CN105624039A - 一种食品中砷对人体的生物有效性及毒性的联合评价模型 - Google Patents

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Abstract

一种食品中砷对人体的生物有效性及毒性的联合评价模型，包括Caco-2细胞模型、QSG7701肝细胞模型以及由多孔膜分隔成顶侧室和基底侧室的容器，Caco-2细胞培养在顶侧室中，QSG7701肝细胞培养在基底侧室中。本发明提供的联合评价模型从模型结构上更加与人体肠道吸收结构相似，既可以模拟人体对食品中砷的吸收效率，又可以灵敏高效评价食品中砷的毒性，该模型可以广泛用于食品中砷的食用安全性评价。

Description

一种食品中砷对人体的生物有效性及毒性的联合评价模型
技术领域
本发明涉及一种食品中砷对人体的生物有效性及毒性的联合评价模型。
背景技术
砷是自然界中广泛存在的污染物，可以通过食物链对人体健康产生危害。食品安全性评价是预防人体砷中毒的重要保障。目前大部分评价方法是基于食品中砷积累来间接计算食品摄入砷对人体的生物学效应，该方法不能真实反映食品摄入砷对人体的生物效应。另外，采用动物实验也是对食物中砷的人体生物有效性的评价方法，但它的应用受到实验周期相对较长、个体差异大、实验费用较高的限制，因此，毒性评价时往往存在偏差。而人体实验可直接反映食物中砷摄入人体后的生物有效性及生物毒性，但在伦理道德和具体实施上存在很大困难。基于以上评价方法存在的问题以及在实际操作过程中的难度，急需建立相对操作方法简单、实验条件易于控制的评价食品中砷对人体生物有效性及毒性的方法。
吸收过程是决定食品中砷对人体生物利用的关键因素之一。而小肠是食品中砷吸收的主要部位。来源于人的结肠癌细胞系的Caco-2单层细胞模型是目前被广泛应用于研究外源物质的生物膜通透性和跨膜转运机制的模型之一。该模型体系组成因素单一明确，且细胞结构、生化特性及功能与体内肠上皮细胞存在部分相似性，所以它可以用于食品中砷的吸收特性研究。但该模型缺少肝脏环境这一重要环节，从而与砷在人体内的吸收过程存在差异，并导致试验结果与砷实际生物有效性间存在差异。
基于以上原因，本发明利用Caco-2细胞、QSG7701肝细胞建立食品中砷对人体的生物有效性及毒性的联合评价模型及方法。该培养模型能够提供与在体组织类似的微环境，发挥其对砷吸收转运代谢的生理功能。此评价方法可以更方便、更准确地评价食品中砷的生物有效性及毒性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种食品中砷对人体的生物有效性及毒性的联合评价模型。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一食品中砷对人体的生物有效性及毒性的联合评价模型，包括Caco-2细胞模型、QSG7701肝细胞模型以及由多孔膜分隔成顶侧室和基底侧室的容器，Caco-2细胞培养在顶侧室中，QSG7701肝细胞培养在基底侧室中。
所述顶侧室为Transwell插入式细胞培养皿，基底侧室为细胞培养板，Transwell插入式细胞培养皿安装在细胞培养板的培养孔中。
所述Caco-2细胞模型是细胞跨膜电阻值大于等于550Ω·cm2的细胞单层。
所述联合评价模型的建立方法，包括如下步骤：
(1)Caco-2细胞培养
将Caco-2细胞培养在六孔板的Transwell插入式细胞培养皿；
(2)QSG7701肝细胞培养
将QSG7701肝细胞培养在另一块六孔培养板上；
(3)联合评价模型的建立；
将载有Caco-2细胞的Transwell插入式细胞培养皿置于培养QSG7701肝细胞的六孔板之上，即可。
所述步骤(1)具体为：
a.取Caco-2细胞，复苏，将Caco-2细胞单独培养于25cm2培养瓶中，加入含胎牛血清的DMEM培养液中培养，其中胎牛血清的体积分数为10％，按1:2传代进行传代培养，
b.将Transwell插入式细胞培养皿放入六孔培养板中，取传代好的Caco-2的细胞，将1.5mL密度为3×105个/ml的Caco-2细胞液滴入Transwell插入式细胞培养皿中，同时，在基底侧室加入2mL含胎牛血清的DMEM培养液，其中胎牛血清的体积分数为10％，然后置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，连续培养21天，期间每天更换基底侧室中的培养液，得载有Caco-2细胞的Transwell插入式细胞培养皿。
所述步骤(2)具体为：
a.取QSG7701细胞，复苏，将QSG7701肝细胞单独培养于25cm2培养瓶中，加入含胎牛血清的DMEM培养液，其中胎牛血清的体积分数为10％，按1:3传代培养，
b.取另一块六孔培养板，每孔加入2ml密度为1.5×105个/mL传代培养好的QSG7701细胞液，并每天换液，培养3～5天，得载有QSG7701肝细胞的细胞培养板。
一种利用所述联合评价模型评价食品中砷对人体的生物有效性及毒性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备无菌食品待测液；
(2)将无菌食品待测液加入到所述联合评价模型的顶侧室的Caco-2细胞层上，将HBSS溶液作为转运溶液加入到所述联合评价模型的基底侧室的QSG7701肝细胞上，再将所述联合评价模型放入培养箱中培养；
(3)评价指标
a.分别检测Caco-2细胞、QSG7701肝细胞和转运溶液中的砷含量，根据检测结果评价待测食品中砷对人体的生物有效性；
b.收集QSG7701肝细胞样品，采用倒置显微镜检测细胞的形态学，采用MTT试剂盒检测细胞活性，采用丙二醛试剂盒检测丙二醛含量，根据检测结果评价待测定食品中砷对细胞的毒性。
步骤(1)具体为：
取待测食品，磨碎，加入pH1.5的胃蛋白酶，在37℃恒温水浴锅中消化2h；然后加入pH5.0的胰酶和胆汁消化液，在37℃恒温水浴锅中消化2h；用固体NaHCO3调节消化液pH值为7.0～7.2，离心，收取上清液，上清液经0.22μm无菌滤膜过滤，获取无菌食品待测液。
步骤(2)，所述联合评价模型放入37℃、5％CO2、相对湿度90％的培养箱中培养24h。
步骤(3)具体为：
a.分别收集Caco-2细胞、QSG7701肝细胞和转运溶液的样品，各个样品分别经过体积比为的4:1硝酸-双氧水消解，用电感耦合等离子体质谱技术分别检测各个样品的消解液中砷含量，并通过下式计算砷的生物有效性：
砷的生物有效性(％)＝(Caco-2细胞砷含量+QSG7701肝细胞砷含量+转运溶液砷含量)÷食品中砷含量×100％。
b.收集QSG7701肝细胞一侧样品，采用倒置显微镜检测QSG7701肝细胞的形态学，采用MTT试剂盒检测QSG7701肝细胞的活性，采用丙二醛试剂盒检测QSG7701肝细胞的丙二醛含量，根据检测结果评价待测定食品中砷对人体的毒性。
与现有技术相比较，本发明具备的有益效果：
本发明提供的联合评价模型从模型结构上更加与人体肠道吸收结构相似，既可以模拟人体对食品中砷的吸收效率，又可以灵敏高效评价食品中砷的毒性，该模型可以广泛用于食品中砷的食用安全性评价。
附图说明
图1为本发明所述的建立联合评价模型的结构示意图，图中，1为Transwell插入式细胞培养皿，2为细胞培养板，3为多孔膜，4为Caco-2细胞模型，5为QSG7701肝细胞模型。
图2是水稻、小白菜中砷对人体的生物有效性。
图3是水稻(a)、小白菜(b)中砷对肝细胞形态的影响。
图4是水稻、小白菜中砷对肝细胞细胞活性的影响。
图5是水稻、小白菜中砷对肝细胞丙二醛的影响。
图6是Caco-2细胞培养21天后的形态。
图7是QSG7701细胞模型。
具体实施方式
实施例1
就本发明测稻米、蔬菜中砷对人体的生物有效性及毒性的事例说明
1.试验材料
1.1细胞株购自中国科学院上海细胞库。
1.2主要试剂和药品
DMEM培养基、胎牛血清、HBSS购自Gibco公司，
胰蛋白酶、胃蛋白酶、胆汁、非必需氨基酸购自Sigma公司，
青霉素和链霉素购自Amresco公司，
其余试剂均为国产分析纯。
所用缓冲液为HBSS溶液，pH7.2～7.35。
1.4主要器材和仪器
六孔培养板(Costar)，Transwell插入式细胞培养皿(聚酯膜，孔径0.4μm)、ICP-MS(PENexION300X，美国)，Millicell-ERS跨膜电阻仪、超纯水系统(Millipore，美国)，CO2培养箱(三洋，日本)，倒置相差显微镜(Leica，德国)，微波消解仪(CEMMARS6，美国)，SW-CJ-2F双人双面超净工作台(苏州净化设备有限公司)，ALLEGRAX-15R台式冷冻离心机(Beckman,美国)，MLS-3070高压灭菌锅(三洋，日本)，FE20K酸度计(mettlertoledo，瑞士)。
2.试验方法
2.1建立Caco-2细胞模型
2.1.1Caco-2细胞传代培养
从液氮中取出Caco-2细胞，立即放入37℃水浴。快速融化后，将Caco-2细胞转移至盛有5ml含胎牛血清DMEM培养液的离心管中，其中胎牛血清的体积分数为10％，混匀，在1000转的速度下离心5min，倒去上清液后，离心管加入5ml含胎牛血清DMEM培养液，其中胎牛血清的体积分数为20％，将Caco-2细胞悬浮液转移至25cm2细胞培养瓶中，置于37℃，含5％CO2的恒温培养箱中培养，隔天换液。当培养瓶内细胞汇合达到约80％左右时，倒去旧的培养液，加入含0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)溶液消化约2min后，倒掉消化液，加入6ml含胎牛血清DMEM，其中胎牛血清的体积分数为20％，轻轻将细胞吹落至瓶底并混匀，离心后，按1:2传代，进行传代培养。
2.1.2Caco-2细胞接种及培养
将Transwell插入式细胞培养皿放入六孔培养板中，取传代好的Caco-2的细胞，按密度为3×105的Caco-2细胞混合液1.5mL滴入Transwell插入式细胞培养皿的多孔膜上，同时，在基底侧加入2mL含胎牛血清的DMEM培养液，其中胎牛血清的体积分数为10％，将细胞置于37℃的含5％CO2的恒温培养箱中培养，连续培养21天，期间每天更换培养液。
2.1.3Caco-2细胞模型的验证
通过倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。生长21天时，各细胞间如铺路石镶嵌排列，互不重叠，为典型单层形态，见图6。用Millicell-ERS跨膜电阻仪隔天测定Caco-2细胞的跨膜电阻值，21天时，Caco-2细胞跨膜电阻值大于550Ω·cm2。
2.1.4Caco-2细胞模型建立
通过上述方法即获得跨膜电阻值大于550Ω·cm2的Caco-2细胞单层，即得载有Caco-2细胞的Transwell插入式细胞培养皿。
2.2建立QSG7701肝细胞模型
2.2.1QSG7701肝细胞传代培养
从液氮中取出QSG7701肝细胞，立即放入37℃水浴。快速融化后，将QSG7701肝细胞转移至盛有5ml含胎牛血清的DMEM培养液的离心管中，其中胎牛血清的体积分数为10％，混匀，在1000转的速度下离心5min，倒去上清液后，离心管加入5ml含胎牛血清DMEM培养液，其中胎牛血清的体积分数为20％，将QSG7701肝细胞悬浮液转移至25cm2细胞培养瓶中，置于37℃的含5％CO2的恒温培养箱中培养，隔天换液。当培养瓶内细胞汇合达到约80％左右时，倒去旧的培养液，加入含0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)溶液消化，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，约2min后，细胞间隙变大，细胞变圆，立即停止消化，倒掉消化液，加入6ml含胎牛血清DMEM，其中胎牛血清的体积分数为20％，轻轻将细胞吹落至瓶底并混匀，反复离心2次后，按1:3传代，进行传代培养。
2.2.2QSG7701肝细胞接种培养
将传代培养好的QSG7701细胞按1.5×105个/mL的细胞，每孔加入2ml细胞混合液的密度，接种于六孔培养板，并每天换液，培养3天。
2.2.3QSG7701肝细胞模型验证
培养3天后，将QSG770肝细胞悬液与0.4％的台盼蓝溶液1:1混匀，放入细胞计数器，并通过显微镜观察，立即用计算活细胞百分率，肝细胞存活率在93-97％，细胞板内QSG770肝细胞之间连接成片，形态完好。
2.2.4QSG7701肝细胞模型建立
通过上述方法即获得形态完好、存活率高的QSG7701肝细胞模型，即得载有QSG7701肝细胞的细胞培养板。
2.3建立联合评价模型
所述联合评价模型包括Caco-2细胞模型、QSG7701肝细胞模型以及由多孔底膜分隔成顶侧室和基底侧室的容器，Caco-2细胞培养在顶侧室中，QSG7701肝细胞培养在基底侧室中。
在本实施例中，将载有Caco-2细胞的Transwell插入式细胞培养皿悬空安装在培养有QSG7701肝细胞的培养板的培养孔中即可。Transwell插入式细胞培养皿的底部与培养孔中的QSG7701肝细胞有一段距离。
2.4稻米、蔬菜中砷对人体的生物有效性及毒性的评价试验
取稻米、小白菜样品5g，磨碎，加入pH1.5的胃蛋白酶，在37℃恒温水浴锅中消化2h，然后加入pH5.0的胰酶和胆汁消化液，37℃恒温水浴箱里消化2h；用固体NaHCO3调节消化液pH值为7.0；离心，收取上清液，上清液经0.22μm无菌滤膜过滤，获取无菌待测液。
将2mL无菌待测液加入联合评价模型的顶侧室Caco-2细胞层上，2mLHBSS液作为转运溶液加入基底侧室的QSG7701肝细胞上，转运溶液的液面要求淹没过Transwell插入式细胞培养皿的底部，放入37℃、5％CO2、相对湿度90％的培养箱中培养24h。
2.5检测指标的测定
2.5.1砷生物有效性的测定
收集Caco-2细胞、QSG7701肝细胞和转运溶液，样品加入5mL硝酸-双氧水(体积比为4:1)，放入微波消解仪，消解，消解液用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)技术检测砷含量，根据Caco-2细胞、QSG7701肝细胞和转运溶液砷含量之和评价待测食品中砷对人体的生物有效性。
砷的生物有效性(％)＝(Caco-2细胞砷含量+QSG7701肝细胞砷含量+转运溶液砷含量)÷食品中砷含量×100％。
2.5.2砷生物毒性的测定
收集QSG7701肝细胞一侧样品，采用倒置显微镜检测细胞的形态学，采用MTT试剂盒检测肝细胞活性，采用丙二醛试剂盒检测肝细胞丙二醛含量，根据检测结果评价待测定食品中砷对细胞的毒性。
3.实验结果
结果见图2，水稻中砷对人体有效性为11.2％，小白菜中砷对人体的有效性为6.4％。进入细胞模型基底侧的水稻和小白菜中的砷，对QSG7701肝细胞有影响，细胞呈现脱落，皱缩(图3.a)，并降低了QSG7701肝细胞的细胞活性，并增加了脂质过氧化反应标志物丙二醛的含量。

Claims (10)

1.一食品中砷对人体的生物有效性及毒性的联合评价模型，其特征在于，包括Caco-2细胞模型、QSG7701肝细胞模型以及由多孔膜分隔成顶侧室和基底侧室的容器，Caco-2细胞培养在顶侧室中，QSG7701肝细胞培养在基底侧室中。
2.如权利要求1所述联合评价模型，其特征在于，所述顶侧室为Transwell插入式细胞培养皿，基底侧室为细胞培养板，Transwell插入式细胞培养皿安装在细胞培养板的培养孔中。
3.如权利要求1所述联合评价模型，其特征在于，所述Caco-2细胞模型是细胞跨膜电阻值大于等于550Ω·cm2的细胞单层。
4.如权利要求1所述联合评价模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)Caco-2细胞培养
将Caco-2细胞培养在六孔板的Transwell插入式细胞培养皿；
(2)QSG7701肝细胞培养
将QSG7701肝细胞培养在另一块六孔培养板上；
(3)联合评价模型的建立；
将载有Caco-2细胞的Transwell插入式细胞培养皿置于培养QSG7701肝细胞的六孔板之上，即可。
5.如权利要求4所述联合评价模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：
a.取Caco-2细胞，复苏，将Caco-2细胞单独培养于25cm2培养瓶中，加入含胎牛血清的DMEM培养液中培养，其中胎牛血清的体积分数为10％，按1:2传代进行传代培养，
b.将Transwell插入式细胞培养皿放入六孔培养板中，取传代好的Caco-2的细胞，将1.5mL密度为3×105个/ml的Caco-2细胞液滴入Transwell插入式细胞培养皿中，同时，在基底侧室加入2mL含胎牛血清的DMEM培养液，其中胎牛血清的体积分数为10％，然后置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，连续培养21天，期间每天更换基底侧室中的培养液，得载有Caco-2细胞的Transwell插入式细胞培养皿。
6.如权利要求4所述联合评价模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：
a.取QSG7701细胞，复苏，将QSG7701肝细胞单独培养于25cm2培养瓶中，加入含胎牛血清的DMEM培养液，其中胎牛血清的体积分数为10％，按1:3传代培养，
b.取另一块六孔培养板，每孔加入2ml密度为1.5×105个/mL传代培养好的QSG7701细胞液，并每天换液，培养3～5天，得载有QSG7701肝细胞的细胞培养板。
7.一种利用如权利要求1所述联合评价模型评价食品中砷对人体的生物有效性及毒性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备无菌食品待测液；
(2)将无菌食品待测液加入到所述联合评价模型的顶侧室的Caco-2细胞层上，将HBSS溶液作为转运溶液加入到所述联合评价模型的基底侧室的QSG7701肝细胞上，再将所述联合评价模型放入培养箱中培养；
(3)评价指标
a.分别检测Caco-2细胞、QSG7701肝细胞和转运溶液中的砷含量，根据检测结果评价待测食品中砷对人体的生物有效性；
b.收集QSG7701肝细胞样品，采用倒置显微镜检测细胞的形态学，采用MTT试剂盒检测细胞活性，采用丙二醛试剂盒检测丙二醛含量，根据检测结果评价待测定食品中砷对细胞的毒性。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体为：
取待测食品，磨碎，加入pH1.5的胃蛋白酶，在37℃恒温水浴锅中消化2h；然后加入pH5.0的胰酶和胆汁消化液，在37℃恒温水浴锅中消化2h；用固体NaHCO3调节消化液pH值为7.0～7.2，离心，收取上清液，上清液经0.22μm无菌滤膜过滤，获取无菌食品待测液。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)，所述联合评价模型放入37℃、5％CO2、相对湿度90％的培养箱中培养24h。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)具体为：
a.分别收集Caco-2细胞、QSG7701肝细胞和转运溶液的样品，各个样品分别经过体积比为的4:1硝酸-双氧水消解，用电感耦合等离子体质谱技术分别检测各个样品的消解液中砷含量，并通过下式计算砷的生物有效性：
砷的生物有效性(％)＝(Caco-2细胞砷含量+QSG7701肝细胞砷含量+转运溶液砷含量)÷食品中砷含量×100％。
b.收集QSG7701肝细胞一侧样品，采用倒置显微镜检测QSG7701肝细胞的形态学，采用MTT试剂盒检测QSG7701肝细胞的活性，采用丙二醛试剂盒检测QSG7701肝细胞的丙二醛含量，根据检测结果评价待测定食品中砷对人体的毒性。
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