDNo.4所示的下游引物。
8.一种检测或辅助检测急性HIV感染的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含权利要求6或7所述的检测miR-331-5p表达水平的物质。
9.如权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒组成为:权利要求7所述的引物及PCR反应液。
10.如权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述PCR反应液12.5μL,其由SybergreenI荧光染料0.5-1X、DNA聚合酶100U/mL、dNTPs0.2mM、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐16.5mM、氯化钾89.3mM、氯化镁6mM和水组成。
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