CN109722464B - 一种体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于仿生模拟消化技术领域，具体涉及一种在体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法。本发明所述体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法，采用柔性人食管、胃、十二指肠为特征的柔性反应器，在此反应器中尽可能重现真实情况下胃、十二指肠的生理结构、胃肠的运动特征、胃液、肠液的消化液流加过程，并基于此模拟所述微生物经过胃、肠环境后的活力变化、48小时内菌的再生长能力、24小时内新陈代谢酶活等性能，其结果能真实的综合反应微生物经过胃肠后的状态，为微生物对于人体的关系提供实验证据。

Description

一种体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法

技术领域

本发明属于仿生模拟消化技术领域，具体涉及一种在体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法，具体而言，本发明涉及微生物经过一种柔性人食管、胃、十二指肠后的活性的表征方法，用于微生物的仿生消化实验中，使微生物在体外实验更好模拟其在活体内的反应过程。

背景技术

人体对食物的消化吸收是一个非常复杂的过程，食物摄入后被转化成营养素供机体生长。在人体消化过程中，两个主要过程几乎同时发生：(1)食物在消化道机械转运过程中降低颗粒尺寸的大小；(2)食物中的大分子被水解为小分子后吸收入血。其中，食物粉碎过程主要发生在口腔和胃，而酶解以及营养素和水的吸收主要发生在小肠和大肠。目前对消化系统的研究成为了各领域(如营养学、毒理学、生理学及微生物学等)研究者研究过程中与各种问题相联系的焦点。

微生物通常指一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，它们个体微小(一般<0.1mm)、种类繁多、且分布广泛。在我们的人体中，微生物广泛分布在胃肠道、口腔、泌尿生殖道、皮肤、呼吸道等部位，尤其胃肠道中的菌株约占我们人体所有菌株的1/3。在成年人的体内，微生物从口腔进入消化道的过程依次需要通过口腔、咽、食管、胃、小肠(十二指肠、空肠、回肠)和大肠(盲肠、结肠、直肠)等约9米的肌性管道。已有研究表明，胃中的强酸、胃蛋白酶，以及十二指肠中的消化酶、胆盐的环境均对微生物的活力产生一定影响。因此，消化过程中人体对微生物菌群的消化影响对于进一步完善消化系统的研究具有重要的意义。

目前，研究微生物受胃、十二指肠环境的方法，主要有体外模拟和活体实验的两种方法。由于活体实验的对象选择严格受限，而且由于生物个体生理以及遗传背景的多样性等差异，导致很难评估某个单因素对微生物的影响，使其应用受到影响。

通过体外模拟实验研究微生物经过胃、肠消化的变化能较快速地解决某些热点的科学问题。当前常见的体外模拟方法多以刚性系统为主，刚性体外模拟消化系统多采用简单容器加消化液搅拌的方式来实现，其模拟过程简便可控。但是刚性反应器缺乏对消化系统生理机构以及运动模式的模拟，导致其与体内的真实情况可能相差较远。随之发展的半刚性系统模拟系统虽然一定程度上改善了上述缺陷，但是其模拟程度依然存在一定的差距。可见，现有体外模拟的方法对于模拟微生物在人体胃肠道系统中的消化过程及消化影响上存在诸多的问题。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法，以克服现有技术中微生物体外模拟消化的技术中，忽略胃肠生理形态、运动形式、消化环境对其菌体活性、以及新陈代谢酶活的影响的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法，包括如下步骤：

(1)取仿生胃、肠道灭菌，并保持仿生胃、肠道的形态，并将整个仿生消化系统进行无菌处理；

(2)取配制的微生物菌液注入仿生胃中，在模拟胃环境下，与仿生胃消化液混合并进行消化；

(3)将经仿生胃消化后的微生物菌液注入仿生肠道中，在模拟十二指肠环境下，与仿生肠消化液混合并消化，并收集最终的微生物消化液。

所述步骤(2)中，所述模拟胃环境的参数包括：保持胃部环境37℃，胃部运动的模拟蠕动参数为左侧15R/min、右侧15R/min，胃部挤压速度2mm/s、挤压位置30mm、幽门挤压速度2mm/s、挤压末端位置30mm、挤压张开位置15mm；若所述仿生胃消化液采用连续流加的形式，其流加速度为2mL/min。

所述仿生胃消化液配比包括：K⁺9.75mmol/L、Na⁺90.25mmol/L、Cl^-67.63mmol/L、H₂PO₄ ^-1.125mmol/L、CO₃ ^2-25.5mmol/L、Mg²⁺0.15mmol/L、NH₄ ⁺1.25mmol/L、Ca²⁺0.15mmol/L、胃蛋白酶2000U/mL、调pH为1.5。

所述仿生胃消化液与所述微生物菌液的体积比为1：1。

所述步骤(3)中，所述模拟肠道环境的参数包括：保持仿生肠道环境的温度为35-38℃，肠道运动的模拟蠕动参数为左侧15R/min、右侧15R/min。

所述仿生肠消化液配比包括：K⁺9.5mmol/L、Na⁺154.3mmol/L、Cl^-56.5mmol/L、H₂PO₄ ^-1mmol/L、HCO₃ ^-106.3mmol/L、Mg²⁺0.42mmol/L、Ca²⁺0.6mmol/L、胰液素100U/mL、胆盐10mM、调pH为7。

所述仿生肠消化液与所述微生物菌液的体积比为1：1。

所述步骤(1)中，所述仿生胃、肠道灭菌步骤为将所述仿生胃、肠道于121℃下高压灭菌处理15分钟后，用置于50℃烘箱烘干内部水分；所述仿生消化系统无菌处理步骤为将消化系统设备整体用75％的酒精消毒处理。

还包括分别取仿生胃和/或仿生肠道中的消化液，进行微生物消化过程中各种性能检测的步骤。

所述性能检测包括微生物活力、再生长能力、新陈代谢酶活性能。

所述消化后的消化液的新陈代谢酶活检测方法具体为：将消化后的样品进行4℃、8000g、离心10分钟后，去除上清，加入1ml缓冲液溶液进行重悬后，等比加入4mM的碘硝基氯化四氮唑(INT)溶液，并采用多功能酶标仪测量在590nm处的吸光度。

本发明还公开了所述的体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法在模拟微生物体内消化过程领域中的应用。

本发明所述体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法，采用柔性人食管、胃、十二指肠为特征的柔性反应器，在此反应器中尽可能重现真实情况下胃、十二指肠的生理结构、胃肠的运动特征、胃液、肠液的消化液流加过程，并基于此模拟所述微生物经过胃、肠环境后的活力变化、48小时内菌的再生长能力、24小时内新陈代谢酶活等性能，其结果能真实的综合反应微生物经过胃肠后的状态，为微生物对于人体的关系提供实验证据。

本发明所述体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法采用的胃/肠柔性仿生系统模拟微生物经过人体胃、肠道的环境比以往的体外刚性反应器，其生理形态更接近于真实人体，且胃、肠的运动模式更接近于真实人体，模拟微生物经过人体胃肠道的环境比以往的体外刚性反应器，消化液的流加速度更接近于真实人体环境。使得微生物菌液经过人体胃、肠道的环境下，并经综合测定微生物活性、新陈代谢酶活、再生长能力三种表征特征，提供不同时间段微生物状态的科学证据，具有重要的意义。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为本发明仿生人食管-胃-十二指肠-小肠硅胶模型示意图；

图2为本发明集成形态仿生、运动仿生、消化环境仿生为一体的仿生消化系统结构示意图；

图3是本发明所述仿生胃的形态仿生结构示意图；

图4是本发明所述仿生十二指肠形态仿生结构示意图；

图5为本发明所述仿生小肠形态仿生结构示意图；

图6小肠模具结构示意图；

图7是本发明平板法测定消化后的乳酸菌总数结果；

图8是测定消化过程中植物乳杆菌的新陈代谢酶活的变化曲线；

图中附图标记表示为：1-仿生食管、2-仿生胃、3-仿生十二指肠、4-仿生胃液流加管、5-仿生肠液流加管、6-仿生食管蠕动电机(左)、7-仿生食管蠕动电机(右)、8-仿生胃部蠕动电机(左)、9-仿生胃部蠕动电机(右)、10-仿生胃部垂直挤压固定板、11-仿生胃部垂直挤压支架、12-仿生十二指肠蠕动电机(左)、13-仿生十二指肠蠕动电机(右)、14-消化产物采集器、15-加热设备、16-密封防尘装置、17-控制设备、18-仿生胃部蠕动设定界面图、19-仿生十二指肠蠕动设定界面、20-报警装置、21-仿生胃液蠕动泵、22-仿生肠液蠕动泵、23-清洗液蠕动泵、24-仿生胃液、25-仿生肠液、26-清洗液、27-仿生小肠、28-绒毛、29-有机玻璃板、30-光滑小孔、31-环形褶皱、32-分泌管。

具体实施方式

本发明所述集成胃肠形态仿生、运动仿生、消化环境仿生的一体化的胃肠仿生系统是利用人仿生食管-胃-十二指肠-小肠硅胶模型按照人体位置和运动模式安装形成，所述人仿生食管-胃-十二指肠-小肠硅胶模型已在中国专利201710694021.1和201721013356.4中予以描述和记载。

如图1所示的仿生人食管-胃-十二指肠-小肠硅胶模型示意图，本发明提供了一种柔性人食管、胃、十二指肠和小肠一体化模型的制备方法，包括如下步骤：

【S1】扫描人的食管、胃、十二指肠和小肠的内部和外部结构，制得仿生食管1、仿生胃2、仿生十二指肠3和仿生小肠27。

采用三维扫描仪分别扫描人的食管、胃和十二指肠的内部和外部结构，通过三维建模软件将扫描到的图像建模并保存成STL格式的图片；将三维图像输入到3D打印机中，依次制得人的食管模具、胃模具和十二指肠模具。

食管模具的制备：

根据真实人的食管生理学数据，确定食管的平均外径为20mm，平均内径为15.6mm，并且有三个狭窄部位，其中第一狭窄部位位于食道的起端，即咽与食道的交接处；第二个狭窄部位在食道入口以下7cm处；第三个狭窄部位位于食管和胃的交界处。本发明根据食管的内径和外径尺寸，首先制作出一个平面的硅胶板的模具，该模具内槽长度为250mm，宽度为π*食管外直径＝62.8mm。所需硅胶量为250x62.8x2.2mm³＝345.4毫升。

胃模具制备方法：

如图3所示，使用三维扫描仪扫描真实胃的内部和外部结构，用三维建模软件进行三维重构，并保存成3D打印机识别的STL格式。用3D打印机逐层打印出来。其中胃模具有四部分组成，包括内模和外模，内模和外模分别有两部分拼装而成。

十二指肠模具的制备方法：

如图4所示，使用三维扫描仪扫描人的真实十二指肠的内部和外部结构，根据真实人的十二指肠数据，确定十二指肠的外径为70mm，内径为50mm，并且有环形褶皱31。

本发明根据十二指肠的内径和外径尺寸，首先制作出一个平面的硅胶板的模具，该模具的内槽长度为250mm，宽度为π*十二指肠外直径＝219.8mm。所需硅胶量为250x219.8x10mm³＝549.5毫升。

小肠模具的制备方法：

如图5-6所示，根据三维扫描仪所得到的真实人的小肠结构尺寸，在有机玻璃板29上打上具有一定间隔、直径和深度的光滑小孔30，制得小肠模具。

【S2】在模具上均匀涂抹脱模剂，将弹性液体材料浇注在模具上，待其固化后经脱模分别制得仿生食管1、仿生胃1、仿生十二指肠3和仿生小肠27，并经表面清洁后进行晾干处理。

制备硅橡胶液体：

计算出所制模具的内模和外模之间预留的空隙空间和待制造的仿生人食管、胃、十二指肠和小肠的体积，制备液体硅胶，并将液体硅胶和交联剂混合和消泡，得到未交联的液体硅胶，浇铸液体的体积与待制造的软弹性容器材料体积相等。当然本发明还可以采用其它弹性体材料。

其中硅胶材料的力学性能参数为：拉伸强度为40kgf/cm，断裂伸长率为300-600％，抗扯强度为20-30kgf/cm，线性收缩为≤0.5％。

其中食管模型和十二指肠模型的制备方法：根据三维扫描所获得的人的食管和十二指肠的内外径尺寸，通过3D打印机和硅胶材料分别制作出具有平面硅胶板结构的食管模具和十二指肠模具，其模具的长度分别为食管和十二指肠的长度，模具的宽度为食管和十二指肠的外径周长；将两硅胶板在沿其长度方向的两侧边上逐层涂抹粘结剂，固化后分别制得食管模型和十二指肠模型。

小肠模型的制备方法具体包括：在有机玻璃板29上成型具有一定间隔、直径和深度的光滑小孔30，制得小肠模具；在有机玻璃板29模具上涂抹脱模剂，将弹性液体材料浇注在小肠模具上，待其固化后脱模，并经表面清洁后进行晾干处理，制得内壁具有绒毛28的小肠初模型；将小肠初模型在沿其长度方向的两侧边上逐层涂抹粘结剂，固化后制得小肠模型。

胃模型的制备方法具体包括：3D打印机根据三维扫描所得人胃的内部和外部尺寸打印胃模具的内模和外模；向内模的外表面及外模的内表面分别涂抹脱模剂；在内模与外模所形成的间隙中浇注弹性液体材料，待其固化后经脱模后制得左右两部分胃模型，经表面清洁后进行晾干处理；将晾干后的两部分胃模型在沿其长度方向的两侧边上逐层涂抹粘结剂，固化后制得胃模型。

将硅橡胶按1：1的质量比进行混合，抽真空10分钟直到所有气泡全部消失。同时清洗各模具，并在各模具上均匀的涂上脱模剂，然后分别按所需量灌入各模具中，其中食管模具、十二指肠模具和小肠模具按所需量注入，胃模具直到灌满为止(约650ml)。将灌入硅橡胶的各模具放入低于40℃的烘箱中烘干3小时取出，将模具取出即得各模型。

【S3】如图1所示，在胃模型、十二指肠模型和小肠模型上分别打孔，在孔中插入并固定柔性管作为分泌管32。分泌管32优选为外径为2mm、内径为1mm、长度为300-400mm的硅胶管。

将制得的胃模型和十二指肠模型和小肠模型用打孔器打孔，将硅胶管插入孔中并用胶水粘结，硅胶管可以突出一部分，等粘好后贴着胃壁剪齐，同时确保硅胶管不被胶水堵塞，且插入端的端口处不超过胃模型、十二指肠模型和小肠模型的内表面。粘好后放置3小时，然后每一根硅胶管分别通入水溶性的红色液体染料，检查分泌管32的导通情况；然后将胃的分泌管32集成到一根较粗的管子上，每根管子事先用一定长度的实心电线堵住，防止胶水流入分泌管32中，等粘好后再拔除，并通入水溶性的红色液体染料，检查是否漏液和堵塞。

各模型在沿其长度方向的两侧边的连接处逐层涂抹硅胶粘结剂，每层硅胶粘结剂的固化时间为2.5-3.5小时，涂抹5-7层；将模具一端的出口封闭，从其另一端注入水溶性红色液体燃料检测模具是否漏液。

采用5mm的打孔器在胃模型的胃壁两个侧面各打12个孔，在十二指肠模型的大乳头位置及小肠模型上至少各打一个孔，分泌管32逐个固定于对应的孔里，其插入端的端口处不超过胃模型和十二指肠模型的内表面，且与所述胃模型和十二指肠模型的内部相连通。

【S4】使用胶黏剂将仿生人的食管模型、胃模型、十二指肠模型和小肠模型按结构顺序利用硅胶粘结起来，即得一体化模型，同时检查是否漏液。

本发明所述体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法在前期集成胃肠形态仿生、运动仿生、消化环境仿生的一体化的胃肠仿生系统的基础上，进一步保证系统无菌环境、模拟微生物经过仿生胃肠后的活性、再生长能力、新陈代谢酶活的变化。

本实施例以模拟含10⁸CFU/mL的90mL的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,LP)菌液的消化过程为例进行阐述。

如图2中所示结构，本发明所述无菌的仿生消化系统集形态仿生、运动仿生、消化环境仿生为一体。

所述形态仿生部分包括：仿生食管1、仿生胃2以及仿生十二指肠3，所述仿生食管1、仿生胃2以及仿生十二指肠3均由硅胶材料经3D打印制成，并具有模拟食管、胃部和十二指肠真实生理尺寸和内部结构，并将所述仿生食管1、仿生胃2以及仿生十二指肠3按照人体正常体位予以固定安装于密封防尘装置16内。

所述运动仿生部分包括：仿生食管蠕动电机(左)6、仿生食管蠕动电机(右)7、仿生胃部蠕动电机(左)8、仿生胃部蠕动电机(右)9、以及仿生十二指肠蠕动电机(左)12和仿生十二指肠蠕动电机(右)13，利用上述蠕动电机对所述仿生胃部垂直挤压固定板10和仿生胃部垂直挤压支架11对各仿生器官进行挤压，并通过控制设备17对整个仿生系统的实验时间、温度、倾斜角进行适应性设定，并分别通过仿生胃部蠕动设定界面图18、仿生十二指肠蠕动设定界面19对胃部蠕动挤压参数和仿生十二指肠蠕动参数进行设定并模拟运动。

所述消化环境部分包括：用于消化液注入的仿生胃液流加管4、仿生肠液流加管5，并利用仿生胃液蠕动泵21、仿生肠液蠕动泵22调节消化液的流加速度，同时将仿生胃消化液24、仿生肠消化液25保存在37℃恒温环境中。

另外，实验过程中的消化产物收集采用消化产物采集器14等进行收集、实验过程中如有操作失误，系统将启动报警装置20进行报警，发出响亮警示声音、并发出闪亮的灯光，提示终止操作。

如图2-5所示，将仿生消化器官和仿生消化系统进行无菌处理，即将所述仿生胃2、仿生十二指肠3于121℃高压灭菌处理15分钟后，置于50℃烘箱烘干内部水分，同时将整个消化系统设备整体用75％的酒精消毒，保证整个系统无菌环境。

对整个仿生消化系统精心37℃恒温控制，开启加热设备15后的15min内，保温箱内温度从室温(20℃)加热至人体体温(37℃)，并通过智能数显温控器及温度传感器对保温箱内的温度进行监控，在实验过程中能保持温控精度为37±1℃；同时将要用的微生物菌液提前5分钟放到数控恒温设备中保证消化37℃恒温。

配制仿生胃消化液，仿生胃消化液中各组分浓度为K⁺9.75mmol/L、Na⁺90.25mmol/L、Cl^-67.63mmol/L、H₂PO₄ ^-1.125mmol/L、CO₃ ^2-25.5mmol/L、Mg²⁺0.15mmol/L、NH₄ ⁺1.25mmol/L、Ca²⁺0.15mmol/L、胃蛋白酶2000U/mL、pH调为1.5。具体配制步骤包括：在每1升高压去离子水，分别称取37.3gKCl、68gKH₂PO₄、84gNaHCO₃、117gNaCl、30.5gMgCl₂(H₂O)₆、48g(NH₄)₂CO₃、44.1gCaCl₂(H₂O)₂，然后从配制好的溶液中分别称取17.25mlKCl溶液、2.25mlKH₂PO₄溶液、31.25ml NaHCO₃溶液、29.5mlNaCl溶液、1mlMgCl₂(H2O)₆溶液、1.25ml(NH4)₂CO₃溶液，定容成1000ml，即为胃液母液。随后用2M NaOH、6M HCL滴定使溶液pH为1.5，并加入胃蛋白酶2000U/mL，制成胃消化液。其中，90ml模拟胃液配方为：取90ml胃液母液加入0.495克胃蛋白酶，及45uLCaCl₂(H₂O)₂溶液混合，并在使用前均经0.22um真空过滤器过滤。

配制仿生肠消化液，仿生肠消化液中的各组分浓度为：K⁺9.5mmol/L、Na⁺154.3mmol/L、Cl^-56.5mmol/L、H₂PO₄ ^-1mmol/L、HCO₃ ^-106.3mmol/L、Mg2⁺0.42mmol/L、Ca²⁺0.6mmol/L、胰液素(胰液提取物)100U/mL、胆盐10mM、pH调为7。具体配制步骤包括：分别取17mlKCl溶液、2ml KH₂PO₄溶液、106.25ml NaHCO₃溶液、24mlNaCl溶液、2.75mlMgCl₂(H₂O)₆，溶液定容成1000ml，即为肠液母液。随后用2M NaOH、6M HCL滴定使溶液pH为7；并加入胰液素100U/ml、胆盐10mM制成肠消化液。其中，90ml模拟肠液配方为：取72ml肠液母液加入1.089g胆盐，及0.453g胰液素和18ml高压去离子水混合，并在使用前均经0.22um真空过滤器过滤。

如图3所示，LP经胃环境的模拟，将所述仿生胃消化液一次性加入仿生胃2中，按照所述微生物菌液和仿生胃消化液以1：1的体积比例混合，同时通过控制仿生胃部蠕动电机(左)8和仿生胃部蠕动电机(右)9的运动来调整胃部蠕动参数为左侧15R/min、右侧15R/min，同时控制胃部挤压速度2mm/s、挤压位置30mm、幽门挤压速度2mm/s、挤压末端位置30mm、挤压张开位置15mm；如果采用连续流加仿生胃消化液的形式，仿生胃消化液流加速度设为2mL/min。控制仿生胃部的消化时间为2小时，在此期间每隔30分钟取样检测活菌数、pH、24小时的新陈代谢酶活。

如图4所示，LP经十二指肠环境的模拟，将上述经仿生胃消化后的微生物菌液消化产物与仿生肠消化液以1：1的体积比例混合，根据食物性质调整肠部蠕动参数、肠液流加速度，通过控制哎仿生十二指肠蠕动电机(左)12和仿生十二指肠蠕动电机(右)13的运动控制十二指肠蠕动参数为左侧15R/min、右侧15R/min。在此期间每隔30分钟取约肠消化食糜样测其活菌数、pH、24小时的新陈代谢酶活。

消化过程中的LP活菌数检测，采用GB4789.35-2010食品微生物学检验乳酸菌检验方法，以5.2％的固体MRS中涂板法，取2-3个梯度，取100uL进行涂板，隔48小时后进行计数，结果见图7所示，每个肉眼可见的菌落计为1CFU，图中取100uL菌液经10⁴稀释，涂板48个小时后，植物乳杆菌的总数为每100uL有83CFU，所以推算原溶液中的菌液为83CFU/100uL*10⁴＝8.3*10⁶CFU/mL

消化后的LP的新陈代谢酶活检测，将消化后的样品进行4℃、8000g离心10分钟后，去除上清，加入1ml缓冲液溶液进行重悬后，等比加入4mM的碘硝基氯化四氮唑(INT)溶液。采用多功能酶标仪测量在590nm处的吸光度，计算时分别求得待测样品的OD590处吸光度平均值，空白孔的OD590处吸光度的平均值，则待测样品平均OD590吸光度-空白孔OD590吸光度值表示菌瞬时的代谢活力。以连续动力学检测1-24个小时，每隔1分钟检测次待测样品和空白孔中的OD590处吸光值的变化，得到植物乳杆菌新陈代谢酶活的变化曲线。如图8所示分别模拟了植物乳杆菌与蛋白胨溶液、水溶液以及白酒同时服用后，植物乳杆菌在2小时内的变化。图中可以看出，植物乳杆菌的活性排序为蛋白胨溶液>白开水>白酒，在30分钟的时候，蛋白胨溶液和水溶液中植物乳杆菌的活力达到最高为0.5-0.6，此后下降保持在0.4左右，而白酒溶液中植物乳杆菌的活力一直迅速从0.2下降为0。这与人体的真实实验中喝酒破坏肠道菌群、蛋白保护益生菌等结论一致，提示这种方法可以在体外表示某种物质对益生菌新陈代谢活力的影响。

消化实验完成后，利用清洗液蠕动泵23从仿生食管1中“喂”大量清洗液26(去离子水)，待仿生十二指肠3末端流出溶液中不含食糜，即清洗基本完成。清洗过程中通过调节“身体”的倾斜角度使体内溶液更易流出，清洗更彻底。实验结束后取下人胃模型进一步清洗，且关闭仪器。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取仿生胃、肠道灭菌，并保持仿生胃、肠道的形态，并将整个仿生消化系统进行无菌处理；

(2)取配制的微生物菌液注入仿生胃中，在模拟胃环境下，与仿生胃消化液混合并进行消化；

(3)将经仿生胃消化后的微生物菌液注入仿生肠道中，在模拟十二指肠环境下，与仿生肠消化液混合并消化，并收集最终的微生物消化液，

另外，该方法还包括分别取仿生胃和/或仿生肠道中的消化液，进行微生物消化过程中各种性能检测的步骤，

其中，所述步骤(2)中，所述模拟胃环境的参数包括：保持胃部环境37℃，胃部运动的模拟蠕动参数为左侧15R/min、右侧15R/min，胃部挤压速度2mm/s、挤压位置30mm、幽门挤压速度2mm/s、挤压末端位置30mm、挤压张开位置15mm；若所述仿生胃消化液采用连续流加的形式，其流加速度为2mL/min；

所述仿生胃消化液配比包括：K⁺ 9.75mmol/L、Na⁺ 90.25mmol/L、Cl^- 67.63mmol/L、H₂PO₄ ^- 1.125mmol/L、CO₃ ^2- 25.5mmol/L、Mg²⁺ 0.15mmol/L、NH₄ ⁺ 1.25mmol/L、Ca²⁺0.15mmol/L、胃蛋白酶2000U/mL、调pH为1.5；

所述步骤(3)中，所述模拟十二指肠环境的参数包括：保持仿生肠道环境的温度为37℃，肠道运动的模拟蠕动参数为左侧15R/min、右侧15R/min；

所述仿生肠消化液配比包括：K⁺ 9.5mmol/L、Na⁺ 154.3mmol/L、Cl^- 56.5mmol/L、H₂PO₄ ^-1mmol/L、HCO₃ ^- 106.3mmol/L、Mg²⁺ 0.42mmol/L、Ca²⁺ 0.6mmol/L、胰液素100U/mL、胆盐10mM、调pH为7；

所述体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法采用柔性人食管、胃、十二指肠和小肠一体化模型进行，该模型的制备方法包括如下步骤：

(S1)扫描人的食管、胃、十二指肠和小肠的内部和外部结构，制得仿生食管、仿生胃、仿生十二指肠和仿生小肠；

(S2)在模具上均匀涂抹脱模剂，将弹性液体材料浇注在模具上，待其固化后经脱模分别制得仿生食管、仿生胃、仿生十二指肠和仿生小肠；

(S3)在胃模型、十二指肠模型和小肠模型上分别打孔，在孔中插入并固定柔性管作为分泌管；

(S4)使用胶黏剂将仿生人的食管模型、胃模型、十二指肠模型和小肠模型按结构顺序利用硅胶粘结起来，即得一体化模型。

2.根据权利要求1所述的体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法，其特征在于，所述仿生胃消化液与所述微生物菌液的体积比为1：1。

3.根据权利要求1所述的体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法，其特征在于，所述仿生肠消化液与所述微生物菌液的体积比为1：1。

4.根据权利要求1所述的体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述仿生胃、肠道灭菌步骤为将所述仿生胃、肠道于121℃下高压灭菌处理15分钟后，置于50℃烘箱烘干内部水分；所述仿生消化系统无菌处理步骤为将消化系统设备整体用75％的酒精消毒处理。

5.根据权利要求1所述的体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法，其特征在于，(S2)中，将制得的仿生食管、仿生胃、仿生十二指肠和仿生小肠经表面清洁后进行晾干处理。

6.根据权利要求1所述的体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法，其特征在于，(S3)中，分泌管为外径为2mm、内径为1mm、长度为300-400mm的硅胶管。

7.根据权利要求1所述的体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法，其特征在于，(S4)中，得到一体化模型后检查其是否漏液。

8.权利要求1-4中任一项所述的体外模拟微生物受胃、十二指肠环境胁迫的方法在模拟微生物体内消化过程领域中的应用。

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