CN105567564A - 食品中铅对人体的生物利用率及毒性的联合评价模型 - Google Patents

Abstract

食品中铅对人体的生物利用率及毒性的联合评价模型，其特征在于，包括肠黏膜上皮细胞、肝细胞以及由微孔膜分隔成顶侧室和基底侧室的容器，肠黏膜上皮细胞培养在顶侧室中，肝细胞培养在基底侧室中。本发明提供的联合评价模型从模型结构上更加与人体肠道吸收结构相似，既可以准确地测定食品中铅在人体的吸收效率，又可以灵敏高效评价食品中铅的毒性，该模型可以广泛用于食品中铅的食用安全性评价。

Description

食品中铅对人体的生物利用率及毒性的联合评价模型

技术领域

本发明涉及一种食品中铅对人体的生物利用率及毒性的联合评价模型。

背景技术

近年来，随着工农业生产以及人类采矿、冶炼等活动的加剧，大量的铅排放到环境中，致使农业系统中铅污染。人类主要通过膳食和呼吸途径摄入铅，而长期摄入被铅污染的食品会引起人体的铅中毒。食品安全性评价是预防人体铅中毒的重要保障。目前大多数评价方法基于食品中铅的含量间接计算食品摄入铅对人体的生物效应，该方法并不能真实反映食品摄入铅的生物效应。另外常规的动物体内试验耗时长、成本高、种属差异较大，限制了其数据在人体的外推性。因此建立相对操作方法简单、经济有效地评价食品中铅对人体生物利用率及毒性的方法已成为研究热点。

小肠是人体摄入食品中铅后吸收的主要部位。食品中铅在小肠中的吸收是决定其人体生物利用的关键因素。Caco-2单层细胞模型，即人结肠癌细胞模型，是目前被广泛应用于研究外源物质在人体吸收特征的代表性体外细胞模型之一。但该模型存在缺陷，尤其是缺乏分泌黏液的功能。另外，该模型也缺乏铅向体内器官的转运和蓄积过程的评价，从而与铅在人体内的吸收过程存在差异，导致实验结果与铅的实际生物利用率存在差异。

基于以上原因，本发明利用通过在Caco-2细胞中加入具有分泌黏液的能力的HT29-MTX细胞，共培养形成肠黏膜上皮细胞层，并联合QSG7701肝细胞建立人源性联合细胞模型同时评价食品中铅对人体的生物利用率及毒性的方法。该模型接近真实的人体生理环境，能够很好地模拟铅在人体的生物学行为，此评价方法可以更方便、更准确地评价食品中铅的生物利用率及毒性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人食品中铅对人体的生物利用率及毒性的联合评价模型。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

食品中铅对人体的生物利用率及毒性的联合评价模型，包括肠黏膜上皮细胞、肝细胞以及由微孔膜分隔成顶侧室和基底侧室的容器，肠黏膜上皮细胞培养在顶侧室中，肝细胞培养在基底侧室中。

所述顶侧室为包含有微孔膜的Transwell插入式细胞培养皿，基底侧室为细胞培养板，Transwell插入式细胞培养皿安装在细胞培养板的培养孔中。

所述肠黏膜上皮细胞包括Caco-2细胞和HT29-MTX细胞，所述肝细胞为QSG7701肝细胞。

所述联合评价模型的建立方法，包括如下步骤：

(1)肠黏膜上皮细胞培养

将Caco-2细胞与HT29-MTX细胞共培养于六孔板的Transwell插入式细胞培养皿中，形成肠黏膜上皮细胞单层，

(2)肝细胞培养

将QSG7701肝细胞培养在另一块六孔培养板中，

(3)联合评价模型的建立

将载有Caco-2细胞和HT29-MTX细胞的Transwell插入式细胞培养皿置于培养QSG7701细胞的六孔板之上，即可。

所述步骤(1)具体为：

将Transwell插入式细胞培养皿放入六孔培养板中，Caco-2细胞和HT29-MTX细胞按9：1混合得到混合细胞悬液，将1.5ml密度为1×10⁵个/ml混合细胞悬液接种于Transwell插入式细胞培养皿中，同时，在基底侧室加入2mL含胎牛血清的DMEM高糖完全培养液，其中胎牛血清的体积分数为10％；再置于37℃、5％CO₂、相对湿度90％的恒温培养箱中连续培养18～21天，期间每天更换基底侧室中的培养液，得到载有细胞跨膜电阻值大于等于250Ω·cm²的肠黏膜上皮细胞的Transwell插入式细胞培养皿。

所述步骤(2)具体为：

取另一块六孔培养板，每孔加入2ml细胞密度为1.5×10⁵个/mL的QSG7701肝细胞液，采用含胎牛血清的DMEM高糖完全培养基，其中胎牛血清的体积分数为10％，然后置于37℃、5％CO₂、相对湿度90％的恒温培养箱中连续培养3～5天，期间每天更换培养液，得载有QSG7701细胞的细胞培养板。

一种利用所述联合评价模型评价食品中铅对人体的生物利用率及毒性的方法，包括如下步骤：

(1)制备无菌食品待测液；

(2)将无菌食品待测液加入到所述联合评价模型的顶侧室的肠黏膜上皮细胞上，将HBSS溶液作为转运溶液加入到所述联合评价模型的基底侧室的肝细胞上，再将所述联合评价模型放入培养箱中培养；

(3)评价指标

①.分别检测肠黏膜上皮细胞、肝细胞和转运溶液中的铅含量，根据检测结果评价待测食品中铅对人体的生物利用率；

②.分别收集基底侧室中肝细胞和转运溶液样品，检测肝细胞和转运溶液中乳酸脱氢酶活性，根据检测结果评价待测定食品中铅对肝细胞的毒性。

步骤(1)具体为：

取待测食品，磨碎，加入pH1.5的胃蛋白酶，在37℃恒温水浴锅中消化2h；然后加入pH5.0的胰酶和胆汁消化液，在37℃恒温水浴锅中消化2h；用固体NaHCO₃调节消化液pH值为7.0～7.2，离心，收取上清液，上清液经0.22μm无菌滤膜过滤，获取无菌食品待测液。

步骤(2)所述联合细胞模型放入37℃、5％CO₂、相对湿度90％的培养箱中培养24h。

步骤(3)具体为：

①分别收集肠黏膜上皮细胞、肝细胞和转运溶液的样品，各个样品分别经过体积比为的4:1硝酸-双氧水消解，采用电感耦合等离子体质谱技术分别检测各个样品中铅含量，并通过下式计算铅的生物利用率：

铅的生物利用率(％)＝(肠黏膜上皮细胞铅含量+肝细胞铅含量+转运溶液铅含量)/食品中铅含量×100％

②分别收集基底侧室中肝细胞和转运溶液样品，每孔肝细胞中加入细胞裂解液100μL，于4℃静置15min后离心10min，收集细胞裂解液，采用乳酸脱氢酶试剂盒分别测定细胞裂解液和转运溶液中的乳酸脱氢酶活性，根据乳酸脱氢酶漏出率评价待测定食品中铅对人体的毒性，乳酸脱氢酶漏出率的计算式如下：

乳酸脱氢酶漏出率＝转运溶液中乳酸脱氢酶活性/(转运溶液中乳酸脱氢酶活性+细胞裂解液中乳酸脱氢酶活性)×100％。

与现有技术相比较，本发明具备的有益效果：

本发明提供的人源性联合细胞模型提供了类似人体内的复杂微环境，能够很好地模拟铅在人体的生物学行为，既可以评价人体对食品中铅的吸收效率，又可以灵敏高效评价食品中铅的毒性，该模型可以广泛用于食品中铅的食用安全性评价。

附图说明

图1为本发明所述的联合评价模型的结构示意图，图中，1为Transwell插入式细胞培养皿，2为细胞培养板，3为微孔膜，4为Caco-2细胞和HT29-MTX细胞，5为QSG7701细胞。

图2是水稻、芥菜中铅对人体的生物利用率。

图3是水稻、芥菜中铅对肝细胞的乳酸脱氢酶漏出率的影响。

具体实施方式

实施例1

就本发明测稻米、芥菜中铅对人体的生物利用率及毒性的事例说明

1.试验材料

1.1细胞株购自中国科学院上海细胞库。

1.2主要试剂和药品

DMEM高糖完全培养基、HBSS、胎牛血清购自Gibco公司，

胰蛋白酶、胆汁、胃蛋白酶购自Sigma公司，

乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)

其余试剂均为国产分析纯，

所用缓冲液为HBSS溶液，pH7.2～7.35。

1.4主要器材和仪器

六孔培养板(Costar，美国)，Transwell插入式细胞培养皿(聚酯膜，孔径0.4μm，Corning,美国)、Millicell-ERS跨膜电阻仪、超纯水系统(Millipore，美国)，CO₂培养箱(三洋，日本)，ICP-MS(PENexION300X，美国)，倒置相差显微镜(Leica，德国)，微波消解仪(CEMMARS6，美国)，SW-CJ-2F双人双面超净工作台(苏州净化设备有限公司)，ALLEGRAX-15R台式冷冻离心机(Beckman,美国)，MLS-3070高压灭菌锅(三洋，日本)，FE20K酸度计(mettlertoledo，瑞士)。

2.试验方法

2.1肠黏膜上皮细胞培养

2.1.1Caco-2细胞和HT29-MTX细胞接种培养

将Transwell插入式细胞培养皿放入六孔培养板中，Caco-2细胞和HT29-MTX细胞按9：1混合得到混合细胞悬液，将1.5ml密度为1×10⁵个/ml混合细胞悬液接种于Transwell插入式细胞培养皿中，同时，在基底侧室加入2mL含胎牛血清的DMEM高糖完全培养液，其中胎牛血清的体积分数为10％；再置于37℃、5％CO₂、相对湿度90％的恒温培养箱中连续培养18～21天，期间每天更换基底侧室中的培养液，得到载有细胞跨膜电阻值大于等于250Ω·cm²的肠黏膜上皮细胞的Transwell插入式细胞培养皿。

2.1.2肠黏膜上皮细胞模型的验证

用Millicell-ERS跨膜电阻仪隔天测定肠黏膜上皮细胞的跨膜电阻值，18～21天时，得到载有细胞跨膜电阻值大于等于250Ω·cm²的肠黏膜上皮细胞单层的Transwell插入式细胞培养皿。

2.2建立QSG7701肝细胞模型

2.2.1QSG7701肝细胞接种培养

取另一块六孔培养板，每孔加入2ml细胞密度为1.5×10⁵个/mL的QSG7701肝细胞液，采用含胎牛血清的DMEM高糖完全培养基，其中胎牛血清的体积分数为10％，然后置于37℃、5％CO₂、相对湿度90％的恒温培养箱中连续培养3～5天，期间每天更换培养液。

2.2.2QSG7701肝细胞模型验证

QSG7701肝细胞在六孔板长满后，将QSG7701肝细胞悬液与0.4％的台盼蓝溶液1:1混匀，放入细胞计数器，并通过显微镜观察，立即用计算活细胞百分率，细胞存活率为95％，细胞板内QSG7701肝细胞细胞之间连接成片，形态完好。

2.2.3QSG7701肝细胞模型建立

通过上述方法即获得形态完好、存活率高的QSG7701肝细胞模型，即得载有QSG7701肝细胞的细胞培养板。

2.3建立联合评价模型

所述联合评价模型包括肠黏膜上皮细胞、QSG7701肝细胞模型以及由微孔膜分隔成顶侧室和基底侧室的容器，肠黏膜上皮细胞培养在顶侧室中，QSG7701肝细胞细胞培养在基底侧室中。

在本实施例中，将载有肠黏膜上皮细胞的Transwell插入式细胞培养皿悬空安装在培养有QSG7701肝细胞的培养板的培养孔中即可。Transwell插入式细胞培养皿的底部与培养孔中的QSG7701肝细胞有一段距离。

2.4稻米、芥菜中铅对人体的生物利用率及毒性的评价试验

取待测食品，磨碎，加入pH1.5的胃蛋白酶，在37℃恒温水浴锅中消化2h；然后加入pH5.0的胰酶和胆汁消化液，在37℃恒温水浴锅中消化2h；用固体NaHCO₃调节消化液pH值为7.0～7.2，离心，收取上清液，上清液经0.22μm无菌滤膜过滤，获取无菌食品待测液。

将2mL无菌食品待测液加入到所述联合评价模型的顶侧室的肠黏膜上皮细胞上，将2mLHBSS溶液作为转运溶液加入到所述联合评价模型的基底侧室的肝细胞上，再将所述联合评价模型放入培养箱中培养，转运溶液的液面要求淹没过Transwell插入式细胞培养皿的底部，所述联合细胞模型放入37℃、5％CO₂、相对湿度90％的培养箱中培养24h。

2.5检测指标的测定

2.5.1食品中铅对人体生物利用率的测定

分别收集肠黏膜上皮细胞、肝细胞和转运溶液的样品，各个样品分别加入5mL体积比为的4:1硝酸-双氧水，置于微波消解仪，消解后获得细胞消解液，采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)技术分别检测各个样品中铅含量，并通过下式计算铅的生物利用率：

铅的生物利用率(％)＝(肠黏膜上皮细胞铅含量+肝细胞铅含量+转运溶液铅含量)/食品中铅含量×100％

2.5.2铅生物毒性的测定

分别收集基底侧室中肝细胞和转运溶液样品，每孔肝细胞中加入细胞裂解液100μL，于4℃静置15min后离心10min，收集细胞裂解液，采用乳酸脱氢酶试剂盒分别测定细胞裂解液和转运溶液中的乳酸脱氢酶活性，根据乳酸脱氢酶漏出率评价待测定食品中铅对人体的毒性，乳酸脱氢酶漏出率的计算式如下：

乳酸脱氢酶漏出率＝转运溶液中乳酸脱氢酶活性/(转运溶液中乳酸脱氢酶活性+细胞裂解液中乳酸脱氢酶活性)×100％。

3.实验结果

结果见图2，水稻中铅对人体有效性为8.4％，芥菜中铅对人体的有效性为5.2％。进入细胞模型基底侧的水稻和芥菜中的铅，增加QSG7701肝细胞乳酸脱氢酶漏出率，对人体产生毒性(图3)。

Claims (10)

1.食品中铅对人体的生物利用率及毒性的联合评价模型，其特征在于，包括肠黏膜上皮细胞、肝细胞以及由微孔膜分隔成顶侧室和基底侧室的容器，肠黏膜上皮细胞培养在顶侧室中，肝细胞培养在基底侧室中。

2.如权利要求1所述联合细胞模型，其特征在于，所述顶侧室为包含有微孔膜的Transwell插入式细胞培养皿，基底侧室为细胞培养板，Transwell插入式细胞培养皿安装在细胞培养板的培养孔中。

3.如权利要求1所述联合细胞模型，其特征在于，所述肠黏膜上皮细胞包括Caco-2细胞和HT29-MTX细胞，所述肝细胞为QSG7701肝细胞。

4.如权利要求1所述联合评价模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)肠黏膜上皮细胞培养

将Caco-2细胞与HT29-MTX细胞共培养于六孔板的Transwell插入式细胞培养皿中，形成肠黏膜上皮细胞单层，

(2)肝细胞培养

将QSG7701肝细胞培养在另一块六孔培养板中，

(3)联合评价模型的建立

将载有Caco-2细胞和HT29-MTX细胞的Transwell插入式细胞培养皿置于培养QSG7701细胞的六孔板之上，即可。

5.如权利要求4所述联合评价模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：

将Transwell插入式细胞培养皿放入六孔培养板中，Caco-2细胞和HT29-MTX细胞按9：1混合得到混合细胞悬液，将1.5ml密度为1×10⁵个/ml混合细胞悬液接种于Transwell插入式细胞培养皿中，同时，在基底侧室加入2mL含胎牛血清的DMEM高糖完全培养液，其中胎牛血清的体积分数为10％；再置于37℃、5％CO₂、相对湿度90％的恒温培养箱中连续培养18～21天，期间每天更换基底侧室中的培养液，得到载有细胞跨膜电阻值大于等于250Ω·cm²的肠黏膜上皮细胞的Transwell插入式细胞培养皿。

6.如权利要求4所述联合评价模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：

取另一块六孔培养板，每孔加入2ml细胞密度为1.5×10⁵个/mL的QSG7701肝细胞液，采用含胎牛血清的DMEM高糖完全培养基，其中胎牛血清的体积分数为10％，然后置于37℃、5％CO₂、相对湿度90％的恒温培养箱中连续培养3～5天，期间每天更换培养液，得载有QSG7701细胞的细胞培养板。

7.一种利用如权利要求1所述联合评价模型评价食品中铅对人体的生物利用率及毒性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备无菌食品待测液；

(2)将无菌食品待测液加入到所述联合评价模型的顶侧室的肠黏膜上皮细胞上，将HBSS溶液作为转运溶液加入到所述联合评价模型的基底侧室的肝细胞上，再将所述联合评价模型放入培养箱中培养；

(3)评价指标

①.分别检测肠黏膜上皮细胞、肝细胞和转运溶液中的铅含量，根据检测结果评价待测食品中铅对人体的生物利用率；

②.分别收集基底侧室中肝细胞和转运溶液样品，检测肝细胞和转运溶液中乳酸脱氢酶活性，根据检测结果评价待测定食品中铅对肝细胞的毒性。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体为：

取待测食品，磨碎，加入pH1.5的胃蛋白酶，在37℃恒温水浴锅中消化2h；然后加入pH5.0的胰酶和胆汁消化液，在37℃恒温水浴锅中消化2h；用固体NaHCO₃调节消化液pH值为7.0～7.2，离心，收取上清液，上清液经0.22μm无菌滤膜过滤，获取无菌食品待测液。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述联合细胞模型放入37℃、5％CO₂、相对湿度90％的培养箱中培养24h。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)具体为：

①分别收集肠黏膜上皮细胞、肝细胞和转运溶液的样品，各个样品分别经过体积比为的4:1硝酸-双氧水消解，采用电感耦合等离子体质谱技术分别检测各个样品中铅含量，并通过下式计算铅的生物利用率：

铅的生物利用率(％)＝(肠黏膜上皮细胞铅含量+肝细胞铅含量+转运溶液铅含量)/食品中铅含量×100％

②分别收集基底侧室中肝细胞和转运溶液样品，每孔肝细胞中加入细胞裂解液100μL，于4℃静置15min后离心10min，收集细胞裂解液，采用乳酸脱氢酶试剂盒分别测定细胞裂解液和转运溶液中的乳酸脱氢酶活性，根据乳酸脱氢酶漏出率评价待测定食品中铅对人体的毒性，乳酸脱氢酶漏出率的计算式如下：

乳酸脱氢酶漏出率＝转运溶液中乳酸脱氢酶活性/(转运溶液中乳酸脱氢酶活性+细胞裂解液中乳酸脱氢酶活性)×100％。