CN105567593B - 墨西哥微小杆菌2a及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于利用微生物及其代谢产物提高原油采收率的三次采油技术领域，公开了一株墨西哥微小杆菌2a，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2014674。本发明还公开了墨西哥微小杆菌2a在原油或固体石蜡降解及防止石蜡结晶沉积中的应用，墨西哥微小杆菌2a对原油中胶质及沥青质的最大降解率达到72.8％及57.9％，可使原油粘度降低11.1％；可使固体石蜡在正己烷中的溶解度显著提高，可溶解石蜡量为石蜡总量的62.0％，结晶石蜡量较对照组降低64.7％，使清蜡率及防蜡率分别达77.1％及96.9％；其细胞呈高疏水性，并能较牢靠的附着在金属表面，形成生物膜，防止蜡结晶沉积。

Description

墨西哥微小杆菌2a及其应用
技术领域
本发明属于利用微生物及其代谢产物提高原油采收率的三次采油技术领域，具体涉及墨西哥微小杆菌2a及其应用。
背景技术
石油是工业经济的血液，石油安全关系到一个国家经济、社会的可持续发展与国防安全。在经济全球化和区域化发展的国际环境里，世界各国均把石油资源的持续、合理及稳定获得作为国家的重要战略。
目前，通过一次及二次采油，原油采收率约为地质储量的30％左右，尚有大量的残留原油有待通过新技术进行开采。限制原油采收率提高的主要因素：一是原油中的沥青、胶质、蜡质等高分子烃粘度大，流动性差，二是原油紧密附着在储油层的多孔载体上不易流动。此外，我国原油含蜡量非常高，随着原油的开采，石蜡从地层深处向表层流动时，其随温度降低而凝结沉积在井壁及油管壁上，堵塞影响原油生产及运输。因此解除结蜡是原油生产及管道运输亟待解决的问题。
国内外常用机械清蜡、热力清防蜡及化学清蜡等。机械清蜡适用范围小，操作难度大，且设备磨损严重，使用较少；热力清蜡投入大，维护费用高，效果并不理想；化学清蜡应用较为普遍，操作简单、费用较低，但化学清蜡剂存在有毒、易燃及腐蚀设备等严重问题，对人体健康和环境保护都十分不利。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一株墨西哥微小杆菌2a及其应用，可用于对原油或石蜡的降解、防止石蜡结晶沉积，进而提升原油的采收率。
(一)一株墨西哥微小杆菌2a，分离自安塞油田、志丹油田的原油及油污土壤中，于2014年12月28日保藏于武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2014674，命名为墨西哥微小杆菌2a(Exiguobacterium mexicanum 2a)。
通过PCR反应，从细菌菌株2a的16S rDNA中扩增得到1.6kb的基因片段，将PCR产物纯化后，由南京金斯瑞生物科技有限公司测序，通过与Genebank中其他菌株16S rDNA序列进行对比分析，该细菌菌株与Exiguobacterium mexicanum AM072764的16S rDNA序列同源性达到99.78％，确认该菌株为墨西哥微小杆菌(Exiguobacterium mexicanum)。
将墨西哥微小杆菌2a在牛肉膏蛋白胨培养基上培养，菌株2a菌落大而干燥，橙色，表面褶皱向上隆起，边缘不整齐；电镜下细胞呈长杆状，宽0.3～0.5μm，长1.0～2.0μm。革兰氏染色呈阳性，需氧，葡萄糖与蔗糖发酵为阳性，柠檬酸与丙二酸利用为阳性，乙醇氧化及甲基红试验呈阳性，V-P试验为阴性，硝酸盐还原试验、亚硝酸还原及反硝化试验均为阳性，脲酶试验为阴性，产氨气，能水解淀粉与明胶。
(二)墨西哥微小杆菌2a的应用
(1)在原油降解中的应用。
(2)在固体石蜡降解中的应用。
(3)在防止石蜡结晶沉积中的应用。
(4)在饱和烃降解中的应用。
(5)在芳香烃降解中的应用。
(6)在胶质降解中的应用。
(7)在沥青降解中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明的墨西哥微小杆菌2a对原油及固体石蜡的降解能力强，能够降低原油黏度，增加石蜡在正己烷中的溶解性，同时具有强烈的清蜡功能。
(2)本发明的墨西哥微小杆菌2a呈高疏水性及强烈亲脂性，有利于细菌附着于烃类表面完成对烃类的降解。
(3)本发明的墨西哥微小杆菌2a细胞可较牢固地附着在金属表面，并生长繁殖，形成由微生物细胞组成的具有很强的抗流体冲刷能力的细胞屏障，可阻止蜡质在载体表面结晶沉积，具有很强的微生物防蜡功能。
以上墨西哥微小杆菌2a对原油及石蜡的降解功能、其细菌细胞的疏水亲脂功能及在钢材载体表面附着生长产生的防蜡功能在申请日前的文献中均无报道，因此该墨西哥微小杆菌2a是一株新发现的多功能驱油细菌，对我国含蜡原油生产及管道运输结蜡难题解决均具有重要的应用价值。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为墨西哥微小杆菌2a的菌落形态及显微形态图。
图2为墨西哥微小杆菌2a的系统进化树图。
图3为墨西哥微小杆菌2a处理固体石蜡在正己烷中的溶解效果对比图。其中，图左为空白组效果图，图右为墨西哥微小杆菌2a对固体石蜡溶解性的效果图。
图4为墨西哥微小杆菌2a发酵液处理固体石蜡扫描电镜图。其中，图左为空白组处理固体石蜡扫描电镜图，图右为墨西哥微小杆菌2a发酵液处理固体石蜡扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但是以下实施例并不作为限制本发明的保护范围。
实施例1 菌种的鉴定
(1)形态特征
将墨西哥微小杆菌2a在牛肉膏蛋白胨培养基上培养，菌株2a菌落大而干燥，橙色，表面褶皱向上隆起，边缘不整齐；电镜下细胞呈长杆状，宽0.3～0.5μm，长1.0～2.0μm。具体形态如图1。
(2)生化特性
革兰氏染色呈阳性，需氧，葡萄糖与蔗糖发酵为阳性，柠檬酸与丙二酸利用为阳性，乙醇氧化及甲基红试验呈阳性，V-P试验为阴性，硝酸盐还原试验、亚硝酸还原及反硝化试验均为阳性，脲酶试验为阴性，产氨气，能水解淀粉与明胶。
(3)16S rDNA序列分析
通过PCR反应，从细菌菌株2a的16S rDNA中扩增得到1.6kb的基因片段，将PCR产物纯化后，由南京金斯瑞生物科技有限公司测序，通过与Genebank中其他菌株16S rDNA序列进行对比分析，该细菌菌株与Exiguobacterium mexicanum AM072764的16S rDNA序列同源性达到99.78％，确认该菌株为墨西哥微小杆菌(Exiguobacterium mexicanum)。墨西哥微小杆菌2a的系统进化树如图2。
16S rDNA扩增测序结果如SEQ ID No.1所示，如下：
GTCGAGCGCAGGAAATCGACGGAACCCTTCGGGGGGAAGTCGACGGAATGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAAAGAACCTGCCCTCAGGTCTGGGATAACCACGAGAAATCGGGGCTAATACCGGATGGGTCATCGGACCGCATGGTCCGAGGATGAAAGGCGCTTCGGCGTCGCCTGGGGATGGCTTTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGTTCTGTTGTAAGGGAAGAACAAGTGCCGCAGGCAATGGCGGCACCTTGACGGTACCTTGCGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCCTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGCCATTGGAAACTGGGAGGCTTGAGTATAGGAGAGAAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTTTGGCCTATAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGAAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAACTCTTGACATCCCCCTGACCGGTACAGAGATGTACTTTCCCCTTCGGGGGCAGGGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCACCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGAGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCCAGAAAGCCGTTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTAGGGAGCC
实施例2 菌种的应用
(1)对原油的降解
试验方法：将墨西哥微小杆菌2a活化并接入到装有250mL灭菌原油降解培养基的600mL组培瓶中，30℃静置培养14d，以不接墨西哥微小杆菌2a的原油降解培养基为空白对照。培养期间每天摇晃组培瓶，使培养体系内菌体与基质保持均匀。培养结束后，通过氧化铝柱层析吸附色谱法测定菌株对原油中饱和烃、芳香烃、胶质以及沥青质含量变化。
试验结果：如表1所示，由表可知，墨西哥微小杆菌2a对原油中饱和烃、芳香烃、胶质及沥青质的降解率分别为57.8％、73.1％、72.8％及57.9％，细菌降解处理样品与对照原油中4种组分的差异均达到显著水平(P＜0.05)。
表1墨西哥微小杆菌2a对原油族组成的影响
(2)对固体石蜡的降解
试验方法：将墨西哥微小杆菌2a活化并转接到装有100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的600mL组培瓶中，30℃，120r/min条件下培养4d，获得细菌发酵液；向600mL组培瓶中加入2.000g固体石蜡粉，再加入100mL细菌发酵液，30℃恒温培养7d，以加100mL蒸馏水为对照组(CK)。降解反应结束后，用0.8g脱脂棉过滤，分别收集滤液和脱脂棉滤出的固体石蜡，将脱脂棉及其上的石蜡放置于通风处晾干，晾干后转移到100mL三角瓶中，按石蜡∶正己烷＝1.0g∶20mL的比例向三角瓶中加入约60℃的正己烷，待瓶内石蜡粉溶解后，用0.8g脱脂棉将其过滤到100mL细口玻璃瓶中。18℃静置24h，观察并拍照记录石蜡在18℃正己烷中的溶解状况。在相同温度下用滤纸将该温度下已结晶的石蜡滤出，分别收集18℃不溶石蜡和溶有固体石蜡的正己烷溶液，将后者在70℃水浴蒸发至恒重，分别称量18℃下从正己烷中析出的结晶石蜡质量、18℃溶解在正己烷中的石蜡质量，计算可溶解石蜡及结晶石蜡质量分数。
试验结果：如表2所示，由表可知，经墨西哥微小杆菌2a降解后，固体石蜡在正己烷中的溶解性发生显著变化，其溶解效果如图3所示，可溶解石蜡量已达到石蜡总量的62.0％，不溶解石蜡(结晶石蜡)量为石蜡总量的29.5％，较对照降低64.7％，表明该供试菌株能提高石蜡在正己烷中的溶解能力，增加正己烷可溶的小分子石蜡量。
表2固态石蜡在正己烷中的溶解性
(3)对蜡晶形态的影响
试验方法：称取墨西哥微小杆菌2a发酵液作用后的固体石蜡及对照各0.01g，溶解在10mL热正己烷中，胶头滴管吸取1滴滴在长、宽各5mm的盖玻片上，真空机抽真空2h，喷铂金，S-4800场发射扫描电镜观察微生物对蜡晶形态的影响。
试验结果：结果如图4，墨西哥微小杆菌2a能够降解石蜡，改变石蜡的蜡晶形态。未经墨西哥微小杆菌2a降解的石蜡表面较光滑，结构致密；经过墨西哥微小杆菌2a降解后，石蜡表面形成大量不同形状纹理突起及褶皱，表明石蜡的物理结构发生变化。
(4)对原油黏度的影响
试验方法：将墨西哥微小杆菌2a活化并转接到装有100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的600mL组培瓶中，30℃，120r/min下培养4d，此发酵液即为种子液。将制备好的种子液再转接到装有20.00g原油，200mL富集培养盐的1000mL三角瓶中，以加100mL蒸馏水为对照，30℃静置培养7d，每4小时摇动1次。反应结束后将三角瓶放置4℃冰箱中静置分层，待原油凝固后将其从三角瓶中取出，将发酵液与原油分离，60℃水浴融化原油，4000r/min离心5min，使原油中的少量水分与原油分离，用胶头滴管吸取原油，采用NDJ-79旋转粘度计(上海平轩科技仪器有限公司生产)测定原油在40℃时的黏度，计算墨西哥微小杆菌2a作为驱油细菌的降黏率。
试验结果：如表3所示，由表可知，墨西哥微小杆菌2a能够降低原油黏度，降黏率达11.1％。
表3墨西哥微小杆菌2a的降黏率
(5)对石油烃粘附性的影响
试验方法：将菌株活化并转接到装有250mL灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基的600mL组培瓶中，培养至对数期后，离心收集菌体，用PUM缓冲液(pH 7.1的K2HPO4-KH2PO4缓冲液)洗涤细胞2次后再悬于该缓冲液中。以PUM缓冲液为空白，将菌悬液OD660用PUM缓冲液调至0.400左右，记为初始菌悬液的OD660值，取5.0mL菌悬液置10mL离心管中，分别加入3mL正己烷于25℃下温育5min，剧烈振荡60S，室温静置30min；从离心管下层水相中快速吸取4.0mL水溶液到比色皿中，以PUM缓冲液为空白，测其OD660，重复3次取其平均值，计算细菌的疏水性。
试验结果：如表4所示，由表可知，墨西哥微小杆菌2a对正己烷的疏水性为71.1％，表明墨西哥微小杆菌2a细胞表面的疏水性很强，亲脂性亦强。即墨西哥微小杆菌2a容易对石油烃产生粘附，进而达到更好的降解石油烃的目的。
表4墨西哥微小杆菌2a的疏水性
(6)在载体表面的附着特征
试验方法：供试载体为玻璃质载玻片及普通钢片，将活化菌种转接到装有100mL牛肉膏蛋白胨培养基的600mL组培瓶中，置摇床30℃，120r/min下培养24h；将已灭菌的26mm×76mm载玻片及50mm×40mm的钢片分别放入培养瓶中摇床振荡培养3d(重复3次)。培养结束后将试片转移到已灭菌的装有10mL生理盐水的250mL组培瓶中，维持试片不动，轻轻摇动，通过水流将与玻璃及钢片结合不紧密的细菌细胞从载玻片及钢片上冲洗下来，将用该方法获得的细胞称为松结合态细胞；冲洗结束后将试片取出，转移到另一瓶装有1.0g细石英砂及10mL灭菌生理盐水的250mL组培瓶中，通过剧烈摇动组培瓶，依靠石英砂的摩擦作用将牢固附着在载玻片及钢片上的细菌细胞洗下来，将用该方法获得的细胞称为紧结合态细胞。采用稀释平板计数法测定从供试载体表面洗下的两种结合态细胞数，再根据载体表面积计算单位面积上细菌的附着密度(CFU/cm2)。
试验结果：如表5所示，由表可知，墨西哥微小杆菌2a细胞在载玻片及钢片上均有较高的附着密度。在载玻片上，墨西哥微小杆菌2a的松结合态、紧结合态细胞数分别为7.67×108CFU/cm2、6.81×106CFU/cm2；在钢片上，墨西哥微小杆菌2a的松结合态、紧结合态细胞数分别为7.48×108CFU/cm2、2.00×108CFU/cm2。此外，从表中还可看出，墨西哥微小杆菌2a在钢片上的紧结合态细胞附着密度大于玻璃，其细胞数量较玻璃高出2个数量级。
表5墨西哥微小杆菌2a细胞在玻璃及钢片表面的附着密度
(7)防蜡率及清蜡率的测定
试验方法：
A防蜡率采用静态法。准确称取2.000g含蜡原油分别装入100mL医用盐水瓶中，而后分别加入30mL墨西哥微小杆菌2a发酵液，30℃恒温培养48h，培养结束后将发酵液与原油的混合物倒入50mL小烧杯中，将用清洗剂及去离子水清洗并干燥的载玻片垂直悬挂于含原油的发酵液中，在1h内将原油温度由60℃降至25℃，静置30min后取出载玻片，用异丙醇洗去原油，然后称量，以加入30mL蒸馏水为空白对照，计算细菌防蜡率(WIR％)。
B清蜡率采用挂片法。以载玻片为原油吸附载体，测定墨西哥微小杆菌2a发酵液的清蜡率。将已称重的26mm×76mm载玻片浸入原油中，使原油覆满载玻片下端5.3cm长度内面积，保留载玻片上端2.3cm高度为无油区，待原油凝固后用天平称重精确至0.001g；将涂有原油的载玻片置于装有100mL发酵液的600mL组培瓶中，以加100mL蒸馏水为对照，30℃静置培养96h；取出载玻片，用清水漂洗净载玻片上附着的菌体及杂质，称重。发酵液作用前后载玻片的质量差为残存的来源于原油的石蜡，计算清蜡率(％)。
试验结果：如表6所示，由表可知，墨西哥微小杆菌2a具有很好的清蜡、防蜡作用。防蜡率达96.9％，清蜡率达77.1％，为对照的4倍。
表6墨西哥微小杆菌2a室内模拟清蜡率与防蜡率
以上实施例结果表明，本发明的墨西哥微小杆菌2a是1株新的多功能驱油细菌，具有降解原油、固体石蜡以及防蜡的功能。因此将其用于原油采收率的技术中，其具有无毒、无害、成本低廉、操作简便及安全可靠等独特的优势，
虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.墨西哥微小杆菌(Exiguobacterium mexicanum)2a，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2014674；所述墨西哥微小杆菌2a的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的墨西哥微小杆菌2a在原油降解中的应用。
3.权利要求1所述的墨西哥微小杆菌2a在固体石蜡降解中的应用。
4.权利要求1所述的墨西哥微小杆菌2a在防止石蜡结晶沉积中的应用。
5.权利要求1所述的墨西哥微小杆菌2a在饱和烃降解中的应用。
6.权利要求1所述的墨西哥微小杆菌2a在芳香烃降解中的应用。
7.权利要求1所述的墨西哥微小杆菌2a在胶质降解中的应用。
8.权利要求1所述的墨西哥微小杆菌2a在沥青降解中的应用。
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