WO2001098461A1 - Micro-organismes actifs dans l'environnement digestif - Google Patents

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WO2001098461A1
WO2001098461A1 PCT/FR2001/001925 FR0101925W WO0198461A1 WO 2001098461 A1 WO2001098461 A1 WO 2001098461A1 FR 0101925 W FR0101925 W FR 0101925W WO 0198461 A1 WO0198461 A1 WO 0198461A1
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digestive
microorganisms
interest
yeasts
peptides
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PCT/FR2001/001925
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Michel Renaud
Sylvie Bonnin
Monique Alric
Stéphanie BLANQUET
Denis Pompon
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Universite D'auvergne
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A61K36/062—Ascomycota
    • A61K36/064—Saccharomycetales, e.g. baker's yeast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents

Definitions

  • the present invention relates to the development of genetically modified microorganisms, in particular genetically modified yeasts, which can survive in a digestive environment and effectively express one or more genes of interest there.
  • the dosage form and the mode of administration of these microorganisms are also proposed.
  • the invention relates to the use of artificial digestive systems simulating the gastrointestinal functions of man for the study, control and selection of the aforementioned microorganisms.
  • the invention also relates to direct applications of in situ bioconversion, in particular in the development of preventive or curative treatments for pathologies, in particular for diseases linked to the metabolism of xenobiotics.
  • xenobiotics substances known to be foreign to the “normal” metabolic pathways of the cell (drugs, pesticides, pollutants, food additives, “natural” molecules of plants, etc.). These compounds, which are often too hydrophobic to be eliminated directly by the kidneys or degraded by bile, accumulate in the body's lipids.
  • the enzymes of xenobiotic metabolism (or EMX) are responsible for facilitating their elimination by making them more hydrophilic.
  • - phase I enzymes (functionalization phase): making the xenobiotic more hydrophilic by the introduction of polar groups (most often by oxidation reactions).
  • polar groups most often by oxidation reactions.
  • cytochrome P450 monooxygenases hemoproteins with a characteristic maximum absorption around 450 nm, when they are reduced and linked to carbon monoxide (Omura, 1964, 1993).
  • P450s are mainly found at the level of the smooth endoplasmic reticulum membrane, mainly in the liver, but also in the lungs and intestine, organs which play a role in controlling the entry of many xenobiotics into the body. 'organization.
  • Each P450 is part of a multienzymatic complex where it is associated with two flavoprotein electron transport systems, NADPH-cytochrome P450 reductase and NADH-cytochrome b5 reductase.
  • P450s have original catalytic properties since, unlike the majority of enzymes, a given P450 can act on many substrates with very different structures and, conversely, the same substrate can be recognized by different P450s (Coon et al., 1992 ). Endogenous (species, strain %), physiological (age, sex %), but also exogenous factors can modulate the activity of P450s (Guengerich, 1993), acting at different levels: gene expression, protein stabilization, activity modulation.
  • - phase II enzymes conjuggation phase: making the metabolites from phase I even more hydrophilic (if they are not excreted directly), by conjugation with various endogenous molecules (glutathione, glucuronide ).
  • GST glutathione S-transferase
  • NAT N-acetyl transferase
  • QR quinone reductase
  • ADH aldehyde dehydrogenase
  • UGT uridine diphosphoglucuronosyl transferase
  • sulfotransferase epoxide hydrolase
  • O-acetylase O-acetylase
  • phase I enzymes can give rise to more reactive metabolites than the initial molecule, capable of binding to proteins (causing necrosis or autoimmune diseases), nucleic acids (responsible for mutagenesis or carcinogenesis) or lipids (peroxy dation lipid). This is particularly the case when phase II enzymes are absent or of too weak activity.
  • EMX activity is genetically determined and highly variable depending on the individual (genetic polymorphism).
  • the molecular analysis of the correlations existing between major genes involved in the detoxification and biotransformation processes, and pathologies is currently the subject of numerous research works. Indeed, anomalies in the detoxification and biotransformation processes of exogenous compounds have been clearly identified in patients suffering from so-called "multifactorial" diseases (diseases combining genetic predisposition and role of environmental factors), very widespread to date in the world , such as different cancers, various digestive pathologies, endometriosis, chronic bronchitis ...
  • the risk of lung cancer induced by polycyclic aromatic hydrocarbons is increased by approximately 40 times when the individual is deficient in GSTM1 (phenotype GSTM1 0/0) and has a P450 1 Al with strong enzymatic activity (Raunio et al., 1995).
  • the populations at greatest risk of developing colon cancer are those with the phenotype "rapid metabolizer" for NAT2 and P4501 A2 and who are exposed to high levels of amines. heterocyclic in their diet (Lang et al., 1994).
  • correlations have also been established. Women with a highly inducible form of P450 1A1 have an increased risk of developing breast cancer.
  • the risk of breast cancer is increased (x4) in postmenopausal women, smoking moderately (presence of aromatic amines) and having a slow phenotype for NAT2.
  • the risk group for bladder cancer is represented by individuals deficient in GSTM1 and NAT2 (Brockmoller et al., 1996).
  • a positive correlation has been established between endometriosis and women deficient in GSTM1, as well as with the slow metabolizing phenotype for NAT2 (Baranova et al., 1999).
  • Food is one of the main sources of xenobiotics involved in multifactorial diseases, hence the importance of ensuring the detoxification of these xenobiotics before they have negative effects on the target organs.
  • the present invention relates to the development of a "living drug", genetically modified microorganisms, and more particularly yeasts, expressing in the digestive environment one or more gene (s) of interest (s) making it possible to correct dysfunctions of xenobiotic metabolism, such as those mentioned above.
  • This or these genes of interest will be chosen after determining the correlations between genetic heritage and presence of pathology and after evaluation of the prevalence of this pathology.
  • the first consists in expressing in the digestive environment by said microorganisms a gene of interest coding for an enzyme allowing the in situ activation of pre-substance into active substance.
  • a "living medicament” making it possible to control the bioconversion of pre-substance into active substance is particularly advantageous in the case where the active substance has undesirable side effects and / or is toxic from a certain dose.
  • the second consists in producing in the digestive environment by these microorganisms an active peptide or polypeptide, in particular having antigenic properties.
  • the production of such peptides, in different points of the digestive tract, leads to the development of "live vaccines" making it possible to circumvent a certain number of difficulties encountered in the conventional methods of administration belonging to the state of the art, such degradation issues.
  • Fahl et al (WO 99/27953) constructed cVE.coli strains expressing mammalian enzymes (P450 1A1, NADPH-cytochrome P450 reductase and GST) whose genes were inserted into a plasmid.
  • P450 1A1, NADPH-cytochrome P450 reductase and GST mammalian enzymes
  • These model constructions are made with the aim of developing “chemoprotective bacterial strains”, in particular Lactobacilli, expressing mammalian enzymes involved in the detoxification of procarcinogens and administered in the digestive environment to supplement the detoxification system of the gastrointestinal cells.
  • Fahl et al. do not specify the survival time of genetically modified Lactobacilli in a digestive environment and whether they can effectively express a gene of interest there.
  • the survival time depends on the microorganisms in question and the digestive environment, but we can define in the context of the invention this parameter as being greater than 6 hours in the stomach-small intestine and 48 hours in the colon, i.e. the average duration of transit in these digestive compartments in humans.
  • yeasts are organisms present in animal and / or human food and well-known hosts of the digestive environment. Some of them are GRAS or "generally recognized as safe” orgams and have been used for a few years as probiotics.
  • S cerevisiae is the best known and most commercially exploited.
  • S cerevisiae and S boulardii are also used in the pharmaceutical industry as medicines (carbolevure® and ultralevure® respectively), mainly intended for the treatment of disorders secondary to antibiotic therapy such as diarrhea, colitis or candidiasis (Ligny G, 1975).
  • Numerous studies carried out in animals and humans emphasize both the safety and the positive impact of these yeasts on the digestive environment (antagonism towards Candidas for example).
  • yeasts for the purposes of living drugs has considerable advantages:
  • yeasts are eukaryotic organisms. Genomic integration of heterologous fragments is easily achievable
  • yeasts have a subcellular organization very similar to that of higher eukaryotes and have intracellular transport mechanisms and post-translational processing essential for the functional and compartmentalized expression of many heterologous genes.
  • Yeasts also have a lipid membrane environment allowing the stability of P450 and electron transfer proteins (NADPH- cytochrome P450 reductase and cytochrome b5) in the membrane of the endoplasmic reticulum, necessary for the enzymatic activity of P450.
  • yeasts such as S cerevisiae have the capacity to live aerobically and anaerobically, which makes it possible to envisage the use of such yeasts at any level of the digestive tract.
  • yeasts are selected by auxotrophy and not on the basis of resistance to an antibiotic, which avoids being confronted with problems associated with the administration to humans of genetically modified organisms having an antibiotic resistance gene.
  • genomic insertion of the gene of interest is facilitated by the recombination property of certain yeasts, including S cerevisiae (Bellamine, 1996).
  • phase I genes from human P450 cytochromes
  • phase II genes from enzyme genes "phase environment” I "(NADPH-cytochrome P450 reductase and cytochrome b5 for example)
  • phase II genes from human P450 cytochromes
  • phase I genes from human P450 cytochromes
  • phase II enzyme genes "phase environment” I "(NADPH-cytochrome P450 reductase and cytochrome b5 for example)
  • phase II genes genes from human P450 cytochromes
  • phase II genes from human P450 cytochromes
  • strains of S. cerevisiae were used as study models. On the one hand, they express the human P450 1A1 and the yeast or human NADPH-cytochrome P450 reductase (respectively strains W (R) pHlAl and W (hR) pHlAl), on the other hand the plant P450 73A1 and the NADPH- cytochrome P450 yeast reductase (strain W (R) pP73Al).
  • P450 1A1 exists in the majority of animal species, including humans.
  • the human form has been isolated by Jaiswal et al. (1985). It is involved in the metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons, in particular that of benzo (a) pyrene, a compound present in particular in cigarette smoke and barbecue products (Sims et al., 1974; Gautier et al., 1996a). It is difficult to detect in the liver without the action of an inducer but exists in many extrahepatic tissues in the constitutive state. It is highly inducible by polycyclic aromatic compounds such as 3-methylcholanthrene (3-MC), by halogenated aromatic compounds such as 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-j? -Dioxin (TCDD) or by flavonoids like ⁇ -naphthoflavone.
  • P450 73A1 (cinnamate 4-hydroxylase activity or CA4H) catalyzes the first stage of the phenylpropanoid pathway in higher plants by transforming trans-cinnamic acid into p-coumaric acid. This path constitutes the beginning of the synthesis flavonoids (antioxidants).
  • the method of assessing the fate of medicinal microorganisms in the human digestive environment is also an object of the present invention.
  • one of the main problems encountered in the development of a "living" drug lies in its selection, in the evaluation of its survival, its activity and its control, within an environment. digestive.
  • the present invention proposes the use of artificial digestive systems reproducing as reliably and as dynamically as possible the human digestive environment.
  • these systems allow the control of the main parameters of digestion and ensure the reproducibility of experimental conditions, factors that cannot or very difficult to control in laboratory animals.
  • these systems make it possible to take samples at any level of the digestive tract and to get rid of all the ethical constraints linked to animal or human experiments (potentially toxic molecules).
  • Such systems also give the possibility of assessing the impact of genetically modified microorganisms on the endogenous human flora (implanted in the artificial digestive system).
  • artificial digestive systems make it possible to carry out a selection of genetically modified microorganisms, in particular genetically modified yeasts, which have not only adapted to the digestive environment but which retain a good capacity for expressing a heterologous gene of interest.
  • Any artificial digestive system incorporating the essential characteristics of the human digestive system can be used in the context of the invention.
  • Various in vitro systems very simple (individual digestive compartments) have been described. Their use is however limited by the fragmentation of the digestive compartments and the absence of dynamism. It is therefore advantageous to use the complete artificial digestive system described in WO 94/09895.
  • Another advantage of the present invention comes from the specific formulation of the living medicament so as to protect the microorganisms and to specifically target an action in such or such part of the digestive system.
  • microorganisms and more particularly yeasts, must be active in the gastrointestinal tract, the route of administration is the oral or rectal route.
  • the recombinant microorganisms must be administered in a galenical form which makes it possible both to transport them to their place of action, to maintain them in an active state and to protect them from the external environment.
  • the devices or galenical processes used to achieve these objectives are different according to the sensitivity of microorganisms to the digestive environment and according to the places where they will have to carry out their activity (level of the gastrointestinal tract).
  • the lyophilization of the microorganisms and their nutritive medium there may be mentioned: the encapsulation of the microorganisms or the coating of the galenic system containing them using polymers sensitive to pH or having muco-adhesive properties, the mixture with polymers having muco-adhesive properties, the compression of microorganisms in the presence of excipients having muco-adhesive properties, their incorporation in hydrophilic or lipophilic gels.
  • the resulting galenic systems are monolithic forms of monolayer or multilayer tablet type, gelatin capsule type (hard or soft) or multiparticulate forms of microgranule or microcapsule type. These forms allow normal or delayed release of microorganisms within the digestive tract. DESCRIPTION
  • the present invention relates to microorganisms comprising at least one heterologous DNA fragment comprising one or more genes of interest capable of being expressed in the digestive environment.
  • said microorganisms are also characterized in that they can survive in the digestive environment for at least 6 hours, 10 hours or 12 hours in the stomach and small intestine and / or at least 12 hours, 24 hours, 60 hours or 72 hours. in the colon.
  • microorganisms are obtained whose survival rate is greater than 25%, 50%, 75%, 80%, preferably 90% or 95% at the outlet of the ileum after 6 h of digestion and is greater than 2%, 4%, preferably 8% after 12 h of fermentation in the colon. These measurements can be easily carried out by counting from samples easily taken in the artificial digestive systems, at any time during digestion or fermentation.
  • the microorganisms mentioned above are capable of carrying out either a bioconversion reaction, or the secretion of a peptide of interest or of a protein in all the digestive compartments.
  • yeasts are chosen, preferably yeasts selected from Saccharomyces cerevisiae, S boulardii, S uvarum, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis and Yarrowia lipolitica.
  • yeasts selected from Saccharomyces cerevisiae, S boulardii, S uvarum, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis and Yarrowia lipolitica.
  • bacteria such as lactobacillus described in Fahl et al (WO 99/27953).
  • genes of interest is intended to mean genes coding for peptides of vaccine interest, peptides of hormonal interest (such as insulin), peptides of therapeutic interest. (such as anti-proteases, coagulation factors), antibiotic effect peptides, peptides capable of trapping or complexing molecules, enzymes or any peptide having bioconversion activities, in particular detoxification enzymes or secreted in the digestive environment.
  • polypeptides, peptides or proteins may be used interchangeably from one another and in no case constitute a limitation to a given size.
  • phase I enzymes P450 1A1, 1A2, 1B1, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, 3A5 and 73A1
  • phase I environmental enzymes NADPH-cytochrome P450 reductase and cytochrome b5
  • phase II enzymes such as glutathione S-transferase (GST), N-acetyl transferase (NAT), quinone reductase (QR), aldehyde dehydrogenase (ALDH), uridine diphosphoglucuronosyl transferase (UGT), sulfotransferase, epoxide hydrolase and O-acetylase and phase III enzymes (ABC transport pumps, especially multidrug resistant pumps MDR).
  • phase I enzymes P450 1A1, 1A2, 1B1, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, 3A5 and
  • Glutathione S-transferase is a superfamily of genes made up of 4 main classes: alpha (GSTZ), mu (GSTM), pi (GSTP) and teta (GSTT). These enzymes play an essential role in cell resistance against lipid peroxidation, DNA damage and protein alkylation caused by electrophilic chemical species. They catalyze the binding of many electrophilic xenobiotics to glutathione and are involved in the detoxification of oxygen radicals.
  • the various classes of GST are present in large quantities in many tissues, with a certain specificity of tissues depending on the class considered.
  • GSTM1A and GSTM1B alleles code for enzymes of similar activity while the GSTMIO allele codes for a non-functional enzyme.
  • GSTMIO allele codes for a non-functional enzyme.
  • individuals of the GSTM 10/0 genotype are considered to be at risk when exposed to high levels of carcinogens and toxic chemicals.
  • GSTM1 deficiency is associated with an increased risk of cancer (mainly lung and bladder cancer) and certain chronic diseases (endometriosis, chronic bronchitis ).
  • NAT1 and NAT2 Two N-acetyltransferases (NAT1 and NAT2) have been identified, catalyzing N-acetylation reactions of arylamines, as well as other detoxification reactions. They are also involved in the metabolism of drugs such as sulphonamides and in drug interactions. The variations existing in the activity of NAT correspond to their capacity to transfer acetate from acetyl coenzyme A to the substrate. Only the NAT2 gene has a polymorphism allowing the differentiation between slow acetylator (SA) and rapid acetylator (RA). Available studies suggest that slow acetylation is more of a risk factor than rapid acetylation. In fact, the SA phenotype is considered a risk factor for bladder cancer. In addition, postmenopausal women with the SA phenotype are 4 times more likely to develop breast cancer than women with the RA phenotype.
  • SA slow acetylator
  • RA rapid acetylator
  • yeasts are the isoenzymes 1A1, 1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, 3A5, 19A.
  • phase I gene coexpressions have been developed, of “phase I environment” (NADPH-cytochrome P450 reductase and cytochrome b5 for example) and of phase IL The effectiveness of these constructions has been demonstrated.
  • phase I environment NADPH-cytochrome P450 reductase and cytochrome b5 for example
  • phase IL phase IL
  • yeast S cerevisiae analysis of the incubation products of benzo (a) pyrene with these recombinant yeasts shows the formation of all of the metabolites expected (Gautier et al., 1996b).
  • Such systems can be used as a model for the study of certain aspects of human metabolism, as an aid in the analysis of the toxicity of pollutants and above all as a bioconversion tool.
  • promoters can be used, strong promoters, promoters specifically active in a segment of the digestive tract in aerobic, semi anaerobic or anaerobic conditions, promoters regulable by a molecule introduced into the intestinal medium.
  • the heterologous DNA fragment may also have a genetic marker allowing selection or counter-selection or a genetic bar code. Study and selection of recombinant microorganisms using artificial digestive systems
  • the invention relates to a method for studying, controlling, adapting and / or selecting the recombinant microorganisms described above by means of an artificial digestive system.
  • artificial digestive system any device incorporating the essential characteristics of the human digestive system.
  • the artificial digestion system can be defined as a reaction device described in WO 94/09895.
  • This system is the most complete model in the world today. Indeed, it has all the compartments of the digestive system (stomach, duodenum, jejunum, ileum and colon, Figures 1 and 2 below) and reproduces as closely as possible the digestive environment of man or the monogastric animal. It takes into account the essential parameters of digestion such as peristaltic movements, variations in pH at the gastric and intestinal level, gastric emptying and intestinal transit time, gastric, biliary and pancreatic secretions, absorption of digestion and fermentation, water absorption, faecal microflora (Minekus et al., 1995 and 1999). A computerized control of the system allows continuous control of the parameters. This system makes it possible to mimic different situations, both physiological and pathological.
  • each compartment is made up of glass units containing flexible internal walls. A passage of water between the flexible walls and those of glass allows maintain a constant temperature of 37 ° C and mimic peristaltic movements (thanks to variations in water pressure).
  • the different compartments are connected to each other by peristaltic valves, the opening of which is controlled by computer (sending or not sending nitrogen).
  • the passage of chyme from one compartment to another is controlled by the amount of food present in each compartment (presence of level sensors).
  • the volume of the digestive contents is continuously recorded by a pressure sensor and kept constant by absorption of water through dialysis fibers thanks to a pump.
  • the stomach (TIM1)
  • Pepsin is delivered continuously by a pump.
  • the pH is continuously readjusted with HCl or water, so as to follow a predetermined curve, established according to in vivo data.
  • TIM1 Small intestine
  • the artificial small intestine is programmed to simulate a transit time as close as possible to that observed in vivo.
  • the pH is maintained at the most physiological values possible with NaHCO 3 (6.5 at the level of the duodenum, 6.8 at the level of the jejumum and 7.2 at the level of the ileum).
  • pumps provide the pancreatic enzymes (mixture of pre-enzymes which will be activated by trypsin) and bile acids.
  • the absorption of water and digestion products is carried out thanks to a dialysis system operating with hollow fiber units, connected at the level of the jejunum and the ileum.
  • the colon (TIM2)
  • the artificial colon consists of a loop in which cyclic faeces previously installed circulate. It has been verified that the composition and the fermentative activity of this faecal microflora, resulting from stools of voluntary donors and implanted in the digestive system, were well representative of those of the human colonic flora and that this flora was kept stable and functional at over time (Minekus et al., 1999).
  • a flow of nitrogen keeps the system anaerobic, a condition controlled by an indicator (resazurin solution).
  • the nutritional medium is stored in a glass unit maintained at 4 ° C. where an influx of nitrogen allows its permanent mixing anaerobically.
  • a set of dialysis fibers crossing the entire colon helps mimic the absorption of water and nutrients.
  • the pH is kept constant and adjusted to the value of 6.5 with a solution of NaOH (instead of bicarbonate in vivo).
  • Total gas production (such as H 2 , CO 2 and CH) can be determined by measuring the amount of water displaced in a bottle of Mariotte.
  • the different gases, as well as the volatile fatty acids produced (acetate, butyrate and propionate mainly), can be analyzed qualitatively and quantitatively by gas chromatography.
  • the artificial colon is made up of three subunits simulating the three parts, proximal, transverse and distal where sit different fermentation activities (associated with different pH).
  • the invention relates to a method of studying and controlling microorganisms comprising the steps consisting in: a) adding the microorganisms according to the invention to a liquid nutritive medium, b) introducing said medium to the entry of a system as defined above, c) incubate and carry out a count of the recombinant microorganisms and / or a test of the activity of the gene or genes of interest after passage through the digestive systems or in situ.
  • this step may include a PCR test.
  • the test activity may include a secretion and or bioconversion test.
  • the method can comprise the steps consisting in: a) adding the microorganisms according to the invention to a liquid nutritive medium, b) introducing said medium at the inlet of a system as defined above above, c) incubate and recover the surviving microorganisms after passage through TIM1 and / or TIM2; - optionally repeat steps a) to c) until a homogeneous population of microorganisms adapted to the digestive environment and capable of efficiently expressing the gene or genes of interest is obtained.
  • the invention also relates to microorganisms capable of being obtained by the process mentioned above.
  • These microorganisms can be characterized in that their survival rate is greater than 25%, 50%, 75%, 80%, preferably 90% or 95% at the outlet of the ileum after 6 h of digestion and is greater at 2%, 4%, preferably 8% after 12 h of fermentation in the colon.
  • these are yeasts.
  • the survival of microorganisms can be assessed by counting.
  • the presence of the gene (s) of interest can be demonstrated by molecular techniques (for example Polymerase Chain Reaction).
  • the expression of the gene (s) of interest can be estimated by biochemical techniques such as mono or two-dimensional electrophoresis or Western Blot.
  • the activity of the expression products of the gene or genes of interest is assessed by specific techniques (for example assay of enzymatic activity).
  • the invention relates to microorganisms capable of carrying out a bioconversion reaction or of secreting a peptide or a protein of interest in all the digestive compartments.
  • the oral route constitutes one of the preferred delivery routes, by its convenient administration and its low cost.
  • the active ingredients thus administered can be absorbed throughout the gastrointestinal tract. They will eventually undergo different biodegradations at this level under the action of enzymes, digestive juices and pH variations. The fraction absorbed from the digestive tract can reach the site of action after passage through the liver and possible metabolism.
  • microorganisms In contrast, in the case of microorganisms, these will not be absorbed by the intestinal mucosa but will remain in the tract for a longer or shorter time in order to exert their action at the level of the defined target.
  • the dosage form containing the microorganisms is a form which makes it possible to bring them intact at the target level and to maintain their integrity at this level for a defined time of varying length. Under these conditions, the techniques used with conventional active ingredients to ensure sustained release apply to microorganisms after adaptation of the technology and operating parameters.
  • the coating makes it possible by direct deposition of a protective agent (resin, polymer) to protect the active principle.
  • a protective agent resin, polymer
  • the purpose of the coating is to isolate them from the hostile external environment in order to protect them from attack by enzymes, the pH and the juices present at the digestive level.
  • the result of the coating is the obtaining of a "sphere" or microsphere, the diameter of which is directly proportional to the quantity of coating product used and to the size of the product to be coated at the origin.
  • the operating parameters, the technical equipment and the adjuvants used to carry out this coating are important factors for obtaining microspheres having defined characteristics.
  • the coating is either a polymer sensitive to pH and dissolving at a given pH of the gastrointestinal tract, or a polymer including the nutrients necessary for the survival of microorganisms, or a mucoadhesive product facilitating the mucoadhesion of microorganisms to level of the gastrointestinal tract, a combination of these different compounds.
  • the result obtained consists of microspheres which are then packaged in hard or soft capsules.
  • another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the microorganisms defined above advantageously being in a galenical form suitable for oral or rectal administration so as to deliver them intact at the target site of the tract digestive and maintain their integrity at this level for a given time.
  • the microorganisms in particular the yeasts, can be protected by an associated composition or covered by a coating and / or a membrane of the resin type and / or of the polymer type forming spheres, microspheres, granules or microgranules.
  • the composition is in the form of capsules, tablets or dragees.
  • the composition can also be in the form of a cell suspension.
  • the invention also relates to a combination product comprising the microorganisms described above and an active substance or a precursor of an active substance for simultaneous, separate or spread over time use.
  • This product is preferably characterized in that the said microorganisms interact with the active substance or the precursor.
  • the active substance is intended to promote the action of recombinant microorganisms (for example, it may be a substance promoting the survival, growth or activity of microorganisms) or, conversely, micro -organisms act on the active substance or on the precursor.
  • Another aspect of the invention relates to the use of microorganisms according to the invention for the preparation of a medicament such as detoxification agents, metabolic correction agents, agents capable of modifying the intestinal flora, agents capable of increasing the bioavailability of an active substance or of its precursor and for the preparation of a medicament capable of providing in situ active peptides, peptides of vaccine interest, peptides of hormonal interest, peptides of interest therapeutic, antibiotic effect peptides or peptides capable of trapping or complexing molecules.
  • a medicament such as detoxification agents, metabolic correction agents, agents capable of modifying the intestinal flora, agents capable of increasing the bioavailability of an active substance or of its precursor and for the preparation of a medicament capable of providing in situ active peptides, peptides of vaccine interest, peptides of hormonal interest, peptides of interest therapeutic, antibiotic effect peptides or peptides capable of trapping or complexing molecules.
  • Figures 1 and 2 schematic representations of artificial digestive systems.
  • FIG. 3 genomic and plasmid constructs for the expression of the gene for human P450 1A1 and of human NADPH-cytochrome P450 reductase (A) or of yeast (B) and for the expression of the gene for P450 73 A1 of Jerusalem artichoke and yeast NADPH-cytochrome P450 reductase (C).
  • A- The strain obtained is called W (hR) pHl Al.
  • B- The strain obtained is called W (R) pHlAl.
  • C- The strain obtained is called W (R) pP73Al.
  • URA 3 wild gene for orotate decarboxylase
  • ADE 2 wild gene for the aminoimidazole ribonucleotide carboxylase
  • ura 3 mutated orotate decarboxylase gene
  • Y red yeast P450 reductase
  • H red human P450 reductase
  • PGK phosphoglycerate kinase
  • Y red ORF yeast P450 reductase coding sequence
  • H red ORF coding sequence for human P450 reductase
  • H 1A1 ORF coding sequence for human P450 1A1
  • P 73A1 ORF coding sequence for Jerusalem artichoke P450 73 A1
  • pro promoter
  • ter terminator.
  • FIG. 4 release kinetics of the recombinant yeasts W (hR) pHlAl and W (R) pHlAl at the outlet of the ileum.
  • the dilution factor due to the volume of digestive secretions is taken into account in the calculations.
  • FIG. 5 Monitoring of recombinant yeasts W (hR) pHlAl and W (R) pHlAl in the artificial colon. Different samples were taken in order to be able to monitor yeasts in TIM 2:
  • Figure 6 PCR results performed on strains W (R) pHlAl and W (hR) pHlAl before passage through the digestive systems (A), at the exit of the small intestine (B) and colon (C)
  • the number of yeasts present in each sample is expressed as a percentage of the total number of yeasts ingested.
  • the monitoring curves of the recombinant yeasts in each compartment were compared with those of a nonabsorbable transit marker.
  • Figure 8 kinetics of release of the recombinant yeasts W (R) pP73Al at the outlet of the ileum
  • the production of p-coumaric acid j is expressed as% of trans-cinnamic acid into the stomach.
  • Figure 11 Constructs of plasmids allowing secretion by S. cerevisiae yeasts, either of a "tagged" peptide (A), or of a "tagged” protein (B)
  • PGAL1 promoter highly inducible by galactose
  • CYCl TT terminator of the CYCl gene
  • pUC ori origin of pUC replication allowing maintenance and replication of the plasmid in bacteria
  • 2 ⁇ origin origin of replication 2 ⁇ allowing maintenance and replication of the plasmid in yeast
  • Ampicillin gene for resistance to ampicillin serving as a selection marker in the bacteria
  • URA 3 auxotrophy marker allowing the selection of transformed yeasts
  • BamHI cleavage site of the restriction enzyme BamHI
  • EcoRl shutdown site restriction enzyme EcoRl
  • Pre pre sequence, allowing the targeting of the ⁇ peptide to the endoplasmic reticulum
  • Pro pro sequence allowing efficient secretion of the ⁇ peptide
  • KR Kex2 protease cleavage site (amino acids lysine-arginine); GST: Glutathione-S-transferase
  • V 5 V 5 epitope
  • H 6 polypeptide
  • the Western-Blots obtained with the WppN 5 H 6 and WpGSTN 5 H 6 strains are represented in FIG. 12A and 12B respectively.
  • Samples were taken from the growth culture and from the induction culture, 0, 2, 4 and 6 hours after addition of galactose. The samples are noted “expo” when the induction culture has been seeded at low cell density and "stat" when it has been seeded at high density.
  • the supernatant proteins are precipitated, separated by polyacrylamide gel electrophoresis and analyzed by Western-Blot (anti-V 5 antibody). For each sample, the proteins of the supernatant corresponding to a culture volume containing 5 * 10 yeasts are deposited (except sample B6 which corresponds to 4 * 10 cells).
  • A1 peptide-V 5 H 6 , growth culture control; A2: peptide-V 5 H 6 , tO induction culture; A3: peptide-N 5 H 6 , expo t2h; A4: peptide-N 5 H 6 , stat t2h; A5: peptide-V 5 H 6 , expo t4h; A6: peptide-V 5 H 6 , stat t4h; A7: peptide-V 5 H 6 , expo t6h; A8: peptide- V 5 H 6 , stat t6h.
  • B1 GST-N 5 H 6 , growth culture control; B2: GST-N 5 H 6 , tO induction culture; B3: GST-V 5 H 6 , expo t2h; B4: GST-V 5 H 6 , stat t2h; B5: GST-V 5 H 6 , exhibition t4h; B6: GST-V 5 H 6 , stat t4h (4 * 10 8 cells); B7: GSTN 5 H 6 , stat t4h (5 * 10 7 cells); B8: GST-N 5 H 6 , exhibition t6h; B9: GST-V 5 H 6 , stat t6h.
  • FIG. 13 represents the Western-Blots obtained after analysis of the samples taken from the different compartments of TIM 1.
  • a positive control was also carried out in Erlen-Meyer (samples noted as "control"). All the proteins contained in the supernatant of the samples were deposited (corresponding to a volume of 4 ml in the stomach and the duodenum and 2 ml in the food, the jejunum and the ileum).
  • Figure 14 Detection, in the various TIM1 compartments, of the "tagged" GST protein secreted by the WppGSTV 5 H 6 strain
  • FIG. 14 represents the Western-Blots obtained after analysis of the samples taken from the different compartments of TIM 1.
  • a positive control was also carried out in Erlen-Meyer (samples noted as "control"). All the proteins contained in the supernatant of the samples were deposited (corresponding to a volume of 4 ml in the stomach and the duodenum and 2 ml in the food, the jejunum and the ileum).
  • Figure 15 Quantification of "tagged" GST secreted in TIM 1 by the WppGSTV s H 6 strain In order to approximate the amount of GST secreted in the digestive environment, we compared the intensity of detection of a standard range with that of samples from TIM 1. 20 ng, 10 ng and 1 ng of 85% pure GST were thus deposited on the same gel as the proteins of samples from samples in TIM 1.
  • Example 1 The yeast Saccharomyces cerevisiae as an expression system for human P450s.
  • S. cerevisiae was the first system used for the expression of a rat P450 (Oeda et al., 1985). Since then, it has been widely used as a heterologous expression system in many laboratories. In particular, the team of Dr Denis Pompon chose it as a study model for the expression of human P450 (isoenzymes 1A1, 1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, 3A5, 19A).
  • yeasts as a host for heterologous expression of P450 has many advantages. Indeed, yeasts have the criteria necessary for the synthesis of functional human P450 (Urban et al., 1994a; Pompon et al., 1997). They present the intracellular architecture and the majority of post-translational modifications of eukaryotic cells, as well as a protein addressing system ("Signal Particle Recognition" or SRP) allowing the translocation of the synthesized P450 to the endoplasmic reticulum, which results in correct intracellular localization and folding of the P450.
  • SRP Protein addressing system
  • Yeasts also have a lipid membrane environment allowing the stability of P450 and electron transfer proteins (NADPH- cytochrome P450 reductase and cytochrome b5) in the membrane of the endoplasmic reticulum, necessary for the enzymatic activity of P450.
  • the introduction into yeasts of expression cassettes can be carried out in two ways: on a plasmid or by genomic integration.
  • yeasts allow the stable coexpression of several DNAs complementary (cDNA) and the techniques used are low cost and risk-free.
  • the yeast S. cerevisiae allows the characterization of human monooxygenase activities (Urban et al., 1994a; Gautier, 1994), namely:
  • yeasts as a heterologous expression system (Urban et al., 1994a; Pompon et al., 1996) has some limits:
  • yeast and human NADPH-cytochrome P450 reductase enzymes have a low sequence similarity (33%), which reduces the coupling efficiency between human P450 and yeast NADPH-cytochrome P450 reductase, - production of human P450 (between 50 and 500 pmol of P450 per mg of microsomal proteins) is lower than in E coli bacteria (of the order of nmol / mg) but this drawback is largely compensated for by the fact that, unlike the bacterium , yeasts produce functional P450s.
  • An expression cassette inserted into a plasmid, allows the production of a human P450.
  • the 5 ′ and 3 ′ non-coding sequences of the cDNA were deleted before insertion into the yeasts.
  • the strong promoter GAL10-CYC1 completely repressed by glucose but highly inducible by galactose was introduced in order to separate the exponential growth phase, required to constitute the biomass, from the expression phase.
  • Second generation systems optimization of the specific activity of human P450.
  • yeast NADPH-cytochrome P450 reductase brought under the control of the promoter GAL10-CYC1
  • phase II enzymes such as epoxide hydrolase
  • human P450 has also made it possible to simulate metabolic couplings between phase I and phase II enzymes (Gautier et al, 1993).
  • Example 2 Obtaining the recombinant yeast strains W (hR) pHlAl, W (R) pHlAl and W (R) pP73Al
  • the S cerevisiae W (hR) pHlAl strain (FIG. 3A) is derived from the W (hR) strain.
  • the two strains W (R) pHlAl ( Figure 3B) and W (R) pP73Al ( Figure 3C) are derived from the strain W (R).
  • strains W (R) and W (hR) have been described respectively by Truan et al. (1993) and Urban et al. (1993).
  • W strain (hR) the open reading phase of human NADPH-cytochrome P450 reductase (2034 bp) was inserted into the yeast genome instead of that of the
  • NADPH-cytochrome P450 reductase from yeast and placed under the control of the strong promoter GAL10-CYC1. The terminator of the yeast NADPH-cytochrome P450 reductase gene has been retained.
  • the two strains W (hR) pHlAl and W (R) pHlAl result respectively from the transformation of W (hR) and W (R) with the plasmid pi Al.
  • Plasmid pi Al results from the insertion in plasmid pV60 of the sequence coding for human P450 1A1 (1539 bp), placed between the strong promoter GAL10-CYC1 and the terminator of the phosphoglycerate kinase gene ( PGK). It contains the gene coding for ⁇ -lactamase which confers resistance to ampicillin in E coll.
  • This plasmid can be maintained in yeasts thanks to auxotrophy markers
  • URA 3 and AD ⁇ 2 which complement the corresponding deficient genes in the yeast genome.
  • the addition of the AD ⁇ 2 auxotrophy marker allows better stability of the vector when the transformed yeasts are cultivated in a culture medium becoming spontaneously limiting in adenine with high cell density.
  • the plasmid can multiply in bacteria thanks to an origin of replication of E coli and in yeasts thanks to a fragment of the origin of replication of the plasmid 2 ⁇ .
  • the yeast transformation protocol adapted from Gietz et al. (1992), first requires making the yeasts competent.
  • the strains W (R) and W (hR) are cultured in YPGA medium (glucose 20 g / 1, yeast extract 10 g / 1, bactopeptone 10 g / 1 and adenine 20 mg / 1) up to '' to reach an OD 6 oo nm between 0.5 and 2.
  • YPGA medium glucose 20 g / 1, yeast extract 10 g / 1, bactopeptone 10 g / 1 and adenine 20 mg / 1
  • OD 6 oo nm between 0.5 and 2.
  • centrifugation 6000 g, 3 min, 20 ° C
  • the cell pellet is washed twice with 25 ml of sterile distilled water, then once with 2 ml of 100 mM Tris-HCl buffer, 1 mM ⁇ DTA, 0.1 M lithium acetate.
  • the cell pellet is taken up in 1 ml of this same buffer. Then, in order to proceed with the transformation of the yeasts, the aliquot of the transforming vector pi Al, 50 ⁇ g of DNA denatured from salmon sperm, 100 ⁇ l of competent yeasts and 300 ⁇ l of a PEG-4000 solution are mixed. 40% in 100 mM Tris-HCl buffer, ImTA EDTA, 0.1 M lithium acetate. The mixture is incubated for 30 min at 28 ° C and then 15 min at 42 ° C. After centrifugation (11000 g, 3 min, 20 ° C), the cell pellet is taken up in 100 ⁇ l of Ringer liquid.
  • the 100 ⁇ l are spread over SGI medium (glucose 20 g / 1, yeast nitrogen base 7g / l, bactocasamino acids lg / 1, tryptophan 20 mg 1 and agar 20g / l).
  • SGI medium glucose 20 g / 1, yeast nitrogen base 7g / l, bactocasamino acids lg / 1, tryptophan 20 mg 1 and agar 20g / l.
  • the dishes are incubated for 2 to 3 days at 30 ° C.
  • the W (R) strain pP73Al results from the transformation of the W (R) strain with the plasmid pV60 in which the Jerusalem artinambour cinnamate 4-hydroxylase gene or P450 73A1 (plasmid called p73Al - see Figure 3) has been inserted (Urban
  • Example 3 Example of digestion protocol in the digestive systems TIM1 and TIM2 (modified protocol from WO 94/09895)
  • variable digestion time is programmed between 240 and 360 minutes. Solutions used during digestion
  • gastric juice NaCI 53 mM, KC1 15 mM, CaCl 2 1 mM and NaHCO 3 7 mM, pH 4, to which pepsin is added at a rate of 588 U / ml,
  • the yeast strain studied, resuspended in 300 ml of semi-skimmed milk or YPL culture medium (yeast extract 10g / l, bactopeptone 10 g / 1, galactose 20g / l), is introduced into the stomach.
  • the yeasts are prepared as described in the examples 4 and 5.
  • gastric juice and lipase are delivered at a flow rate of 0.25 ml / min, 1 ⁇ C1 is introduced at a flow rate of 0.25 ml / min if necessary.
  • the 7% pancreatin solutions are delivered at a flow rate of 0.25 ml / min, the bile solution (at 4 or 2%) at a flow rate of 0.5 ml / min, the 1 M NaHCO 3 and the electrolyte solution IX at a total flow rate of 0.25 ml / min.
  • NaHCO 3 1M is introduced at a flow rate of 0.25 ml / min, if necessary.
  • fermentation can be maintained for up to a week after sowing the colon.
  • the bacterial pellet and the mucus are taken up in basic medium (Ileum delivery medium), itself diluted 10 times in 0.1 M phosphate buffer.
  • TBC 40X a solution containing lipids and proteins
  • vitamins 10 X menadione 10 mg / 1, biotin 20 mg / 1, vitamin B12 5 mg / 1, pantothenate 100 mg / 1, nicotinamide 50 mg / 1, p-aminobenzoic acid 50 mg / 1 and thiamine 40 mg / 1.
  • the dialysis solution (1 X colon electrolyte solution and 0.01 X vitamin solution, pH 6.5) is bubbled under nitrogen flow overnight. It is delivered at a flow rate of 1 ml / min for the entire duration of stabilization and fermentation (dialysis fibers: JFM M5ID X Flow).
  • “Ileum delivery medium” (1 X colon electrolyte solutions, 10 X carbohydrate solution, 10 X TBC, 0.01 X vitamin solution and 20 g / 1 mucus, pH 6.5), simulating the product of digestion from the ileum, is introduced into the colon at the rate of 3 ml per hour.
  • the studied yeast strain resuspended in demineralized water or in YPL culture medium (yeast extract 10 g / l, bactopeptone 10 g / 1, galactose 20 g / l), is introduced into the colon, after stabilization of the flora.
  • the yeasts are prepared as described in Examples 4 and 5.
  • the W (R) pHlAl and W (hR) pHlAl strains are cultured in minimum SGI medium (glucose 20 g / 1, yeast nitrogen base 7g / l, bactocasamino acids lg / 1 and tryptophan 20 mg / 1) at a concentration of 10 6 - 10 7 cells / ml.
  • the culture is then centrifuged in sterile plastic tubes (3000 g, 10 min, 4 ° C). The supernatant is discarded and the cells are washed in 15 ml of physiological water (NaCl 9 g / 1).
  • the yeasts are introduced into TIM 1 resuspended in 300 ml of semi-skimmed milk or are introduced into TIM2 resuspended in 5 ml of demineralized water.
  • the samples are diluted in physiological water and spread on SGI medium.
  • Ampicillin 100 ⁇ g / ml is added to the medium in order to eliminate the contaminants coming from the digestive system and / or the faecal flora, as well as ethanol (3% v / v) in order to promote the yeast development.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the PCRs can be carried out using colonies isolated on a petri dish or yeasts returned to liquid culture.
  • the culture In the first case, we take a pinhead from a colony which is resuspended in 10 ⁇ l of distilled water before boiling for 10 min.
  • the culture In the second case, the culture must be in exponential growth phase (DOeoonm between 0.5 and 2). After centrifugation (10000g, 10 min, 4 ° C), the cell pellet is taken up in 50 ⁇ l of distilled water and boiled for 10 min.
  • the best results in terms of intensity of the amplifiers and reproducibility of the experiments
  • DO 6 oonm from 0.5 to 2 the yeast growth stage does not seem to influence the results.
  • the primers used are either internal to the genes (P450 1A1 and NADPH-cytochrome P450 reductases human or yeast), or located both on the gene and its promoter GAL10-CYC1 in order to verify its stability ( Figure 3) . They are chosen so that they hybridize as little as possible on themselves, with themselves and with each other using the program on the Internet at the following address: http://www.Williamstone.com/primers/calculator/calculator.cgi
  • the PCR samples contain 1 X PCR buffer, 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM 4 dXTP, 5 'and 3' primers 0.5 ⁇ M, Taq polymerase 25 U / ml and the DNA template 0.06%.
  • the PCR program used is as follows (30 cycles): denaturation 5min 95 ° C, denaturation 30s 95 ° C, priming 30s 51 ° C, DNA synthesis 2min 72 ° C and final extension 10min 72 ° C.
  • the samples are mixed with a stop solution (Bromophenol blue 0.25%, Ficoll 10% and SDS 1%) and deposited on a 1.5% Agarose gel containing BET 0.5 ⁇ g / ml .
  • the migration is carried out in an electrophoresis tank containing 40 mM Tris-base buffer, 20 mM glacial acetic acid, 1 mM EDTA, for 15 minutes at 100V. After migration, the DNA is visualized under UV.
  • yeast strains were identified by PCR both at the outlet of the small intestine up to 6 hours after their introduction into the stomach and at the outlet of the colon up to 48 hours after their introduction into it. (figure 6).
  • the yeasts are precultured for 12 hours at 28 ° C., with stirring, in 30 ml of SGI (glucose 20 g / 1, yeast nitrogen base 7g / l, bactocasamino acids 1 g / 1 and tryptophan 20 mg / 1). Then, a culture of 48 h at 28 ° C, with stirring, is carried out in 250 ml of YPGE (glucose 20 g / 1, yeast extract 10 g / 1, bactopeptone 10 g / 1 and 3% ethanol).
  • CYP73A1 is caused by the addition of galactose (25 ml of a 200 g / l solution) until a density of 3 to 4 x10 7 yeasts / ml is reached.
  • galactose 25 ml of a 200 g / l solution
  • the culture is then centrifuged in autoclave plastic tubes at 3000 g, 10 min, 4 ° C.
  • the supernatant is discarded and the cells are washed in 15 ml of physiological water (NaCl 9 g / 1).
  • the yeasts After a new centrifugation (3000 g, 10 min, 4 ° C), the yeasts are introduced into TIM 1 resuspended in 300 ml of YPL culture medium (galactose 20 g / 1, yeast extract 10 g / 1, bactopeptone 10 g / 1) and are introduced into TIM 2 resuspended in 10 ml of YPL medium.
  • YPL culture medium galactose 20 g / 1, yeast extract 10 g / 1, bactopeptone 10 g / 1
  • the samples are diluted in physiological water and spread on SGI medium. Ampicillin (100 ⁇ g / ml) is added to the medium in order to eliminate the contaminants coming from the digestive system and / or the faecal flora.
  • yeasts show great resistance to gastric and intestinal secretions since no significant difference is observed in each digestive compartment of TIM1 between the curve obtained for yeasts and that of a nonabsorbable transit marker (Figure 7).
  • Example 6 Measurement of the ethoxyroresorufin-O-deethylase (EROD) activity of the W (hR) pHlAl yeasts after passage through TIM 1
  • EROD ethoxyroresorufin-O-deethylase
  • the W (hR) pHlAl strain is used to demonstrate the maintenance of the activity of the recombinant yeasts after passage through TIM1.
  • P450 1A1 has the ethoxyroresorfin-O-deethylase (EROD) activity and catalyzes the transformation of 7-ethoxyroresorfin into resorufin.
  • EROD ethoxyroresorfin-O-deethylase
  • the yeasts are precultured for 12 hours at 28 ° C., with stirring, in 30 ml of SGI (glucose 20 g / 1, yeast nitrogen base 7g / l, bactocasamino acids 1 g / 1 and tryptophan 20 mg / 1). Then, a culture of 48 h at 28 ° C, with stirring, is carried out in 250 ml of YPGE (glucose 20 g / 1, yeast extract 10 g / 1, bactopeptone 10 g / 1 and 3% ethanol). During the last 12 hours, the induction of P450 1A1 is caused by the addition of galactose (25 ml of a 200 g / l solution). The yeast culture is then either used as such for the assay of EROD on cells, or undergoes various treatments in order to prepare microsomes (Pompon et al., 1996).
  • SGI yeast nitrogen base 7g / l
  • the P450 1A1 content was measured on microsomes of the W (hR) pHl Al strain after passage through the digestive systems.
  • EROD ethoxyroresorufin-O-deethylase
  • the W (hR) pHl Al strain always has the EROD activity, characteristic of P450 1A1, at the outlet of the small intestine and in the colon, whether this is assayed on microsomes (approximately 20 pmol of resorufin per ml microsomal suspension per minute) or on cells (approximately 5 pmol of resorufin per ml of culture per minute).
  • the yeast strain used to demonstrate the activity in situ is the W (R) pP73Al strain.
  • P450 73A1 has cinnamate 4-hydroxylase activity and catalyzes the transformation of tram-cinnamic acid into 7-coumaric acid.
  • the yeasts are precultured for 12 hours at 28 ° C., with stirring, in 30 ml of SGI (glucose 20 g / 1, yeast nitrogen base 7g / l, bactocasamino acids 1 g / 1 and tryptophan 20 mg / 1). Then, a culture of 48 h at 28 ° C, with stirring, is carried out in 250 ml of YPGE (glucose 20 g / 1, yeast extract 10 g / 1, bactopeptone 10 g / 1 and 3% ethanol).
  • CYP73A1 is caused by the addition of galactose (25 ml of a 200 g / l solution) until a density of 3 to 4 x10 7 yeasts / ml is reached.
  • the culture is then centrifuged in autoclave plastic tubes at 3000 g, 10 min, 4 ° C. The supernatant is discarded and the cells are washed in 15 ml of physiological water (NaCl 9 g / 1).
  • the supernatant is discarded and the cell pellet is resuspended in the food (300 ml of YPL medium for monitoring the bioconversion reaction in TIM 1 and 10 ml of YPL medium for monitoring the reaction in TIM 2).
  • the substrate (tr ras-cinnamic acid) is introduced extemporaneously into the stomach at a concentration of 670 ⁇ M (concentration in food). Digestion is carried out over 240 minutes.
  • Samples (1 ml) are taken at different levels of the digestive tract: in food (tO), in the stomach after 15, 30, 45, 60 and 90 min of digestion, in the duodenum after 15 , 30, 45, 60, 75, 90, 120 and 150 min of digestion, in the jejunum after 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 and 240 min of digestion, in the ileum after 30, 45, 60, 90, 120, 180 and 240 min of digestion and in the accumulated ileal outflows on 0-30 min, 30-45 min, 45-60 min, 60-90 min, 90-120 min , 120-180 min and 180-240 min at 30, 45, 60, 90, 120, 180 and 240 min.
  • the substrate (tr ⁇ s-cinnamic acid) is introduced into the colon at a concentration of 1.7 mM (initial concentration in the colon).
  • Samples (1 ml) are taken at tO then 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150, 180, 240, 300 and 360 min after simultaneous introduction of the yeasts and the substrate into the colon.
  • the samples are diluted to 1 A before being treated as described below.
  • Phase A Water 95, Methanol 5 and acetic acid 0.1 (v / v),
  • Phase B Acetonitrile 95, Methanol 5 and acetic acid 0.1 (v / v),
  • Detection is carried out by spectrophotometry at 314 nm between 0 and 16 min, then at 280 nm between 16 and 34 min.
  • the retention time of the compounds is 6 + 0.5 min for 7-coumaric acid and
  • the signal sequence of the ⁇ peptide is divided into three domains, located directly upstream of the ⁇ peptide and necessary for its maturation and its secretion: 1- the sequence of addressing the peptide to the endoplasmic reticulum: Pre sequence,
  • the bacteria / yeast shuttle vector pYES2-CT (commercial plasmid, Invitrogen) served as a basis for the construction of the plasmids ppV H 6 and ppGSTV 5 H 6 (FIG. 11A and 1 IB).
  • pYES2-CT carries an expression cassette comprising the strong promoter GAL 1 (inducible by galactose) and the terminator of the CYCl gene.
  • GAL 1 inducible by galactose
  • This vector also presents, under the control of GAL 1, a sequence coding for an epitope called V 5 and for a polypeptide chain of 6 histidines.
  • the plasmid ppVjHk was constructed by inserting the sequence coding for PreProKR upstream of the sequence coding for the epitope V 5 . To do this, the restriction sites BamHI and EeoR1 were added, by PCR amplification, respectively to the 5 'and 3' ends of the sequence coding for PreProKR. The PCR product was then subcloned into the vector pYes2 / CT, opened by double digestion BamHl - ⁇ coRl.
  • the construction was carried out from the plasmid ppV 5 H 6 into which the sequence of the coding phase of GST was inserted, upstream of the sequence V 5 H 6 . This insertion was carried out by homologous recombination directly in the host yeast. For this, homologous sequences were added, by PCR amplification, to the ends of the coding phase of GST (GST from Schistosoma japonicum).
  • the plasmids ppV 5 H 6 and ppGSTV 5 H 6 were introduced by transformation into the yeast strain W303 with the sexual sign MAT ⁇ (leu 2, his 3, trp 1, ura 3 and ade 2 ), giving respectively the strains WppV H 6 and WppGSTV 5 H 6 .
  • the “tagged” model protein (noted GST-V 5 H 6 ) secreted by the WppGSTV 5 H 6 strain has a size of 29.7 kDa (calculated PM).
  • the WppV 5 H 6 or WppGSTV 5 H 6 strains are precultured (24h, 30 ° C, 210 rpm) in minimum SRAI medium (bactocasamino acids lg / 1, yeast nitrogen base 7g / l, adenine 2 mg / ml and raffinose 20 g / 1), until it is in the stationary phase. Then, a growth culture (12 h, 37 ° C, 210 rpm) is carried out in complete YPRA medium (yeast extract 10 g / 1, bactopeptone 10 g / 1, adenine 2 mg / ml and raffinose 20 g / 1) , until being in stationary phase.
  • minimum SRAI medium bactocasamino acids lg / 1, yeast nitrogen base 7g / l, adenine 2 mg / ml and raffinose 20 g / 1
  • complete YPRA medium yeast extract 10 g /
  • the culture is centrifuged (2000 g, 6 min, room temperature), the supernatant is removed, then the YPLRA induction medium (yeast extract 10 g / 1, bactopeptone 10 g / 1, adenine 2 mg / ml, galactose 20 g / 1 and raffinose 10 g / 1) is seeded either at high cell density (OD 6 oo nm of 4), or at low cell density (OD 6 nonm of e 0.6).
  • the induction culture is carried out for 6 h, at 37 ° C., with stirring (210 rpm).
  • Samples are taken from the growth culture and from the induction culture at tO, t2h, t4h and t6h, under the two cell concentration conditions. Sample processing
  • Protein electrophoresis For each sample, the proteins of the supernatant are deposited, corresponding to a culture volume containing 5 * 10 7 yeasts. The proteins are separated by electrophoresis on 12% polyacrylamide gel (GST-V 5 H 6 ) or 16.5% (peptide-V H 6 ), under denaturing conditions (addition of SDS). A migration buffer containing tricin, more suitable for the separation of low molecular weight proteins, was used in the case of the peptide-V 5 H 6 (Shagger H. and Von Jagow G., 1987). The migration parameters are as follows: 30 mA, 150 V, 1 h (GST-V 5 H 6 ) or 3 h (peptide-V 5 H 6 ).
  • the proteins are transferred onto a polyvinyldifluorene membrane (PVDF).
  • PVDF polyvinyldifluorene membrane
  • the transfer parameters are as follows: 350 mA, 100 V, 1 h (GST- V 5 H 6 ) or 20 min (peptide- V 5 H 6 ).
  • the peptide-V 5 H 6 and the GST-V 5 H 6 are revealed after successive incubations of the membranes with the specific anti-V 5 antibody and a secondary antibody coupled to alkaline phosphatase (Western-Breeze Kit, Invitrogen, WB7103) .
  • the addition of the substrate (BCIP / NBT) causes the formation of a purple precipitate.
  • FIG. 12 represents the Western-Blots obtained with the strain WppV 5 H 6 (12A) and with the strain Wp ⁇ GSTV 5 H 6 (12B).
  • the basal level of secretion obtained on raffinose is too low to be visible on Western-Blot.
  • the secretion products are detectable as early as 2 hours after induction of the GAL1 promoter by galactose. In view of the Western-Blots, the secretion seems more important when the induction culture is carried out at low cell density, either for the peptide-V 5 H 6 or for the GST-V 5 H 6 .
  • the secretion products are also detectable in the form of precursors (with the sequence Pre-Pro-KR) and in glycosylated or hyperglycosylated form.
  • the WppV 5 H 6 or WppGSTV 5 H 6 strains are precultured (24h, 30 ° C, 210 rpm) in minimum SRAI medium (bactocasamino acids lg / 1, yeast nitrogen base 7g / l, adenine 2 mg / ml and raffinose 20 g / 1), until it is in the stationary phase. Then, a growth culture (12 h, 37 ° C, 210 rpm) is carried out in complete YPRA medium (yeast extract 10 g / 1, bactopeptone 10 g / 1, adenine 2 mg / ml and raffinose 20 g / 1) , until being in stationary phase.
  • minimum SRAI medium bactocasamino acids lg / 1, yeast nitrogen base 7g / l, adenine 2 mg / ml and raffinose 20 g / 1
  • a growth culture (12 h, 37 ° C,
  • the culture is centrifuged (3000 g, 10 min, room temperature) and the cell pellet is resuspended in 300 ml of the YPLRA induction medium (yeast extract 10 g / 1, bactopeptone 10 g / 1, adenine 2 mg / ml , galactose 40 g / 1 and raffinose 20 g / 1), thus constituting the food which will be introduced into the YPLRA induction medium (yeast extract 10 g / 1, bactopeptone 10 g / 1, adenine 2 mg / ml , galactose 40 g / 1 and raffinose 20 g / 1), thus constituting the food which will be introduced into the YPLRA induction medium (yeast extract 10 g / 1, bactopeptone 10 g / 1, adenine 2 mg / ml , galactose 40 g / 1 and raffinose 20 g /
  • the digestion is carried out according to a conventional digestion protocol (see example 3) but without the digestive proteases (to avoid degradation of the secretion products).
  • Samples are taken at different levels of the digestive tract: in the food before introduction into the system (tO), in the stomach after 90 and 120 min of digestion, in the duodenum after 90, 160 and 210 min digestion, in the jejunum after 90, 160 and 210 min of digestion and in the ileum after 90, 160,
  • Counts are carried out in the food and in the cumulative outflows over 0-90, 90-180 and 180-270 min, at 90, 180 and 270 min, by counting on medium
  • Protein precipitation The precipitation protocol is that described in Example 9. The samples from the stomach are neutralized beforehand with 1M sodium bicarbonate.
  • Protein electrophoresis The electrophoresis protocol is that described in Example 9. All of the proteins contained in the supernatant of the samples are deposited (corresponding to a volume of 2 ml in TIM 1, except for the stomach and the duodenum where the volume of the samples is 4 ml, and 600 ⁇ l in the Erlen Meyer).
  • the Western-Blot protocol is that described in Example 9.
  • the anti-GST antibody was used in place of the anti-V 5 antibody in order to carry out a semi-quantification of GST-V 5 H 6 secreted.
  • FIGS. 13 and 14 represent the Western-Blots obtained during digestion in TIM 1 in the presence of the strains WppV 5 H 6 and WppGSTV 5 H 6 respectively .
  • the V 5 H 6 peptide was detected in all of the TIM 1 compartments as early as 90 minutes after the start of digestion. The amount of peptides detected increases during digestion and along the digestive tract (from the stomach to the ileum) for a time given digestion. GST-V 5 H 6 was detected in all compartments except the stomach. The amount of protein secreted also increases during digestion.
  • FIG. 15 represents a semi-quantification of the GST-V 5 H 6 produced during digestion in TIM 1 in the presence of the strain WppGSTV 5 H 6 .
  • the concentration of GST-V 5 H 6 in the digestive samples can be evaluated at: - ⁇ 1 ng / ml for the duo, jej and ile samples 90 min, lo 10 ng / ml for the jej and ile samples at time 160 and 210 min.

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Abstract

La présente invention concerne le développement de micro-organismes génétiquement modifiés, notamment de levures génétiquement modifiées, pouvant survivre dans un environnement digestif et y exprimer efficacement un ou plusieurs gènes d'intérêt. La forme galénique et le mode d'administration de ces micro-organismes sont également proposés. De plus, l'invention se rapporte à l'utilisation de systèmes digestifs artificiels simulant les fonctions gastro-intestinales de l'homme pour l'étude, le contrôle et la sélection des micro-organismes précités. L'invention porte également sur des applications directes de sécrétion et/ou de bioconversion in situ, en particulier dans la mise au point de traitements préventifs ou curatifs de pathologies, notamment de maladies liées au métabolisme des xénobiotiques.

Description

MICRO-ORGANISMES ACTIFS DANS L'ENVIRONNEMENT DIGESTIF
La présente invention concerne le développement de micro-organismes génétiquement modifiés, notamment de levures génétiquement modifiées, pouvant survivre dans un environnement digestif et y exprimer efficacement un ou plusieurs gènes d'intérêt. La forme galénique et le mode d'administration de ces micro-organismes sont également proposés. De plus, l'invention se rapporte à l'utilisation de systèmes digestifs artificiels simulant les fonctions gastro-intestinales de l'homme pour l'étude, le contrôle et la sélection des micro-organismes précités. L'invention porte également sur des applications directes de bioconversion in situ, en particulier dans la mise au point de traitements préventifs ou curatifs de pathologies, notamment de maladies liées au métabolisme des xénobiotiques.
Les êtres vivants sont continuellement en contact avec des xénobiotiques, substances dites étrangères aux voies métaboliques « normales » de la cellule (médicaments, pesticides, polluants, additifs alimentaires, molécules « naturelles » de plantes...). Ces composés, souvent trop hydrophobes pour être éliminés directement par les reins ou dégradés par la bile, s'accumulent dans les lipides de l'organisme. Les enzymes du métabolisme des xénobiotiques (ou EMX) sont chargées de faciliter leur élimination en les rendant plus hydrophiles.
Ces enzymes sont classées en trois catégories :
- les enzymes de phase I (phase de fonctionnalisation) : rendant le xénobiotique plus hydrophile par introduction de groupements polaires (le plus souvent par des réactions d'oxydation). Ce sont principalement les monooxygénases à cytochrome P450, hémoprotéines présentant un maximum d'absorption caractéristique aux environs de 450 nm, lorsqu'elles sont réduites et liées au monoxyde de carbone (Omura, 1964, 1993). Chez les mammifères, les P450 se situent majoritairement au niveau de la membrane du réticulum endoplasmique lisse, principalement dans le foie, mais également dans les poumons et l'intestin, organes jouant un rôle dans le contrôle de l'entrée de nombreux xénobiotiques dans l'organisme. Chaque P450 fait partie d'un complexe multienzymatique où il est associé à deux systèmes de transport d'électrons à flavoprotéine, la NADPH-cytochrome P450 réductase et la NADH-cytochrome b5 réductase.
Les P450 fonctionnent selon un cycle catalytique au cours duquel le fer passe par différents degrés d'oxydation, ce qui conduit à l'incorporation d'un atome d'oxygène dans le substrat R selon la réaction suivante (Guengerich, 1993) : RH + O2 + 2e- + 2H+ => ROH + H2O
Les P450 possèdent des propriétés catalytiques originales puisque, contrairement à la majorité des enzymes, un P450 donné peut agir sur de nombreux substrats présentant des structures très différentes et, inversement, un même substrat peut être reconnu par différents P450 (Coon et al., 1992). Des facteurs endogènes (espèce, souche...), physiologiques (âge, sexe...), mais également des facteurs exogènes peuvent moduler l'activité des P450 (Guengerich, 1993), en agissant à différents niveaux : expression du gène, stabilisation de la protéine, modulation de l'activité. - les enzymes de phase II (phase de conjugaison) : rendant les métabolites issus de la phase I encore plus hydrophiles (s'ils ne sont pas excrétés directement), par conjugaison à des molécules endogènes diverses (glutathion, glucuronide...). Ces enzymes sont présentes dans presque toutes les cellules de l'organisme, les principales étant la glutathion S-transférase (GST), la N-acétyl transférase (NAT), la quinone réductase (QR), l'aldéhyde deshydrogénase (ALDH), l'uridine diphosphoglucuronosyl transférase (UGT), la sulfotransférase, l'époxide hydrolase et la O-acétylase. - les enzymes de phase III (phase d'évacuation) : chargées d'éliminer des cellules les métabolites issus des réactions de détoxication (pompes transporteurs ABC, en particulier les pompes multidrug résistant MDR).
Globalement, le métabolisme des xénobiotiques est considéré comme une voie de détoxication. Cependant les enzymes de phase I peuvent donner naissance à des métabolites plus réactifs que la molécule initiale, susceptibles de se lier aux protéines (provoquant des nécroses ou des maladies auto-immunes), aux acides nucléiques (responsables de mutagénèse ou de cancérogénèse) ou aux lipides (peroxy dation lipidique). C'est le cas notamment lorsque les enzymes de phase II sont absentes ou d'activité trop faible.
L'activité des EMX est déterminée génétiquement et hautement variable selon les individus (polymorphisme génétique). L'analyse moléculaire des corrélations existant entre gènes majeurs impliqués dans les processus de détoxication et de biotransformation, et pathologies fait actuellement l'objet de nombreux travaux de recherche. En effet, des anomalies dans les processus de détoxication et de biotransformation des composés exogènes ont clairement été identifiées chez des patients atteints de maladies dites « multifactorielles » (maladies combinant prédisposition génétique et rôle de facteurs environnementaux), très répandues à ce jour dans le monde, telles que différents cancers, diverses pathologies digestives, endométriose, bronchite chronique... Pour exemple, le risque de cancer des poumons induit par les hydrocarbures aromatiques polycycliques est augmenté d'environ 40 fois lorsque l'individu est déficient en GSTM1 (phénotype GSTM1 0/0) et possède un P450 1 Al à forte activité enzymatique (Raunio et al., 1995). De plus, selon des études épidémiologiques, les populations qui ont le plus grand risque de développer un cancer du côlon sont celles qui possèdent le phénotype « métaboliseur rapide » pour la NAT2 et le P4501 A2 et qui sont exposées à des hauts niveaux d'aminés hétérocycliques dans leur alimentation (Lang et al., 1994). Concernant le cancer du sein, des corrélations ont pu également être établies. Les femmes possédant une forme de P450 1A1 hautement inductible voient leur risque d'avoir un cancer du sein augmenté. De même, le risque de cancer du sein est augmenté (x4) chez les femmes ménopausées, fumant modérément (présence d'aminés aromatiques) et possédant un phénotype lent pour NAT2. Le groupe à risque pour le cancer de la vessie est représenté par les individus déficients en GSTM1 et NAT2 (Brockmoller et al., 1996). Une corrélation positive a été établie entre endométriose et femmes déficientes en GSTM1, ainsi qu'avec le phénotype métaboliseur lent pour NAT2 (Baranova et al., 1999).
L'alimentation est une des principales sources de xénobiotiques impliqués dans les maladies multifactorielles, d'où l'intérêt d'assurer la détoxication de ces xénobiotiques avant qu'ils n'exercent des effets négatifs sur les organes cibles.
Ainsi, la présente invention concerne le développement d'un « médicament vivant », micro-organismes génétiquement modifiés, et plus particulièrement les levures, exprimant dans l'environnement digestif un ou plusieurs gène(s) d'intérêt(s) permettant de corriger des dysfonctionnements du métabolisme des xénobiotiques, tels que ceux mentionnés ci-dessus. Ce ou ces gènes d'intérêt seront choisis après détermination des corrélations entre patrimoine génétique et présence de pathologie et après évaluation de la prévalence de cette pathologie.
Outre la principale application de détoxication, deux autres objectifs de la présente invention sont décrits ci-dessous, à titre d'exemples.
Le premier consiste à faire exprimer dans l'environnement digestif par lesdits micro- organismes un gène d'intérêt codant pour une enzyme permettant l'activation in situ de pré-substance en substance active. L'administration d'un tel « médicament vivant » permettant de contrôler la bioconversion de pré-substance en substance active est tout particulièrement intéressante dans le cas où la substance active possède des effets secondaires indésirables et/ou est toxique à partir d'une certaine dose. Parmi ces applications, on peut citer la transformation de provitamines en vitamines.
Le second consiste à faire produire dans l'environnement digestif par ces microorganismes un peptide ou un polypeptide actif, en particulier ayant des propriétés antigéniques. La production de tels peptides, en différents points du tractus digestif, aboutit à la mise au point de « vaccins vivants » permettant de contourner un certain nombre de difficultés rencontrées dans les méthodes classiques d'administration appartenant à l'état de la technique, telles les problèmes de dégradation.
Fahl et al (WO 99/27953) ont construit des souches cVE.coli exprimant des enzymes de mammifères (P450 1A1, NADPH-cytochrome P450 réductase et GST) dont les gènes ont été insérés dans un plasmide. Ces constructions modèles sont réalisées dans le but de développer des « souches bactériennes chimioprotectrices », en particulier des Lactobacilles, exprimant des enzymes de mammifères impliquées dans la détoxication de procarcinogènes et administrées dans l'environnement digestif afin de supplémenter le système de détoxication des cellules gastro-intestinales.
Fahl et al. ne précisent pas la durée de survie des Lactobacilles génétiquement modifiés dans un environnement digestif et s'ils peuvent y exprimer efficacement un gène d'intérêt.
Pour répondre à ces questions, nous avons mis en place des systèmes digestifs artificiels qui permettent d'étudier, d'adapter, de contrôler et de sélectionner des micro-organimes qui survivent au moins pendant un temps minimum et qui peuvent exprimer efficacement in situ (c'est-à-dire dans l'environnement digestif) un ou plusieurs gènes hétérologues d'intérêt. Bien entendu, la durée de survie dépend des micro-organismes en question et de l'environnement digestif, mais on peut définir dans le cadre de l'invention ce paramètre comme étant supérieur à 6h dans l'estomac- intestin grêle et 48H dans le côlon, c'est à dire la durée moyenne du transit dans ces compartiments digestifs chez l'homme.
Parmi les micro-organismes préférés de l'invention, on peut citer les levures. En effet, au même titre que les bactéries visées par la demande de brevet précédemment citée, les levures sont des organismes présents dans l'alimentation animale et/ou humaine et des hôtes bien connus de l'environnement digestif. Certaines d'entre elles sont des orgamsmes GRAS ou « generally recognized as safe » et sont utilisées depuis quelques années comme probiotiques.
Leur facilité de production explique leur utilisation à grande échelle dans l'industrie alimentaire, par exemple dans les processus de fabrication de la bière et du pain ou comme additif dans l'alimentation animale et humaine. S cerevisiae est la plus connue et la plus exploitée commercialement. Aujourd'hui, S cerevisiae et S boulardii sont également utilisées dans l'industrie pharmaceutique comme médicaments (carbolevure® et ultralevure® respectivement), principalement destinés au traitement des troubles secondaires à l'antibiothérapie tels que diarrhées, colites ou candidoses (Ligny G, 1975). De très nombreuses études réalisées chez l'animal et chez l'homme soulignent à la fois l'innocuité et l'impact positif de ces levures sur l'environnement digestif (antagonisme vis à vis des Candidas par exemple). Comparativement aux bactéries, l'utilisation de levures à des fins de médicaments vivants présente des avantages considérables :
- Contrairement aux bactéries, les levures sont des organismes eucaryotes. L'intégration génomique de fragments hétérologues est facilement réalisable
(recombinaison homologue hautement efficace) et aboutit à une construction plus stable que celle obtenue par insertion plasmidique, ce qui notamment limite les transferts potentiels du gêne d'intérêt à la flore endogène humaine. De plus, les levures présentent une organisation subcellulaire très voisine de celle des eucaryotes supérieurs et disposent de mécanismes de transport intracellulaire et de processing post-traductionnel indispensables à l'expression fonctionnelle et compartimentée de beaucoup de gènes hétérologues. Pour exemple, il a été montré qu'elles possèdent les critères nécessaires à la synthèse de P450 humains fonctionnels puisqu'un système d'adressage des protéines ("Signal Récognition Particule" ou SRP) permet la translocation du P450 synthétisé vers le réticulum endoplasmique, ce qui aboutit à une localisation intracellulaire et un repliement du P450 corrects (Urban et al., 1994a ; Pompon et al., 1997). Les levures possèdent également un environnement membranaire lipidique permettant la stabilité du P450 et des protéines de transfert d'électrons (NADPH- cytochrome P450 réductase et cytochrome b5) dans la membrane du réticulum endoplasmique, nécessaires à l'activité enzymatique du P450.
- Les levures, bien caractérisées au niveau moléculaire (notamment S cerevisiae, entièrement séquencée depuis 1996-Goffeau et al.-), constituent un outil de base pour l'ingénierie génétique et les bioconversions in vitro dans des conditions de fermentation non seulement de laboratoire mais surtout à grande échelle (production industrielle).
- Certaines levures telles que S cerevisiae possèdent la capacité de vivre en aérobie et en anaérobie, ce qui permet d'envisager l'utilisation de telles levures à tout niveau du tractus digestif.
- D'autres avantages concernant la construction des levures recombinées sont également à souligner. En effet, les levures sont sélectionnées par auxotrophie et non sur la base d'une résistance à un antibiotique, ce qui évite d'être confronté aux problèmes liés à l'administration à l'homme d'organismes génétiquement modifiés possédant un gène de résistance à un antibiotique. De plus, l'insertion génomique du gène d'intérêt est facilitée par la propriété de recombinaison qu'ont certaines levures, dont S cerevisiae (Bellamine, 1996).
Des souches de S cerevisiae ont été développées permettant l'expression de trois grands types de gènes intervenant dans les différentes phases du métabolisme des xénobiotiques : des gènes de cytochromes P450 humains (phase I), des gènes d'enzymes "d'environnement de phase I" (NADPH-cytochrome P450 réductase et cytochrome b5 par exemple) et des gènes de phase II. De telles souches ont été décrites par Pompon et al. (US 5,635,369 et EP 595 948).
Dans le cadre de la présente invention, des souches de S. cerevisiae ont été utilisées comme modèles d'étude. Elles expriment d'une part le P450 1A1 humain et la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure ou d'homme (respectivement souches W(R)pHlAl et W(hR)pHlAl ), d'autre part le P450 73A1 de plante et la NADPH- cytochrome P450 réductase de levure (souche W(R)pP73Al).
Le P450 1A1 existe dans la majorité des espèces animales, y compris chez l'homme. La forme humaine a été isolée par Jaiswal et al. (1985). Il intervient dans le métabolisme des hydrocarbures aromatiques polycycliques, en particulier dans celui du benzo(a)pyrène, composé présent notamment dans la fumée de cigarettes et les produits de barbecue (Sims et al., 1974 ; Gautier et al., 1996a). Il est difficilement décelable dans le foie sans l'action d'un inducteur mais existe dans de nombreux tissus extra-hépatiques à l'état constitutif. Il est fortement inductible par des composés aromatiques polycycliques tels que le 3-méthylcholanthrène (3-MC), par des composés aromatiques halogènes tels que la 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-j?-dioxine (TCDD) ou par des flavonoïdes comme la β-naphtoflavone.
Le P450 73A1 (activité cinnamate 4-hydroxylase ou CA4H) catalyse la première étape de la voie des phénylpropanoïdes chez les plantes supérieures en transformant l'acide trans-cinnamique en acide p-coumarique. Cette voie constitue le début de la synthèse des flavonoïdes (anti-oxydants).
La survie des levures « modèles », le maintien de leur activité après passage dans des systèmes digestifs artificiels et leur activité in situ ont été démontrés dans le cadre de la présente invention. De telles capacités de survie et d'activité enzymatique se révèlent être très importantes si l'on veut utiliser des micro-organismes vivants comme médicament.
A ce titre, la méthode d'évaluation du devenir des micro-organismes médicaments dans l'environnement digestif humain est également un objet de la présente invention. Comme évoqué précédemment, l'un des principaux problèmes rencontrés dans la mise au point d'un médicament « vivant » réside dans sa sélection, dans l'évaluation de sa survie, de son activité et de son contrôle, au sein d'un environnement digestif. Pour contourner ces difficultés, la présente invention propose l'utilisation de systèmes digestifs artificiels reproduisant de la manière la plus fiable et la plus dynamique possible l'environnement digestif humain. Avantageux sur le plan technique, ces systèmes permettent le contrôle des principaux paramètres de la digestion et assurent la reproductibilité des conditions expérimentales, facteurs que l'on ne peut pas ou très difficilement maîtriser chez des animaux de laboratoire. De plus, ces systèmes permettent de réaliser des prélèvements à tout niveau du tractus digestif et de s'affranchir de toutes les contraintes d'éthique liées aux expérimentations animales ou humaines (molécules potentiellement toxiques). De tels systèmes donnent également la possibilité d'évaluer l'impact des micro-organismes génétiquement modifiés sur la flore endogène humaine (implantée dans le système digestif artificiel). Ainsi, les systèmes digestifs artificiels permettent de réaliser une sélection de microorganismes génétiquement modifiés, notamment de levures génétiquement modifiées, qui se sont non seulement adaptés à l'environnement digestif mais qui conservent une bonne capacité à exprimer un gène hétérologue d'intérêt.
Tout système digestif artificiel reprenant les caractéristiques essentielles du système digestif humain peut être utilisé dans le cadre de l'invention. Divers systèmes in vitro très simples (compartiments digestifs individualisés) ont été décrits. Leur utilisation est cependant limitée par la fragmentation des compartiments digestifs et l'absence de dynamisme. Il est donc avantageux d'utiliser le système digestif artificiel complet décrit dans WO 94/09895.
Un autre avantage de la présente invention provient de la formulation spécifique du médicament vivant de sorte à protéger les micro-organismes et à cibler spécifiquement une action dans telle ou telle partie du système digestif. Les micro-organismes, et plus particulièrement les levures, devant être actifs au niveau du tractus gastro-intestinal, la voie d'administration est la voie orale ou rectale. Les micro-organismes recombinés doivent être administrés sous une forme galénique permettant à la fois de les véhiculer jusqu'à leur lieu d'action, de les maintenir dans un état actif et de les protéger de l'environnement extérieur. Les artifices ou procédés galéniques utilisés pour atteindre ces objectifs sont différents selon la sensibilité des micro-organismes à l'environnement digestif et selon les lieux où ils auront à réaliser leur activité (niveau du tractus gastro-intestinal). Parmi les procédés galéniques utilisés, on peut citer : la lyophilisation des micro-organismes et de leur milieu nutritif, l'encapsulation des micro-organismes ou l'enrobage du système galénique les renfermant à l'aide de polymères sensibles au pH ou possédant des propriétés muco- adhésives, le mélange avec des polymères présentant des propriétés muco-adhésives, la compression des micro-organismes en présence d'excipients possédant des propriétés muco-adhésives, leur incorporation dans des gels hydrophiles ou lipophiles. Les systèmes galéniques qui en résultent sont des formes monolithiques de type comprimés monocouche ou multicouches, de type capsule de gélatine (dure ou molle) ou des formes multiparticulaires de type microgranules ou microcapsules. Ces formes permettent une libération normale ou différée des micro-organismes au sein du tractus digestif. DESCRIPTION
Micro organismes
Ainsi, dans un premier aspect, la présente invention se rapporte à des microorganismes comportant au moins un fragment d'ADN hétérologue comprenant un ou plusieurs gènes d'intérêt capables de s'exprimer dans l'environnement digestif. Avantageusement, lesdits micro-organismes sont également caractérisés en ce qu'ils peuvent survivre dans l'environnement digestif pendant au moins 6h, lOh ou 12h dans l'estomac et l'intestin grêle et/ou au moins 12h, 24h, 60h ou 72h dans le côlon.
En effet, dans les systèmes digestifs artificiels décrits ci-après, on obtient des microorganismes dont le taux de survie est supérieur à 25%, 50%, 75%, 80%, de préférence 90 % ou 95 % en sortie de l'iléon après 6 h de digestion et est supérieur à 2 %, 4%, de préférence 8% après 12 h de fermentation dans le côlon. Ces mesures peuvent être aisément effecmées par dénombrement à partir d'échantillons facilement prélevables dans les systèmes digestifs artificiels, à tout moment de la digestion ou de la fermentation.
De préférence, les micro-organismes mentionnés ci-dessus sont capables d'effectuer soit une réaction de bioconversion, soit la sécrétion d'un peptide d'intérêt ou d'une protéine dans tous les compartiments digestifs.
Dans le cadre de l'invention, on choisit des levures, de préférence des levures sélectionnées parmi Saccharomyces cerevisiae, S boulardii, S uvarum, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis et Yarrowia lipolitica. On peut également choisir des bactéries telles que les lactobacillus décrites dans Fahl et al (WO 99/27953).
Gènes d'intérêt
On entend par gènes d'intérêt des gènes codant pour des peptides à intérêt vaccinal, des peptides à intérêt hormonal (tel l'insuline), des peptides à intérêt thérapeutique (comme les anti-protéases, les facteurs de coagulation), des peptides à effet antibiotique, des peptides capables de piéger ou de complexer des molécules, des enzymes ou tous peptides possédant des activités de bioconversion, notamment des enzymes de détoxication ou sécrétés dans l'environnement digestif. Dans le sens de l'invention, les termes polypeptides, peptides ou protéines pourront être employés indifféremment les uns des autres et ne constituent en aucun cas une limitation à une taille donnée.
Les gènes d'intérêt seront choisis de préférence parmi les enzymes du métabolisme des xénobiotiques, à savoir des enzymes de phase I (P450 1A1, 1A2, 1B1, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, 3A5 et 73A1), des enzymes d'environnement de phase I (NADPH-cytochrome P450 réductase et cytochrome b5), des enzymes de phase II telles que la glutathion S-transférase (GST), la N-acétyl transférase (NAT), la quinone réductase (QR), l'aldéhyde deshydrogénase (ALDH), l'uridine diphosphoglucuronosyl transférase (UGT), la sulfotransférase, l'epoxide hydrolase et la O-acétylase et des enzymes de phase III (pompes transporteurs ABC, en particulier les pompes multidrug résistant MDR).
La glutathion S-transférase est une superfamille de gènes composée de 4 principales classes : alpha (GSTZ), mu (GSTM), pi (GSTP) et teta (GSTT). Ces enzymes jouent un rôle essentiel dans la résistance cellulaire contre la peroxidation lipidique, les dommages de l'ADN et l'alkylation des protéines causés par des espèces chimiques électrophiles. Elles catalysent la liaison de nombreux xénobiotiques électrophiles au glutathion et sont impliquées dans la détoxication des radicaux oxygénés. Les différentes classes de GST sont présentes en grandes quantités dans de nombreux tissus, avec une certaine spécificité de tissus selon la classe considérée.
Les gènes codant pour ces différentes enzymes ont été localisés sur les chromosomes humains. Différents polymorphismes ont été mis en évidence, notamment concernant le gène codant pour la GSTM1. En effet, trois allèles différents de GSTM1 ont été identifiés : les allèles GSTM1A et GSTM1B codent pour des enzymes d'activité similaire alors que l'allèle GSTMIO code pour une enzyme non fonctionnelle. Dans la plupart des populations étudiées au niveau mondial, 35% à 50% des sujets sont homozygotes pour l'allèle GSTMIO et sont donc dépourvus de l'activité enzymatique correspondante. A cause de cette défaillance de leur système de détoxication, les individus de génotype GSTM 10/0 sont considérés comme des individus à risque lorsqu'ils sont exposés à des niveaux élevés de cancérigènes et de produits chimiques toxiques. En effet, la déficience en GSTM1 est associée avec une augmentation du risque du cancer (principalement cancers des poumons et de la vessie) et de certaines maladies chroniques (endométriose, bronchite chronique...).
Deux N-acétyltransférases (NAT1 et NAT2) ont été identifiées, catalysant des réactions de N-acétylation d'arylamines, ainsi que d'autres réactions de détoxication. Elles sont également impliquées dans le métabolisme de médicaments tels que les sulphonamides et dans les interactions médicamenteuses. Les variations existant dans l'activité des NAT correspondent à leur capacité à transférer l'acétate de l'acétyl coenzyme A au substrat. Seul le gène de NAT2 présente un polymorphisme permettant la différenciation entre acétylateur lent (SA) et acétylateur rapide (RA). Les études disponibles suggèrent que l'acétylation lente est plus un facteur de risque que l'acétylation rapide. En effet, le phénotype SA est considéré comme un facteur de risque pour le cancer de la vessie. De plus, les femmes ménopausées avec le phénotype SA ont 4 fois plus de risque de développer le cancer du sein que les femmes avec le phénotype RA.
Construction de micro-organismes recombinés : par exemple les levures
Des souches de S. cerevisiae ont été développées permettant l'expression de trois grands types de gènes intervenant dans les différentes phases du métabolisme des xénobiotiques. Dans ce cadre, une série de cassettes d'expression pour des gènes de mammifères (homme, souris, lapin) ou de plantes (topinambour par exemple) a été réalisée, cassettes portées par des vecteurs multi-copies autonomes ou intégrées dans l'ADN chromosomique des levures. Pour exemple, les P450 humains exprimés dans les levures sont les isoenzymes 1A1, 1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, 3A5, 19A.
Parallèlement, ont été développées des coexpressions de gènes de phase I, d'« environnement de phase I » (NADPH-cytochrome P450 réductase et cytochrome b5 par exemple) et de phase IL L'efficacité de ces constructions a été démontrée. Pour exemple, les trois étapes de biotransformation du benzo(a)pyrène impliquant le P450
I Al, la NADPH-cytochrome P450 réductase et l'époxide hydrolase ont été reproduites chez la levure S cerevisiae : l'analyse des produits d'incubation du benzo(a)pyrène avec ces levures recombinées montre la formation de l'ensemble des métabolites attendus (Gautier et al., 1996b).
De tels systèmes peuvent être utilisés comme modèle pour l'étude de certains aspects du métabolisme humain, comme aide à l'analyse de la toxicité des polluants et surtout comme outil de bioconversion.
II est possible, après conception de marqueurs de sélection et de contrôle de viabilité de types tout à fait originaux, de démontrer et contrôler la survie, et lorsque nécessaire la mort et l'élimination, de levures recombinantes fonctionnelles dans l'environnement digestif humain. II est possible d'identifier et de créer par ingémerie moléculaire des structures de contrôle des gènes hétérologues (séquences promotrices en particulier), permettant une activité adaptée et modulable dans l'environnement digestif humain. A des fins d'expression du gène d'intérêt, on peut utiliser des promoteurs constitutifs ou inductibles, des promoteurs forts, des promoteurs actifs spécifiquement dans un segment du tracms digestif en conditions d'aérobie, de semi anaérobie ou d'anaérobie, des promoteurs régulables par une molécule introduite dans le milieu intestinal. Il est possible de développer une technologie d'ingénierie génétique respectant les critères indispensables pour une utilisation in vivo chez l'homme, en particulier l'absence de vecteurs mobilisables, l'absence de marqueurs de résistance aux antibiotiques, une stabilité génétique conditionnelle des fonctions hétérologues permettant leur destruction par un facteur chimique externe si nécessaire (interruption du traitement par exemple).
Le fragment d'ADN hétérologue peut posséder en outre un marqueur génétique permettant la sélection ou la contre sélection ou un code bar génétique. Etude et sélection de micro-organismes recombinants par utilisation de systèmes digestifs artificiels
Dans un second aspect, l'invention se rapporte à un procédé d'étude, de contrôle, d'adaptation et/ou de sélection des micro-organismes recombinés décrits ci-dessus au moyen d'un système digestif artificiel.
Par système digestif artificiel, on entend tout dispositif reprenant les caractéristiques essentielles du système digestif humain.
On peut définir le système de digestion artificiel comme un dispositif réactionnel décrit dans WO 94/09895.
Ce système est le modèle le plus complet au niveau mondial à l'heure actuelle. En effet, il possède l'ensemble des compartiments du système digestif (estomac, duodénum, jéjunum, iléon et côlon, figures 1 et 2 ci-après) et reproduit le plus fidèlement possible l'environnement digestif de l'homme ou de l'animal monogastrique. Il prend en compte les paramètres essentiels de la digestion tels que les mouvements péristaltiques, les variations de pH au niveau gastrique et intestinal, la vidange gastrique et le temps de transit intestinal, les sécrétions gastriques, biliaires et pancréatiques, l'absorption des produits de digestion et de fermentation, l'absorption de l'eau, la microflore fécale (Minekus et al., 1995 et 1999). Un pilotage informatique du système permet un contrôle des paramètres en continu. Ce système permet de mimer différentes situations, aussi bien physiologiques que pathologiques. Il présente nombre d'avantages en terme de reproductibilité, contrôle des conditions expérimentales (difficiles à maîtriser chez les animaux de laboratoire), standardisation, fiabilité, rapidité, possibilité de collecter des échantillons à tout niveau du tractus digestif, tout en limitant grand nombre de contraintes techniques et de problèmes d'acceptabilité (impossibilité de réaliser des expériences avec des molécules potentiellement toxiques chez l'homme).
Concrètement, chaque compartiment est formé d'unités de verre contenant des parois internes flexibles. Un passage d'eau entre les parois flexibles et celles de verre permet de maintenir une température constante de 37°C et de mimer les mouvements péristaltiques (grâce à des variations de pression de l'eau). Les différents compartiments sont reliés entre eux par des valves péristaltiques, dont l'ouverture est pilotée par ordinateur (envoi ou non d'azote). Le passage du chyme d'un compartiment à un autre est contrôlé par la quantité de nourriture présente dans chaque compartiment (présence de capteurs de niveau). Une formule exponentielle est utilisée pour modéliser la vidange gastrique et iléale (Minekus et al., 1995) : f = l-2"(t/tl/2)β ; où f représente la fraction de repas délivrée, 11/2 le demi-temps de libération du repas, t le temps de libération du repas et β un paramètre décrivant l'allure de la courbe).
Le volume du contenu digestif est enregistré continuellement par un capteur de pression et maintenu constant par absorption d'eau au travers de fibres de dialyse grâce à une pompe.
L'estomac (TIM1)
On choisit la quantité de nourriture à introduire dans l'estomac artificiel et la durée de la digestion (Minekus et al., 1995). La pepsine est délivrée en continu grâce à une pompe. Le pH est continuellement réajusté avec de l'HCl ou de l'eau, de façon à suivre une courbe prédéterminée, établie selon des données in vivo.
L'intestin grêle (TIM1
On programme l'intestin grêle artificiel pour simuler un temps de transit le plus proche possible de celui observé in vivo. Le pH est maintenu à des valeurs les plus physiologiques possibles par du NaHCO3 (6,5 au niveau du duodénum, 6,8 au niveau du jéjumum et 7,2 au niveau de l'iléon). Au niveau du duodénum, des pompes apportent les enzymes pancréatiques (mélange de pré-enzymes qui seront activées par la trypsine) et les acides biliaires. L'absorption de l'eau et des produits de digestion est réalisée grâce à un système de dialyse fonctionnant avec des unités de fibres creuses, connectées au niveau du jéjunum et de l'iléon.
Le côlon (TIM2) Dans sa forme de base, le côlon artificiel est constitué d'une boucle où circule cycliquement une flore fécale préalablement installée. Il a été vérifié que la composition et l'activité fermentaire de cette microflore fécale, issue de selles de donneurs volontaires et implantée dans le système digestif, étaient bien représentatives de celles de la flore colique humaine et que cette flore se maintenait stable et fonctionnelle au cours du temps (Minekus et al., 1999).
Un flux d'azote permet de maintenir le système en anaérobie, condition contrôlée par un indicateur (solution de résazurine). Le milieu nutritionnel est stocké dans une unité de verre maintenue à 4°C où un influx d'azote permet son mélange permanent en anaérobie. Un ensemble de fibres de dialyse traversant tout le colon permet de mimer l'absorption de l'eau et des nutriments. Le pH est maintenu constant et ajusté à la valeur de 6,5 par une solution de NaOH (au lieu du bicarbonate in vivo). La production totale de gaz (comme le H2, le CO2 et le CH ) peut être déterminée par mesure de la quantité d'eau déplacée dans une bouteille de Mariotte. Les différents gaz, ainsi que les acides gras volatils produits (acétate, butyrate et propionate principalement), peuvent être analysés qualitativement et quantitativement par chromatographie en phase gazeuse.
Dans une forme plus élaborée, le côlon artificiel est constitué de trois sous-unités simulant les trois parties, proximale, transverse et distale où siègent des activités fermentaires différentes (associées à des pH différents).
Bien entendu, tout ou partie des systèmes digestifs artificiels précités peut être mise en œuvre dans le cadre de l'invention.
Ainsi, l'invention a trait à un procédé d'étude et de contrôle de micro-organismes comprenant les étapes consistant à : a) ajouter les micro-organismes selon l'invention dans un milieu nutritif liquide, b) introduire ledit milieu à l'entrée d'un système tel que défini ci-dessus, c) incuber et procéder à un dénombrement des micro-organismes recombinés et/ou à un test de l'activité du ou des gènes d'intérêt après passage dans les systèmes digestifs ou in situ. Par exemple, cette étape peut comprendre un test PCR. Le test d'activité peut comprendre un test de sécrétion et ou de bioconversion.
Dans un autre mode de réalisation, le procédé peut comprendre les étapes consistant à : a) ajouter les micro-organismes selon l'invention dans un milieu nutritif liquide, b) introduire ledit milieu à l'entrée d'un système tel que défini ci-dessus, c) incuber et récupérer les micro-organismes survivants après passage dans le TIM1 et/ou TIM2 ; - répéter éventuellement les étapes a) à c) jusqu'à l'obtention d'une population homogène de micro-organismes adaptés à l'environnement digestif et capables d'exprimer efficacement le ou les gènes d'intérêt.
L'invention se rapporte également à des micro-organismes susceptibles d'être obtenus par le procédé évoqué ci-dessus. Ces micro-organismes peuvent se caractériser en ce que leur taux de survie est supérieur à 25%, 50%, 75%, 80%, de préférence 90 % ou 95 % en sortie de l'iléon après 6 h de digestion et est supérieur à 2 %, 4%, de préférence 8% après 12 h de fermentation dans le côlon. De préférence, il s'agit de levures.
La survie des micro-organismes peut être appréciée par dénombrement. La présence du ou des gènes d'intérêt peut être mise en évidence par techniques moléculaires (pour exemple Polymerase Chain Reaction). L'expression du ou des gènes d'intérêt peut être estimée par les techniques biochimiques telles que l'électrophorèse mono ou bidimentionnelle ou le Western Blot. L'activité des produits d'expression du ou des gènes d'intérêt est appréciée par des techniques spécifiques (pour exemple dosage d'activité enzymatique).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention porte sur des micro-organismes capables d'effectuer une réaction de bioconversion ou de sécréter un peptide ou une protéine d'intérêt dans tous les compartiments digestifs. Méthode d'administration des micro-organismes
Des savoir-faire dans le domaine de la galénique et de la biopharmacie permettant d'optimiser l'administration des principes actifs par voie orale ont été développés. L'efficacité d'un médicament est conditionnée par sa biodisponibilité, c'est à dire la proportion de principe actif arrivant au niveau de la circulation générale, et selon quelle cinétique. L'un des buts de la formulation galénique est donc de réaliser une forme optimisée la mieux adaptée au traitement d'une maladie ou d'un syndrome déterminés, c'est à dire une forme présentant une administration aisée pour le patient et une bonne disponibilité.
Pour les principes actifs classiques (origine et nature chimique définies), la voie orale constitue une des voies d'apport privilégiée, par son administration commode et son faible coût. Les principes actifs ainsi administrés pourront être absorbés tout au long du tractus gastro-intestinal. Ils subiront éventuellement à ce niveau différentes biodégradations sous l'action des enzymes, des sucs digestifs et des variations de pH. La fraction absorbée au niveau du tractus digestif pourra atteindre le site d'action après passage par le foie et métabolisation éventuelle.
Contrairement, dans le cas des micro-organismes, ceux-ci ne seront pas absorbés par la muqueuse intestinale mais séjourneront au niveau du tractus un temps plus ou moins long afin d'exercer leur action au niveau de la cible définie. La forme galénique contenant les micro-organismes est une forme permettant de les amener intacts au niveau de la cible et de maintenir leur intégrité à ce niveau pendant un temps défini plus ou moins long. Dans ces conditions, les techniques utilisées avec les principes actifs classiques pour assurer une libération prolongée s'appliquent aux micro-organismes après adaptation de la technologie et des paramètres opératoires.
Toutes les précisions supplémentaires concernant ces formes galéniques sont disponibles dans EP 904021995 (formes galéniques améliorant la biodisponibilté), EP0542824 (formes muco-adhésives) et FR 9806958 (gel huileux et bigels). Ces différentes techniques ou procédés, ainsi que tout autre procédé de l'état de la technique d'enrobage et d'encapsulation, peuvent être appliqués aux micro-organismes de l'invention.
Pour les substances sensibles à l'humidité atmosphérique ou celles sensibles à l'oxydation par l'oxygène de l'air ambiant, la protection est nécessaire pour la préparation des formes galéniques (gélules, comprimés) afin de garantir leur conservation et maintenir leur activité thérapeutique. L'enrobage permet par dépôt direct d'agent protecteur (résine, polymère) de protéger le principe actif. Dans le cas des micro-organismes, en particulier les levures, selon l'invention, l'enrobage a pour but de les isoler du milieu extérieur hostile afin de les protéger des agressions des enzymes, du pH et des sucs présents au niveau digestif. Le résultat de l'enrobage est l'obtention d'une « sphère » ou microsphère dont le diamètre est directement proportionnel à la quantité de produit d'enrobage utilisé et à la taille du produit à enrober à l'origine. Les paramètres opératoires, le matériel technique et les adjuvants utilisés pour réaliser cet enrobage sont des facteurs importants pour l'obtention de microsphères présentant des caractéristiques définies. L'enrobage est soit un polymère sensible au pH et se solubilisant à un pH donné du tractus gastro intestinal, soit un polymère englobant les éléments nutritifs nécessaires à la survie des micro-organismes, soit un produit mucoadhésif facilitant la mucoadhésion des micro-organismes au niveau du tractus gastro-intestinal, soit une association de ces différents composés. Le résultat obtenu est constitué de microsphères qui sont ensuite conditionnées en capsules dures ou molles.
Ainsi, un autre aspect de l'invention porte sur une composition pharmaceutique comprenant les micro-organismes définis ci-dessus se trouvant avantageusement sous une forme galénique adaptée à une administration orale ou rectale de sorte à les acheminer intacts au niveau du site cible du tractus digestif et de maintenir leur intégrité à ce niveau pendant un temps donné.
Dans cette composition pharmaceutique, les micro-organismes, en particulier les levures, peuvent être protégés par une composition associée ou recouverte par un enrobage et/ou une membrane du type résine et/ou de type polymère formant des sphères, microsphères, granules ou microgranules.
De préférence, la composition se trouve sous la forme de gélules, de comprimés ou de dragées. La composition peut également être sous la forme d'une suspension cellulaire.
L'invention vise également un produit de combinaison comprenant les microorganismes décrits ci-dessus et une substance active ou un précurseur d'une substance active pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps. Ce produit se caractérise de préférence en ce que lesdit micro-organismes interagissent avec la substance active ou le précurseur. La substance active est destinée à favoriser l'action des micro-organismes recombinés (par exemple, il peut s'agir d'une substance favorisant la survie, la croissance ou l'activité des microorganismes) ou, à l'inverse, les micro-organismes agissent sur la substance active ou sur le précurseur.
Conclusion
Un autre aspect de l'invention se rapporte à l'utilisation de micro-organismes selon l'invention pour la préparation d'un médicament tel que des agents de détoxication, des agents de correction métabolique, des agents capables de modifier la flore intestinale, des agents capables d'augmenter la biodisponibilité d'une substance active ou de son précurseur et pour la préparation d'un médicament capable de fournir in situ des peptides actifs, des peptides à intérêt vaccinal, des peptides à intérêt hormonal, des peptides à intérêt thérapeutique, des peptides à effet antibiotique ou des peptides capables de piéger ou de complexer des molécules.
Légendes
Figures 1 et 2 : représentations schématiques des systèmes digestifs artificiels.
Figure 1 (estomac et intestin grêle artificiels ou TIM 1) Figure 2 (côlon artificiel ou TIM 2) Figure 3 : constructions génomiques et plasmidiques pour l'expression du gène du P450 1A1 humain et de la NADPH-cytochrome P450 réductase humaine (A) ou de levure (B) et pour l'expression du gène du P450 73 Al de topinambour et de la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure (C). A- La souche obtenue est appelée W(hR)pHl Al . B- La souche obtenue est appelée W(R)pHlAl. C- La souche obtenue est appelée W(R)pP73Al.
URA 3 : gène sauvage de l'orotate décarboxylase ; ADE 2 : gène sauvage de l'amino- imidazole ribonucléotide carboxylase ; ura 3 : gène muté de l'orotate décarboxylase ; Y red : P450 réductase de levure ; H red : P450 réductase humaine ; PGK phosphoglycérate kinase ; Y red ORF : séquence codante de la P450 réductase de levure ; H red ORF : séquence codante de la P450 réductase humaine ; H 1A1 ORF : séquence codante du P450 1A1 humain ; P 73A1 ORF : séquence codante du P450 73 Al de topinambour ; pro : promoteur ; ter : terminateur.
Figure 4 : cinétique de libération des levures recombinantes W(hR)pHlAl et W(R)pHlAl en sortie d'iléon.
Les résultats obtenus au cours de trois digestions dans le TIM1 sont présentés digestion par digestion (A) et moyennes (B).
Les résultats sont exprimés en taux cumulés de levures survivantes retrouvées en sortie d'iléon par rapport au nombre de levures ingérées. Soit, pour chaque prélèvement (t = 120, t = 240 et t = 360 min) correspondant à un intervalle de temps de collecte des sorties iléales cumullées (0-120 min, 120-240 min et 240-360 min), le nombre total de levures est énuméré et exprimé en pourcentage du nombre total de levures ingérées. Ces pourcentages sont ensuite cumulés au cours du temps.
Le facteur de dilution dû au volume des sécrétions digestives est pris en compte dans les calculs.
Figure 5 : suivi des levures recombinantes W(hR)pHlAl et W(R)pHlAl dans le côlon artificiel. Différents prélèvements ont été effectués afin de pouvoir réaliser un suivi des levures dans le TIM 2 :
- à t = 0, on énumère le nombre de cellules par ml de suspension de levures recombinantes, avant introduction dans le côlon,
- à t = Ofec : on énumère le nombre de cellules de levures endogènes par ml de contenu colique, avant ensemencement du côlon,
- à t = 1, t = 12, t = 24, t = 36, t = 48 et t = 60h : on énumère le nombre de cellules de levures (recombinantes et endogènes) par ml de contenu colique prélevé dans le côlon. Les résultats obtenus sont exprimés en nombre de cellules par ml (échelle logarithmique) en prenant en compte le facteur de dilution dû au volume du contenu colique.
Figure 6 : résultats des PCR réalisées sur les souches W(R)pHlAl et W(hR)pHlAl avant passage dans les systèmes digestifs (A), à la sortie de l'intestin grêle (B) et du côlon (C)
A : avant passage dans les systèmes digestifs (t =0min) B : à la sortie de l'intestin grêle (t = 120 min) C : à la sortie du côlon (t = 12h)
Figure imgf000023_0001
T = Témoin
Figure 7 : suivi des levures (R)pP73Al dans les différents compartiments du TIM 1 (7A : estomac, 7B : duodénum, 7C : jéjunum, 7D : iléon) Les levures W(R)pP73Al ont été suivies au sein de chaque compartiment digestif au cours de digestions dans le TIM1 (n=3). Pour ce faire, des prélèvements de 1 ml sont réalisés dans l'aliment avant son introduction dans l'estomac (t = 0), puis à différents niveaux du tractus digestif : dans l'estomac au bout de 15, 30, 45, 60 et 90 min de digestion, dans le duodénum au bout de 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120 et 150 min de digestion, dans le jéjunum au bout de 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 et 240 min de digestion, dans l'iléon au bout de 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 et 240 min de digestion. Le nombre de levures présentes dans chaque prélèvement est exprimé en pourcentage du nombre total de levures ingérées. Les courbes de suivi des levures recombinées dans chaque compartiment ont été comparées à celles d'un marqueur de transit non absorbable.
Figure 8 : cinétique de libération des levures recombinantes W(R)pP73Al en sortie d'iléon
Les résultats sont exprimés en taux cumulés de levures survivantes retrouvées en sortie d'iléon par rapport au nombre de levures ingérées (n=3). Soit, pour chaque prélèvement (t=30, 45, 60, 90, 120, 180 et 240 min) correspondant à un temps de collecte des sorties iléales cumulées (0-30 min, 30-45 min, 45-60 min, 60-90min, 90-120 min, 120- 180 min et 180-240 min), le nombre total de levures est énuméré et exprimé en pourcentage du nombre total de levures ingérées. Ces pourcentages sont ensuite cumulés au cours du temps. Le facteur de dilution dû au volume des sécrétions digestives est pris en compte.
Figure 9 : suivi des levures recombinantes W(R)pP73Al dans le côlon artificiel
Différents prélèvements ont été effectués dans le TIM2 afin de pouvoir réaliser un suivi des levures dans l'environnement colique :
- à t=0, on énumère le nombre de cellules par ml de suspension de levures, avant leur introduction dans le côlon, - toutes les heures jusqu'à 12h, on énumère le nombre de cellules de levures par ml de contenu colique prélevé dans le côlon. Les résultats obtenus sont exprimés en pourcentage du nombre de levures introduites dans le côlon, en prenant en compte le facteur de dilution dû au volume du contenu colique. Figure 10 : cinétique de transformation de l'acide tfrαns^cinnamique en acide p- coumarique par les levures W(R)pP73Al, dans l'ensemble du TIM 1 (A) et dans les différents compartiments digestifs du TTM1 (B)
Afin de pouvoir suivre la réaction de conversion de l'acide trα -cinnamique en acide 7-coumarique, des prélèvements sont réalisés tout au long de long de la digestion dans les différents compartiments digestifs du TIM 1 (n=3). Des prélèvements sont ainsi effectués dans l'estomac au bout de 15, 30, 45, 60 et 90 min de digestion, dans le duodénum au bout de 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120 et 150 min de digestion, dans le jéjunum au bout de 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 et 240 min de digestion, dans l'iléon au bout de 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 et 240 min de digestion et dans les sorties iléales cumulées sur 0-30 min, 30-45 min, 45-60 min, 60-90 min, 90-120 min, 120-180 min et 180-240 min à 30, 45, 60, 90, 120, 180 et 240 min.
La figure 10A présente un bilan de la réaction de bioconversion dans l'ensemble du TIM 1 (n=3). La production d'acide jp-coumarique est exprimée en % de l'acide trans- cinnamique introduit dans l'estomac.
La figure 10B représente la production d'acide /?-coumarique (exprimée en % de l'acide trαw-cinnamique introduit dans l'estomac) dans les différents compartiments du TIM1 (estomac, duodénum, jéjunum et iléon), au cours de digestions (n=3).
Figure 11 : constructions de plasmides permettant la sécrétion par des levures S. cerevisiae , soit d'un peptide "taggé"(A), soit d'une protéine "taggée"(B) A : Le plasmide obtenu est appelé ppV5H6. B : La plasmide obtenu est appelé ppGSTV5H6. PGALl : promoteur fort inductible par le galactose ; CYCl TT : terminateur du gène CYCl ; pUC ori : origine de réplication pUC permettant la maintenance et la réplication du plasmide chez les bactéries ; 2μ origin : origine de réplication 2μ permettant la maintenance et la réplication du plasmide chez la levure ; Ampicillin : gène de résistance à l'ampicilline servant de marqueur de sélection chez la bactérie; URA 3 : marqueur d'auxotrophie permettant la sélection des levures transformées ; BamHl : site de coupure de l'enzyme de restriction BamHl ; EcoRl : site de coupure de l'enzyme de restriction EcoRl ; Pre : séquence pre, permettant l'adressage du peptide α vers le réticulum endoplasmique ; Pro : séquence pro permettant une sécrétion efficace du peptide α ; KR : site de coupure de la protéase Kex2 (acides aminés lysine-arginine) ; GST : Glutathion-S-transferase; V5 : épitope V5; H6 : chaîne polypeptidique de 6 histidines ; Stop : codon stop.
Figure 12 : détection des produits de sécrétion des souches WppVsH6 (A) et WpGSTV5H6 (B) en erlen-Meyer
Les Western-Blot obtenus avec les souches WppN5H6 et WpGSTN5H6 sont représentés en figure 12A et 12B respectivement. Des prélèvement ont été réalisés dans la culture de croissance et dans la culture d'induction, 0, 2, 4 et 6h après ajout de galactose. Les échantillons sont notés "expo" lorsque la culture d'induction a été ensemencée à faible densité cellulaire et "stat" lorsqu'elle a été ensemencée à haute densité. Les protéines du surnageant sont précipitées, séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et analysées par Western-Blot (anti-corps anti-V5). Pour chaque échantillon, on dépose les protéines du surnageant correspondant à un volume de culture contenant 5*10 levures (sauf l'échantillon B6 qui correspond à 4* 10 cellules).
Al : peptide- V5H6, témoin culture de croissance; A2 : peptide- V5H6, tO culture d'induction ; A3 : peptide-N5H6, expo t2h ; A4 : peptide-N5H6, stat t2h ; A5 : peptide- V5H6, expo t4h ; A6 : peptide- V5H6, stat t4h ; A7 : peptide-V5H6, expo t6h ; A8 : peptide- V5H6, stat t6h.
Bl : GST-N5H6, témoin culture de croissance ; B2 : GST-N5H6, tO culture d'induction ; B3 : GST-V5H6, expo t2h ; B4 : GST-V5H6, stat t2h ; B5 : GST-V5H6, expo t4h ; B6 : GST-V5H6, stat t4h (4*108 cellules) ; B7 : GSTN5H6, stat t4h (5*107 cellules) ; B8 : GST-N5H6, expo t6h ; B9 : GST-V5H6, stat t6h. a) peptide- V5H6 (PM calculé : 5.7 kDa), b) précurseur du peptide-N5H6 (PM calculé : 16 kDa), c) formes glycosylées du peptide-V5H6 ou de son précurseur, d) formes hyperglycosylées du peptide- V5H6 ou de son précurseur, e) GST-V H6 (PM calculé : 29.7 kDa), f) précurseur de la GST-V5H6 (PM calculé : 40 kDa), g) formes glycosylées ou hyperglycosylées de la GST-V5H6 ou de son précurseur. Figure 13 : Détection, dans les différents compartiments du TIM1, du peptide "taggé" sécrété par la souche ppVsH6
La figure 13 représente les Western-Blot obtenus après analyse des échantillons prélevés dans les différents compartiments du TIM 1. Un témoin positif a également été réalisé en Erlen-Meyer (échantillons notés "témoin"). La totalité des protéines contenues dans le surnageant des échantillons a été déposée (correspondant à un volume de 4 ml dans l'estomac et le duodénum et 2 ml dans l'aliment, le jéjunum et l'iléon).
1 : Aliment ; 2 : Témoin t90 min ; 3 : Estomac t90 min ; 4 : Duo t90 min ; 5 : Jej t90 min ; 6 : Ile t90 min ; 7 : Esto tl20 min ; 8 : Vide ; 9 :Témoin tl60 min ; 10 : Duo tl60 min ; 11 : Jej tl60 min ; 12 : Ile tl60 min ; 13 : Duo t210 min ; 14 : Jej t210 min ; 15 : Ile t210 min ; 16 : Ile t270 min ; 17 : Témoin t270 min.
Figure 14 : Détection, dans les différents compartiments du TIM1, de la protéine GST "taggée" sécrétée par la souche WppGSTV5H6
La figure 14 représente les Western-Blot obtenus après analyse des échantillons prélevés dans les différents compartiments du TIM 1. Un témoin positif a également été réalisé en Erlen-Meyer (échantillons notés "témoin"). La totalité des protéines contenues dans le surnageant des échantillons a été déposée (correspondant à un volume de 4 ml dans l'estomac et le duodénum et 2 ml dans l'aliment, le jéjunum et l'iléon).
1 : Témoin t90 min ; 2 : Estomac t90 min ; 3 : Duo t90 min ; 4 : Jej t90 min ; 5 : Ile t90 min ; 6 : Vide ; 7 : Duo tl60 min ; 8 : Jej tl60 min ; 9 : Ile tl60 min ; 10 : Témoin culture de croissance ; 11 : Témoin tO min ; 12 : Aliment ; 13 : Témoin 160 min ; 14 : Duo 1210 min ; 15 : Jej t210 min ; 16 : Ile t210 min ; 17 : Ile t270 min ; 18 : Témoin t270 min.
Figure 15 : Quantification de la GST "taggée", sécrétée dans le TIM 1 par la souche WppGSTVsH6 Afin d'apprécier de façon approximative la quantité de GST sécrétée dans l'environnement digestif, nous avons comparé l'intensité des signaux de détection d'une gamme étalon avec celle d'échantillons issus du TIM 1. 20 ng, 10 ng et 1 ng de GST pure à 85 % ont ainsi été déposés sur le même gel que les protéines d'échantillons issus de prélèvements dans le TIM 1.
1 : Témoin culture de croissance ; 2 : Aliment ; 3 : Esto 120 min ; 4 : Duo t90 min ; 5 : Jej 190 min ; 6 : Ile t90 min ; 7 : GST 20 ng ; 8 : GST 10 ng ; 9 : GST 1 ng ; 10 : GST 20 ng ; 11 : GST 10 ng ; 12 : GST 1 ng ; 13 : Jej 160 min ; 14 : Ile 160 min ; 15 : Duo tl60 min ; 16 : Duo t210 min ; 17 : Jej t210 min ; 18 : Ile 210 min.
Exemple 1 : La levure Saccharomyces cerevisiae comme système d'expression des P450 humains.
S. cerevisiae a été le premier système utilisé pour l'expression d'un P450 de rat (Oeda et al., 1985). Depuis, elle a été largement utilisée comme système d'expression hétérologue dans de nombreux laboratoires. En particulier, l'équipe du Dr Denis Pompon l'a choisie comme modèle d'étude pour l'expression de P450 humains (isoenzymes 1A1, 1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, 3A5, 19A).
Utiliser les levures comme hôte pour l'expression hétérologue de P450 présente de nombreux avantages. En effet, les levures possèdent les critères nécessaires à la synthèse de P450 humains fonctionnels (Urban et al., 1994a ; Pompon et al., 1997). Elles présentent l'architecture intracellulaire et la majorité des modifications post- traductionnelles des cellules eucaryotes, ainsi qu'un système d'adressage des protéines ("Signal Récognition Particule" ou SRP) permettant la translocation du P450 synthétisé vers le réticulum endoplasmique, ce qui aboutit à une localisation intracellulaire et un repliement du P450 corrects. Les levures possèdent également un environnement membranaire lipidique permettant la stabilité du P450 et des protéines de transfert d'électrons (NADPH- cytochrome P450 réductase et cytochrome b5) dans la membrane du réticulum endoplasmique, nécessaires à l'activité enzymatique du P450. L'introduction dans les levures de cassettes d'expression peut être menée de deux manières : sur plasmide ou par intégration génomique.
En outre, les levures permettent de coexprimer de façon stable plusieurs ADN complémentaire (ADNc) différents et les techniques mises en oeuvre sont de faible coût et sans risque.
La levure S.cerevisiae permet la caractérisation d'activités monooxygénases humaines (Urban et al., 1994a ; Gautier, 1994), à savoir :
- l'étude de la spécificité de substrat dans un contexte exempt d'activité monooxygénase contaminante (S cerevisiae contient des P450 endogènes faiblement exprimés dont l'activité ne risque pas d'interférer avec celle du P450 humain),
- l'étude de la diversité génétique et du polymorphisme enzymatique (possibilité d'exprimer des formes de P450 peu abondantes),
- l'étude de la relation structure / fonction par mutagénèse dirigée et par fabrication de protéines de fusion (recherche des acides aminés impliqués dans un aspect particulier de la fonction du P450 humain).
Malgré les avantages précédemment énumérés, l'utilisation des levures comme système d'expression hétérologue (Urban et al., 1994a; Pompon et al., 1996) présente quelques limites :
- les fractions subcellulaires sont difficiles à préparer à cause de la paroi très résistante des levures, - le niveau de la NADPH-cytochrome P450 réductase endogène est faible, ce qui limite l'activité du P450 exprimé,
- les enzymes NADPH-cytochrome P450 réductases de levure et d'homme présentent une faible similarité de séquences (33%), ce qui diminue l'efficacité de couplage entre les P450 humains et la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure, - la production de P450 humains (entre 50 et 500 pmol de P450 par mg de protéines microsomales) est plus faible que chez la bactérie E coli (de l'ordre du nmol/mg) mais cet inconvénient est largement compensé du fait que, contrairement à la bactérie, les levures produisent des P450 fonctionnels.
Afin de pallier au mieux à certaines de ces limites (Urban et al., 1994a ; Pompon et al., 1995) différents systèmes d'expression ont été développés : - Les systèmes de première génération : optimisation de l'expression du P450 humain.
Une cassette d'expression, insérée dans un plasmide, permet la production d'un P450 humain. Pour obtenir un niveau d'expression suffisant, les séquences 5' et 3' non codantes de l'ADNc ont été délétées avant insertion dans les levures. De plus, le promoteur fort GAL10-CYC1 (totalement réprimé par le glucose mais fortement inductible par le galactose) a été introduit dans le but de séparer la phase de croissance exponentielle, requise pour constituer la biomasse, de la phase d'expression.
- Les systèmes de deuxième génération : optimisation de l'activité spécifique du P450 humain.
Plusieurs types de modifications génomiques ont été réalisées pour augmenter l'activité spécifique du P450 de 10 à 100 fois celle obtenue avec les systèmes de première génération :
- la construction d'une protéine de fusion entre le P450 humain et la NADPH- cytochrome P450 réductase de levure,
- la surexpression de la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure, mise sous le contrôle du promoteur GAL10-CYC1,
- la coexpression du cytochrome b5 humain et du P450 humain.
La coexpression d'enzymes de phase II (comme l'époxide hydrolase) et du P450 humain a également permis de simuler des couplages métaboliques entre les enzymes de phase I et de phase II (Gautier et al, 1993).
- Les systèmes de troisième génération : "humanisation" de l'environnement redox. Au niveau du génome, la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure a été remplacée par une réductase humaine, ce qui a provoqué une forte augmentation de l'activité spécifique du P450 humain xlO à 500 par rapport aux systèmes de première génération.
Exemple 2 : Obtention des souches de levures recombinantes W(hR)pHlAl, W(R)pHlAl et W(R)pP73Al
La souche de S cerevisiae W(hR)pHlAl (figure 3A) dérive de la souche W(hR). Les deux souches W(R)pHlAl (figure 3B) et W(R)pP73Al (figure 3C) dérivent de la souche W(R).
La construction des souches W(R) et W(hR) ont été respectivement décrites par Truan et al. (1993) et Urban et al. (1993).
Des modifications génomiques ont ainsi permis la construction des souches W(R) et
W(hR) à partir de la souche de laboratoire W3031B (signe sexuel MAT a), qui possède des mutations sur certains gènes (leu 2, his 3, trp 1, ura 3, ade 2), permettant ainsi sa sélection par auxotrophie. Souche W(R) : la phase ouverte de lecture de la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure (2072 pb) a été surexprimée par insertion du promoteur fort GAL10-CYC1
(480 pb) à la place du promoteur de la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure.
Le terminateur du gène de la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure a été conservé. Souche W(hR) : la phase ouverte de lecture de la NADPH-cytochrome P450 réductase humaine (2034 pb) a été insérée dans le génome de la levure à la place de celle de la
NADPH-cytochrome P450 réductase de levure et placée sous le contrôle du promoteur fort GAL10-CYC1. Le terminateur du gène de la NADPH-cytochrome P450 réductase de levure a été conservé.
Les deux souches W(hR)pHlAl et W(R)pHlAl résultent respectivement de la transformation de W(hR) et W(R) avec le plasmide pi Al.
Le plasmide pi Al (Voir figure 3) résulte de l'insertion dans le plasmide pV60 de la séquence codant pour le P450 1A1 humain (1539 pb), placée entre le promoteur fort GAL10-CYC1 et le terminateur du gène de la phosphoglycérate kinase (PGK). Il contient le gène codant pour la β-lactamase qui confère la résistance à l'ampicilline chez E coll.
Ce plasmide peut se maintenir dans les levures grâce aux marqueurs d'auxotrophie
URA 3 et ADΕ 2 qui complémentent les gènes correspondant déficients dans le génome des levures. L'addition du marqueur d'auxotrophie ADΕ 2 permet une meilleure stabilité du vecteur lorsque les levures transformées sont cultivées dans un milieu de culture devenant spontanément limitant en adénine à haute densité cellulaire. Le plasmide peut se multiplier dans les bactéries grâce à une origine de réplication d'E coli et dans les levures grâce à un fragment de l'origine de réplication du plasmide 2μ.
Transformation des deux souches W(hR) et W(R) avec le plasmide plAl
Le protocole de transformation des levures, adapté de Gietz et al. (1992), nécessite dans un premier temps de rendre les levures compétentes. A cet effet, les souches W(R) et W(hR) sont mises en culture dans du milieu YPGA (glucose 20 g/1, yeast extract 10 g/1, bactopeptone 10 g/1 et adénine 20 mg/1) jusqu'à atteindre une DO6oonm entre 0,5 et 2. Après centrifugation (6000 g, 3 min, 20°C), le culot cellulaire est lavé deux fois avec 25 ml d'eau distillée stérile, puis une fois avec 2 ml de tampon Tris-HCl 100 mM, ΕDTA 1 mM, acétate de lithium 0,1 M. Le culot cellulaire est repris dans 1 ml de ce même tampon. Ensuite, afin de procéder à la transformation des levures, sont mélangés l'aliquot du vecteur transformant pi Al, 50 μg d'ADN dénaturé de sperme de saumon, 100 μl des levures compétentes et 300 μl d'une solution de PEG-4000 à 40% dans le tampon Tris-HCl 100 mM, EDTA ImM, acétate de lithium 0,1 M. Le mélange est incubé 30 min à 28°C puis 15 min à 42°C. Après centrifugation (11000 g, 3 min, 20°C), le culot cellulaire est repris dans 100 μl de liquide de Ringer. Les 100 μl sont étalés sur du milieu SGI (glucose 20 g/1, yeast nitrogen base 7g/l, bactocasamino acids lg/1, tryptophane 20 mg 1 et agar 20g/l). Les boîtes sont incubées 2 à 3 jours à 30°C.
De la même façon, la souche W(R)pP73Al résulte de la transformation de la souche W(R) avec le plasmide pV60 dans lequel le gène de la cinnamate 4-hydroxylase de topinambour ou P450 73A1 (plasmide appelé p73Al - cf. Figure 3) a été inséré (Urban
Figure imgf000032_0001
Exemple 3 : Exemple de protocole de digestion dans les systèmes digestifs TIM1 et TIM2 (protocole modifié de WO 94/09895)
A Digestion dans l'estomac et l'intestin grêle artificiels ou TIM 1 (voir figure 1)
Le temps de digestion, variable, est programmé entre 240 et 360 minutes. Solutions utilisées pendant la digestion
Différentes solutions simulant les sécrétions stomacales et intestinales sont préparées et conservées dans la glace pour celles contenant des enzymes. Toutes les solutions sont préparées avec de l'eau déminéralisée. - les solutions simulant les sécrétions de l'estomac :
* le jus gastrique : NaCI 53 mM, KC1 15 mM, CaCl2 1 mM et NaHCO3 7mM, pH 4, auxquels on rajoute de la pepsine à raison de 588 U/ml,
* la lipase : NaCI 53 mM, KC1 15 mM, CaCl2 1 mM et NaHCO3 7mM, pH 4, auxquels on rajoute de la lipase à raison de 37.5 U/ml, * de l'HCl 1M afin que le pH suive dans l'estomac une courbe prédéterminée. - les solutions simulant les sécrétions de l'intestin grêle :
* la solution de pancréatine à 7%,
* la solution de bile à 4% (pour les 30 premières minutes de la digestion) et à 2% (pour le reste de la digestion), * la solution d'électrolytes IX : NaCI 86 mM, KC1 8 mM et CaCl2 2 mM,
* du NaHCO3 1M ou de la solution d'électrolytes IX afin de maintenir le pH à 6,5 au niveau du duodénum, à 6,8 au niveau du jéjunum et à 7,2 au niveau de l'iléon.
Digestion Préalablement à l'aliment, sont introduits dans les différents compartiments du système digestif les résidus simulant ce qui reste en moyenne chez un individu à jeun : le résidu gastrique (jus gastrique ajusté à pH 2 et préincubé 15 min à 37°C), le résidu duodénal (bile 2%, pancréatine 1,75%, solution d'électrolytes 0,25X de l'intestin grêle et trypsine 7773 U/ml, préincubé 10 min à 37 °C) et les résidus jéjunal et iléal (solution d'électrolytes IX de l'intestin grêle).
Les fluides de dialyse pour le jéjunum (bile 1,55%, KC1 8 mM, NaCI 86 mM) et l'iléon (électrolytes IX) sont maintenus à 37°C pendant le temps de la digestion et circulent à un débit de 10 ml/min (fibres de dialyse: COBE, HG-400, seuil = 8000 Da). La souche de levure étudiée, remise en suspension dans 300 ml de lait demi-écrémé ou de milieu de culture YPL (yeast extract 10g/l, bactopeptone 10 g/1, galactose 20g/l), est introduite dans l'estomac. Les levures sont préparées comme décrit dans les exemples 4 et 5.
Cinétique
Les solutions simulant les différentes sécrétions sont délivrées selon une cinétique préétablie en fonction des paramètres in vivo :
* au niveau de l'estomac : le jus gastrique et la lipase sont délivrés à un débit de 0,25 ml/min, 1ΗC1 est introduit à un débit de 0,25 ml/min si nécessaire.
* au niveau du duodénum : les solutions de pancréatine à 7% est délivrée à un débit de 0,25 ml/min, la solution de bile (à 4 ou à 2%) à un débit de 0,5 ml/min, le NaHCO3 1M et la solution d'électrolytes IX à un débit total de 0,25 ml/min.
* au niveau du jéjunum et de l'iléon : le NaHCO3 1M est introduit à un débit de 0,25 ml/min, si nécessaire.
Les courbes de vidange gastrique et iléale, sont modélisées par la formule f = l-2'(t/tl 2)β , où tl/2 est le temps de demi- vidange et β un paramètre définissant l'allure de la courbe.
B Fermentation dans le côlon artificiel ou TIM 2 (voir figure 2)
Après une phase de stabilisation de la flore de 2 jours, la fermentation peut être maintenue jusqu'à une semaine après ensemencement du côlon.
Ensemencement du côlon
Toutes les étapes de l'ensemencement sont réalisées sous flux d'azote.
200 g de fèces fraîches (issus de volontaires sains) sont mixés dans 200 ml de tampon phosphate 0,1 M à pH 6,5, préalablement autoclave et placé sous flux d'azote pendant au minimum 2 h. Le mélange obtenu est filtré sur gaze stérile. Le filtrat est centrifugé
(25000g, 30 min, 4°C). Le culot bactérien et le mucus sont repris dans du milieu de base (Ileum delivery médium) lui-même dilué 10 fois dans le tampon phosphate 0,1 M.
Environ 10g de rétentat de filtration sont ajoutés à cette solution bactérienne afin de l'enrichir en fibres. Le mélange est mixé à nouveau puis introduit dans le côlon à l'aide d'une seringue. Solutions utilisées pendant la fermentation
Différentes solutions entrant dans la constitution du milieu nutritif de la flore fécale et de la solution de dialyse du côlon sont préparées, autoclavées 15 min à 120°C puis stockées à 4°C jusqu'à utilisation (sauf la solution de vitamines qui est stérilisée par filtration et stockée à -20°C). Toutes les solutions sont préparées avec de l'eau déminéralisée.
- une solution d'électrolytes 10 X : hème 0,1 g/1, sels biliaires 0,5 g/1, cystéine 4 g/1, FeSO40,05 g/1, CaCl24,5 g/1, MgSO45 g/1, NaCI 4,5 g/1 et K2HPO425 g/1,
- une solution d'hydrates de carbone 20 X : pectine 12 g/1, xylane 12 g/1, arabinogalactane 12 g/1, amylopectine 12 g/1 et amidon 100 g/1,
- une solution contenant des lipides et des protéines (TBC 40X) : tween 80 80 ml/1, bactopeptone 120 g/1 et caséine 120 g/1,
- une solution de vitamines 10 X : ménadione 10 mg/1, biotine 20 mg/1, vitamine B12 5 mg/1, pantothénate 100 mg/1, nicotinamide 50 mg/1, acide p-aminobenzoïque 50 mg/1 et thiamine 40 mg/1.
Stabilisation de la flore et fermentation
La solution de dialyse (solution d'électrolytes 1 X du côlon et solution de vitamines 0,01 X, pH 6,5) est mise à buller sous flux d'azote pendant toute une nuit. Elle est délivrée à un débit de 1 ml/min pendant toute la durée de la stabilisation et de la fermentation (fibres de dialyse : JFM M5ID X Flow).
"L'ileum delivery médium" (solutions d'électrolytes 1 X du côlon, solution d'hydrates de carbone 10 X, TBC 10 X, solution de vitamines 0,01 X et mucus 20 g/1, pH 6,5), simulant le produit de la digestion issu de l'iléon, est introduit dans le côlon à raison de 3 ml par heure. La souche de levure étudiée, remise en suspension dans de l'eau déminéralisée ou du milieu de culture YPL (yeast extract 10g/l, bactopeptone 10 g/1, galactose 20g/l), est introduite dans le côlon, après stabilisation de la flore. Les levures sont préparées comme décrit dans les exemples 4 et 5.
Exemple 4 : Suivi des levures recombinantes W(R)pHlAl et W(hR)pHlAl dans les systèmes digestifs artificiels Préparation des levures
Les souches W(R)pHlAl et W(hR)pHlAl sont mises en culture dans du milieu minimum SGI (glucose 20 g/1, yeast nitrogen base 7g/l, bactocasamino acids lg/1 et tryptophane 20 mg/1) jusqu'à une concentration de 106- 107 cellules /ml.
La culture est ensuite centrifugée dans des tubes en plastique stériles (3000 g, 10 min, 4°C). Le surnageant est jeté et les cellules sont lavées dans 15 ml d'eau physiologique (NaCI 9 g/1).
Après centrifugation (3000 g, 10 min, 4°C), le surnageant est jeté et le culot cellulaire est remis en suspension dans l'aliment.
Les levures sont introduites dans le TIM 1 remises en suspension dans 300 ml de lait demi-écrémé ou sont introduites dans le TIM2 remises en suspension dans 5 ml d'eau déminéralisée.
Dénombrement des levures
- Prélèvement des échantillons dans TIM 1 : 1 ml de l'aliment de départ (contenant les deux souches de levure) est prélevé avant introduction dans l'estomac (t = 0), puis 1 ml est prélevé aux temps 120, 240 et 360 min dans les efïluents iléaux collectés sur les intervalles de temps 0-120 min, 120-240 min, 240-360 min, - Prélèvement des échantillons dans TIM 2 : 1 ml du contenu colique est prélevé avant ensemencement du côlon (t = Ofec) ainsi qu'l ml de la suspension de levures avant introduction dans le côlon (t = 0), puis 1 ml du contenu colique est prélevé toutes les 12 heures dans le côlon (t = 1, 12, 24, 36, 48 et 60 h),
- Culture des levures : les prélèvements sont dilués dans de l'eau physiologique et étalés sur du milieu SGI. De l'ampicilline (100 μg/ml) est rajoutée dans le milieu afin d'éliminer les contaminants provenant du système digestif et/ou de la flore fécale, ainsi que de l'éthanol (3% v/v) afin de favoriser le développement des levures.
- Dénombrement : le dénombrement des boîtes est réalisé après 2 à 3 jours d'incubation à 30°C.
Résultats : Les expériences réalisées ont permis de démontrer la viabilité dans les systèmes digestifs artificiels des souches recombinées de S. cerevisiae W(hR)pHlAl et W(R)pHlAl, introduites simultanément dans l'estomac ou dans le côlon. 50 % + 18,9 (n=3) des levures recombinantes introduites dans l'estomac sont retrouvées en sortie d'iléon après 6 h de digestion (figure 4).
Le taux de survie des levures dans le côlon apparaît plus faible puisque que l'on ne retrouve, après 12 h de fermentation, que 4% des levures introduites (n=l) (figure 5). Les causes de cette forte diminution du taux de survie dans le côlon restent indéterminées, d'autant plus, qu'après une heure de fermentation, la totalité des levures introduites était toujours présente dans le côlon. Deux hypothèses ont été avancées mettant en cause la compétition exercée par la flore fécale et les conditions de quasi anaérobiose régnant dans le côlon artificiel.
Identification des levures par Polymerase Chain Reaction (PCR) La technique PCR a dû être optimisée pour le suivi des levures recombinantes dans l'environnement digestif.
Les PCR peuvent être réalisées à partir de colonies isolées sur boîte de Pétri ou de levures remises en culture liquide. Dans le premier cas, on prélève une tête d'épingle d'une colonie que l'on remet en suspension dans 10 μl d'eau distillée avant de la faire bouillir 10 min. Dans le deuxième cas, la culture doit être en phase exponentielle de croissance (DOeoonm comprise entre 0,5 et 2). Après centrifugation (10000g, 10 min, 4°C), le culot cellulaire est repris dans 50 μl d'eau distillée et mis à bouillir 10 min. En culture liquide, les meilleurs résultats (en terme d'intensité des amplifiats et de reproductibilité des expériences) sont obtenus lorsque les levures sont en phase exponentielle de croissance (DO6oonm de 0,5 à 2), alors que sur milieu solide le stade de croissance des levures ne semble pas influencer les résultats.
Les amorces utilisées sont soit internes aux gènes (P450 1A1 et NADPH-cytochrome P450 réductases humaine ou de levure), soit situées à la fois sur le gène et son promoteur GAL10-CYC1 afin de vérifier la stabilité de celui-ci (figure 3). Elles sont choisies afin qu'elles s'hybrident le moins possible sur elles-mêmes, avec elles-mêmes et entre elles en utilisant le programme sur Internet à l'adresse suivante : http://www.Williamstone.com/primers/calculator/calculator.cgi Les échantillons PCR contiennent du tampon PCR 1 X, du MgCl2 1,5 mM, les 4 dXTP 0,2 mM, les amorces 5' et 3' 0,5 μ M, la Taq polymérase 25 U/ml et la matrice d'ADN 0,06%. Le programme PCR utilisé est le suivant (30 cycles) : dénaturation 5min 95°C, dénaturation 30s 95°C, amorçage 30s 51°C, synthèse d'ADN 2min 72°C et extension finale 10min 72°C.
Après PCR, les échantillons sont mélangés à une solution stop (bleu de Bromophénol 0,25%, Ficoll 10% et SDS 1%) et déposés sur un gel à 1,5% d'Agarose contenant du BET 0,5 μg/ml. La migration est réalisée dans une cuve d'électrophorèse contenant du tampon Tris-base 40 mM, acide acétique glacial 20 mM, EDTA 1 mM, pendant 15 minutes à 100V. Après migration, l'ADN est visualisé sous UV.
Résultats : Les souches de levures ont été identifiées par PCR à la fois en sortie de l'intestin grêle jusqu'à 6 h après leur introduction dans l'estomac et en sortie de côlon jusqu'à 48 H après leur introduction dans celui-ci (figure 6).
Exemple 5 : Suivi des levures recombinantes W(R)pP73Al dans les systèmes digestifs artificiels
Préparation des levures
Les levures sont mises en préculture 12h à 28°C, sous agitation, dans 30 ml de SGI (glucose 20 g/1, yeast nitrogen base 7g/l, bactocasamino acids 1 g/1 et tryptophane 20 mg/1). Puis, une culture de 48 h à 28°C, sous agitation, est réalisée dans 250 ml d'YPGE (glucose 20 g/1, yeast extract 10 g/1, bactopeptone 10 g/1 et éthanol 3%). Pendant les dernières 12h, l'induction du CYP73A1 est provoquée par ajout de galactose (25 ml d'une solution à 200 g/1) jusqu'à atteindre une densité de 3 à 4 xlO7 levures/ml. La culture est ensuite centrifugée dans des tubes en plastique autoclaves à 3000 g, 10 min, 4°C. Le surnageant est jeté et les cellules sont lavées dans 15 ml d'eau physiologique (NaCI 9 g/1). Après une nouvelle centrifugation (3000 g, 10 min, 4°C), les levures sont introduites dans le TIM 1 remises en suspension dans 300 ml de milieu de culture YPL (galactose 20 g/1, yeast extract 10 g/1, bactopeptone 10 g/1) et sont introduites dans le TIM 2 remises en suspension dans 10 ml de milieu YPL.
Dénombrement des levures
- Prélèvement des échantillons dans TIM 1 : 1 ml de l'aliment de départ (contenant les levures) est prélevé avant introduction dans l'estomac (t = 0), puis 1 ml est prélevé à différents niveaux du tractus digestif : dans l'estomac au bout de 15, 30, 45, 60 et 90 min de digestion, dans le duodénum au bout de 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120 et 150 min de digestion, dans le jéjunum au bout de 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 et 240 min de digestion, dans l'iléon au bout de 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 et 240 min de digestion et dans les sorties iléales cumulées sur 0-30 min, 30-45 min, 45-60 min, 60-90 min, 90-120 min, 120-180 min et 180-240 min à 30, 45, 60, 90, 120, 180 et 240 min. - Prélèvement des échantillons dans TIM 2 : 1 ml du contenu colique est prélevé avant introduction des levures dans le côlon (t = Ofec) ainsi qu'l ml de la suspension de levures avant introduction dans le côlon (t = 0), puis 1 ml du contenu colique est prélevé toutes les heures pendant 12h, puis 24h après introduction des levures,
- Culture des levures : les prélèvements sont dilués dans de l'eau physiologique et étalés sur du milieu SGI. De l'ampicilline (100 μg/ml) est rajoutée dans le milieu afin d'éliminer les contaminants provenant du système digestif et/ou de la flore fécale.
- Dénombrement : le dénombrement des boîtes est réalisé après 2 à 3 jours d'incubation à 30°C.
Résultats : Les expériences réalisées ont permis de démontrer la viabilité dans les systèmes digestifs artificiels des levures W(R)pP73Al.
Ces levures montrent une grande résistance aux sécrétions gastriques et intestinales puisque aucune différence significative n'est observée dans chaque compartiment digestif du TIM1 entre la courbe obtenue pour les levures et celle d'un marqueur de transit non absorbable (figure 7).
79% ± 13 (n=3) des levures recombinées introduites dans l'estomac sont retrouvées en sortie d'iléon après 4 h de digestion (figure 8).
Le taux de survie des levures dans le côlon est plus faible puisque que l'on ne retrouve, après 12 h de fermentation, que 1% des levures introduites (n=3) (figure 9). Deux hypothèses ont été avancées mettant en cause la compétition exercée par la flore fécale et les conditions de quasi anaérobiose régnant dans le côlon artificiel.
Exemple 6 : Mesure de l'activité éthoxyrésorufine-O-déethylase (EROD) des levures W(hR)pHlAl après passage dans le TIM 1
La souche W(hR)pHlAl est utilisée pour démontrer le maintien de l'activité des levures recombinantes après passage dans le TIM1.
Le P450 1A1 possède l'activité éthoxyrésorufine-O-déethylase (EROD) et catalyse la transformation de la 7-éthoxyrésorufine en résorufine.
Culture des levures
Les levures sont mises en préculture 12h à 28°C, sous agitation, dans 30 ml de SGI (glucose 20 g/1, yeast nitrogen base 7g/l, bactocasamino acids 1 g/1 et tryptophane 20 mg/1). Puis, une culture de 48 h à 28°C, sous agitation, est réalisée dans 250 ml d'YPGE (glucose 20 g/1, yeast extract 10 g/1, bactopeptone 10 g/1 et éthanol 3%). Pendant les dernières 12h, l'induction du P450 1A1 est provoquée par ajout de galactose (25 ml d'une solution à 200 g/1). La culture de levures est alors soit utilisée telle quelle pour le dosage de l'EROD sur cellules, soit subit différents traitements afin de préparer des microsomes (Pompon et al., 1996).
Teneur en P450 1A1
La teneur en P450 1A1 a été mesurée sur des microsomes de la souche W(hR)pHl Al après passage dans les systèmes digestifs .
Pour cela, on utilise la méthode d'Omura et Sato (1964), basée sur la propriété qu'a l'hémoprotéine de présenter un maximum d'absorption aux environs de 450 nm quand elle est réduite et liée au monoxyde de carbone. La suspension de microsomes est reprise dans du tampon Tris-HCl 50 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4 afin d'obtenir une DOôoonm d'environ 0,8, puis réduite par une pointe de spatule de dithionite de sodium. Le spectre d'absorption est enregistré avant et après barbotage de CO dans la suspension. La concentration en P450 1A1 (seul P450 détectable) est calculée d'après la loi de Beer-Lambert (ε448 nm = 91 mM^cm"1). Les protéines microsomales sont dosées avec le kit Protein Assay ESL (Boehringer Mannheim).
Dosage de l'activité EROD
L'activité enzymatique éthoxyrésorufine-O-dééthylase (EROD) est caractéristique du cytochrome P450 1A1. Elle est mesurée sur la souche W(hR)pHlAl, après passage dans les systèmes digestifs artificiels. Cette activité est dosée selon la méthode fluorimétrique décrite par Burke et al. (1985) qui mesure l'augmentation de fluorescence liée à la formation de résorufine, produit de déalkylation de la 7- éthoxyrésorufine. L'activité EROD est mesurée sur microsomes ou sur cellules à 24°C. Dans le premier cas, 1 ml de tampon Tris-HCl 50 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, 5 μl de NADPH (10 mg/ml) et 2 μl d'une solution de 7-éthoxyrésorufine saturée dans l' éthanol sont mélangés. Après ajout des microsomes, l'augmentation de la fluorescence (λex = 530 nm ; λem = 586 nm) est enregistrée. Dans le second cas, après centrifugation (11000 g, 30 s, 4°C) d'I ml de culture à une DO oonm de 3 minimum, le culot cellulaire est repris dans 1 ml de tampon Tris-HCl 50 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4. On enregistre l'augmentation de fluorescence (λex = 530 nm ; λem = 586 nm) consécutive à l'ajout de 2 μl d'une solution de 7-éthoxyrésorufme saturée dans l' éthanol.
Résultats : La souche W(hR)pHl Al possède toujours l'activité EROD, caractéristique du P450 1A1, en sortie de l'intestin grêle et dans le côlon, que celle-ci soit dosée sur microsomes (environ 20 pmol de résorufine par ml de suspension microsomale et par minute) ou sur cellules (environ 5 pmol de résorufine par ml de culture et par minute).
Exemple 7 : Suivi de l'activité cinnamate-4-hydroxylase des levures W(R)pP73Al dans les différents compartiments du TIM 1 et dans le TIM 2
La souche de levure utilisée pour démontrer l'activité in situ est la souche W(R)pP73Al. Le P450 73A1 possède l'activité cinnamate 4-hydroxylase et catalyse la transformation de l'acide tram-cinnamique en acide 7-coumarique.
Préparation des levures
Les levures sont mises en préculture 12h à 28°C, sous agitation, dans 30 ml de SGI (glucose 20 g/1, yeast nitrogen base 7g/l, bactocasamino acids 1 g/1 et tryptophane 20 mg/1). Puis, une culture de 48 h à 28°C, sous agitation, est réalisée dans 250 ml d'YPGE (glucose 20 g/1, yeast extract 10 g/1, bactopeptone 10 g/1 et éthanol 3%).
Pendant les dernières 12h, l'induction du CYP73A1 est provoquée par ajout de galactose (25 ml d'une solution à 200 g/1) jusqu'à atteindre une densité de 3 à 4 xlO7 levures/ml.
La culture est ensuite centrifugée dans des tubes en plastique autoclaves à 3000 g, 10 min, 4°C. Le surnageant est jeté et les cellules sont lavées dans 15 ml d'eau physiologique (NaCI 9 g/1).
Après centrifugation (3000 g, 10 min, 4°C), le surnageant est jeté et le culot cellulaire est remis en suspension dans l'aliment (300 ml de milieu YPL pour le suivi de la réaction de bioconversion dans le TIM 1 et 10 ml de milieu YPL pour le suivi de la réaction dans le TIM 2).
Déroulement de la digestion dans le TIM 1 Le substrat (l'acide tr ras-cinnamique) est introduit extemporanément dans l'estomac à la concentration de 670 μM (concentration dans l'aliment). La digestion est réalisée sur 240 minutes.
Des prélèvements (1 ml) sont réalisés à différents niveaux du tractus digestif : dans l'aliment (tO), dans l'estomac au bout de 15, 30, 45, 60 et 90 min de digestion, dans le duodénum au bout de 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120 et 150 min de digestion, dans le jéjunum au bout de 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 et 240 min de digestion, dans l'iléon au bout de 30, 45, 60, 90, 120, 180 et 240 min de digestion et dans les sorties iléales cumulées sur 0-30 min, 30-45 min, 45-60 min, 60-90 min, 90-120 min, 120-180 min et 180-240 min à 30, 45, 60, 90, 120, 180 et 240 min.
Déroulement de la fermentation dans le TIM 2
Le substrat (l'acide tr πs-cinnamique) est introduit dans le côlon à la concentration de 1.7 mM (concentration initiale dans le côlon). Des prélèvements (1 ml) sont réalisés à tO puis 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150, 180, 240, 300 et 360 min après introduction simultanée des levures et du substrat dans le côlon. Les échantillons sont dilués au lA avant d'être traités comme décrit ci-dessous.
Traitement des échantillons
100 μl d'acide trifluoroacétique (25% dans l'eau w/v) sont ajoutés à 1 ml d'échantillon pour arrêter la réaction enzymatique. Après microcentrifugation (3 min, 10000 rpm), le surnageant est récupéré et filtré (0.45 μm). Les échantillons sont conservés à -20°C avant analyse.
Analyse HPLC
Après filtration, 10 μl des échantillons sont injectés dans la colonne Merck Lichrospher 100 RP-18 (5 μm, 12.5 cm*4 mm). Un gradient entre 2 phases A et B est réalisé sur 34 min avec un débit de 1 ml par minute, comme décrit ci-dessous :
Phase A : Eau 95, Méthanol 5 et acide acétique 0.1 (v/v),
Phase B : Acétonitrile 95, Méthanol 5 et acide acétique 0.1 (v/v),
0-16 min : 90% A, 10% B, 16- 18 min : gradient linéaire jusqu' à 80% A, 20%> B,
18-32 min : 80% A, 20% B,
32-34 min : gradient linéaire jusqu'à 90% A, 10% B.
La détection est réalisée par spectrophotométrie à 314 nm entre 0 et 16 min, puis à 280 nm entre 16 à 34 min. Le temps de rétention des composés est de 6 + 0.5 min pour l' acide 7-coumarique et de
22 ± 0.5 min pour l'acide trαns-cirmamique. Résultats
L'activité enzymatique cinnamate 4-hydroxylase a été détectée dans tous les compartiments digestifs du TIM 1 (estomac, duodénum, jéjunum et iléon). Des digestions témoins ont permis de s'assurer de la stabilité du substrat et du produit dans le TIM 1, ainsi que de la spécificité de la réaction de bioconversion. La figure 10A représente un bilan de la réaction de bioconversion de l'acide trans- cinnamique en acide -coumarique (n=3), au cours du temps, dans l'ensemble des compartiments du TIM 1. Ainsi 41 % ± 6 (n=3) de l'acide tr πs-cinnamique introduit dans l'estomac est converti en acide
Figure imgf000044_0001
dans le TIM 1 sous l'action des levures W(R)pP73 Al.
La figure 10B représente l'acide /?-coumarique produit dans les différents compartiments du TIM 1 au cours du temps (n=3), en % de l'acide trαras-cinnamique introduit dans l'estomac au début de la digestion. C'est dans le duodénum que a plus grande quantité d'acide >-coumarique est produit par les levures.
Une activité enzymatique, quoique très faible, a également été détectée dans le côlon artificiel (résultats non présentés). Des témoins ont permis de s'assurer de la spécificité de la réaction. Le faible taux de survie des levures dans le côlon, ainsi que l'existence de voies métaboliques secondaires (métabolisme de l'acide tr ra-cinnamique et de l'acide /?-coumarique par les bactéries du côlon) pourraient expliquer que l'activité cinnamate 4-hydroxylase soit très faible dans le côlon.
Exemple 8 : constructions génétiques de souches de levures sécrétant un peptide modèle "taggé" (souche WppVsHô) et une protéine modèle "taggée" (souche WppGSTV5H6)
Choix du signal de sécrétion
Une séquence signal provenant du peptide α, peptide naturellement sécrété par les levures de type sexuel α, a été choisie comme signal de sécrétion. La séquence signal du peptide α se découpe en trois domaines, situés directement en amont du peptide α et nécessaires à sa maturation et à sa sécrétion : 1- la séquence d'adressage du peptide vers le réticulum endoplasmique : séquence Pre,
2- une séquence dont la glycosylation permet une sécrétion efficace du peptide : séquence Pro, 3- la région de coupure des protéases Kex2, Stel3 et Kexl .
Une séquence signal constituée des séquences Pre et Pro et de la séquence codant pour les deux acides aminés lysine-arginine (KR), site de coupure de Kex2, a été retenue (notée PreProKR). En effet, dans ce cas, la fonction de la protéine Stel3 n'est pas requise (activité devenant limitante en cas de surexpression de protéines hétérologues) et la protéase Kex2 est suffisante pour l'obtention d'un peptide mature.
Construction des plasmides ppVsHβ et ppGST V5H6
Le vecteur navette bactérie/levure pYES2-CT (plasmide commercial, Invitrogen) a servi de base à la construction des plasmides ppV H6 et ppGSTV5H6 (Figure 11A et 1 IB). pYES2-CT porte une cassette d'expression comportant le promoteur fort GAL 1 (inductible par le galactose) et le terminateur du gène CYCl. Ce vecteur présente par ailleurs, sous le contrôle de GAL 1, une séquence codant pour un épitope dit V5 et pour une chaîne polypeptidique de 6 histidines. Ces deux séquences forment un tag (multi- tag V5H6) qui pourra être reconnu par le biais de son épitope V5 (reconnu par des anticorps spécifiques), notamment lors d'une analyse par Western Blot. Construction du plasmide ppVjHk Le plasmide ppV5H6 a été construit par insertion de la séquence codant pour le PreProKR en amont de la séquence codant pour l'épitope V5. Pour ce faire, les sites de restriction BamHl et EeoRl ont été ajoutés, par amplification PCR, respectivement aux extrémités 5' et 3' de la séquence codant pour le PreProKR. Le produit PCR a ensuite été sous-cloné dans le vecteur pYes2/CT, ouvert par double digestion BamHl - ΕcoRl.
Construction du plasmide ppGSTVjHk La construction a été réalisée à partir du plasmide ppV5H6 dans lequel la séquence de la phase codante de la GST a été insérée, en amont de la séquence V5H6. Cette insertion a été effectuée par recombinaison homologue directement dans la levure hôte. Pour cela, des séquences homologues ont été ajoutées, par amplification PCR, aux extrémités de la phase codante de la GST (GST de Schistosoma japonicum).
Obtention des souches de levures pVsHβ et WppGSTVsHβ Les plasmides ppV5H6 et ppGSTV5H6 ont été introduits par transformation dans la souche de levure W303 de signe sexuel MAT α (leu 2, his 3, trp 1, ura 3 et ade 2), donnant respectivement les souches WppV H6 et WppGSTV5H6. Le peptide modèle "taggé" (noté peptide- V5H6) sécrété par la souche WppV5H6 à une taille de 42 acides aminés (PM calculé : 5.7 kDa). La protéine modèle "taggée" (notée GST-V5H6) sécrétée par la souche WppGSTV5H6 a une taille de 29.7 kDa (PM calculé).
Exemple 9 : Suivi des produits de sécrétion des levures WppVsHβ et WppGSTV5H6 en erlen-Meyer
Préparation des levures
Les souches WppV5H6 ou WppGSTV5H6 sont mises en préculture (24h, 30°C, 210 rpm) dans du milieu minimum SRAI (bactocasamino acids lg/1, yeast nitrogen base 7g/l, adénine 2 mg/ml et raffinose 20 g/1), jusqu'à être en phase stationnaire. Ensuite, une culture de croissance (12 h, 37°C, 210 rpm) est réalisée dans du milieu complet YPRA (yeast extract 10 g/1, bactopeptone 10 g/1, adénine 2 mg/ml et raffinose 20 g/1), jusqu'à être en phase stationnaire. La culture est centrifugée (2000 g, 6 min, température ambiante), le surnageant est enlevé, puis le milieu d'induction YPLRA (yeast extract 10 g/1, bactopeptone 10 g/1, adénine 2 mg/ml, galactose 20 g/1 et raffinose 10 g/1) est ensemencé soit à haute densité cellulaire (DO6oonm de 4), soit à faible densité cellulaire (DO6nonm de 0,6). La culture d'induction est réalisée 6 h, à 37°C, sous agitation (210 rpm).
Des échantillons sont prélevés dans la culture de croissance et dans la culture d'induction à tO, t2h, t4h et t6h, dans les deux conditions de concentration cellulaire. Traitement des échantillons
Précipitation des protéines Après centrifugation (3000 g, 10 min, 4°C) pour éliminer les cellules, les protéines contenues dans le surnageant sont précipitées par ajout de trichloro acetic acid (TCA) (concentration finale 10%). Les échantillons sont incubés à 4°C pendant lh puis centrifugés (10000 g, 10 min, 4°C). Les culots protéiques sont ensuite rincés 2 fois avec de l'acétone 100%. Après séchage, les culots sont repris dans du tampon de charge et chauffés 5 min à 95°C.
Electrophorèse des protéines Pour chaque échantillon, on dépose les protéines du surnageant, correspondant à un volume de culture contenant 5*107 levures. Les protéines sont séparées par electrophorèse sur gel de polyacrylamide 12 % (GST-V5H6) ou 16.5 % (peptide-V H6), en conditions dénaturantes (ajout de SDS). Un tampon de migration contenant de la tricine, plus adapté à la séparation de protéines de faible poids moléculaire, a été utilisé dans le cas du peptide- V5H6 (Shagger H. et Von Jagow G., 1987). Les paramètres de la migration sont les suivants : 30 mA, 150 V, lh (GST-V5H6) ou 3h (peptide- V5H6).
Western-Blot Après electrophorèse, les protéines sont transférées sur membrane polyvinyldifluorène (PVDF). Les paramètres du transfert sont les suivants : 350 mA, 100 V, lh (GST- V5H6) ou 20 min (peptide- V5H6).
Le peptide- V5H6 et la GST-V5H6 sont révélés après incubations successives des membranes avec l'anticorps spécifique anti-V5 et un anticorps secondaire couplé à la phosphatase alcaline (Kit Western-Breeze, Invitrogen, WB7103). L'ajout du substrat (BCIP/NBT) provoque la formation d'un précipité violet.
Résultats
La figure 12 représente les Western-Blot obtenus avec la souche WppV5H6 (12A) et avec la souche WpρGSTV5H6 (12B).
Dans les 2 cas, le niveau basai de sécrétion obtenu sur raffinose est trop faible pour être visible sur Western-Blot. Les produits de sécrétion sont détectables dès 2h après induction du promoteur GAL1 par le galactose. Au vu des Western-Blot, la sécrétion semble plus importante lorsque la culture d'induction est réalisée à faible densité cellulaire, que soit pour le peptide- V5H6 ou pour la GST-V5H6. Dans les 2 cas, les produits de sécrétion sont détectables également sous forme de précurseurs (avec la séquence Pre-Pro-KR) et sous forme glycosylée ou hyperglycosylée.
Exemple 10 : Suivi des produits de sécrétion des levures WppVsHβ et WppGSTV5H6 dans les différents compartiments du TIM 1
Préparation des levures Les souches WppV5H6 ou WppGSTV5H6 sont mises en préculture (24h, 30°C, 210 rpm) dans du milieu minimum SRAI (bactocasamino acids lg/1, yeast nitrogen base 7g/l, adénine 2 mg/ml et raffinose 20 g/1), jusqu'à être en phase stationnaire. Ensuite, une culture de croissance (12 h, 37°C, 210 rpm) est réalisée dans du milieu complet YPRA (yeast extract 10 g/1, bactopeptone 10 g/1, adénine 2 mg/ml et raffinose 20 g/1), jusqu'à être en phase stationnaire. La culture est centrifugée (3000 g, 10 min, température ambiante) et le culot cellulaire est remis en suspension dans 300 ml du milieu d'induction YPLRA (yeast extract 10 g/1, bactopeptone 10 g/1, adénine 2 mg/ml, galactose 40 g/1 et raffinose 20 g/1), constituant ainsi l'aliment qui sera introduit dans le
TIM 1.
Déroulement de la digestion dans le TIM 1
La digestion est réalisée selon un protocole classique de digestion (cf exemple 3) mais sans les protéases digestives (pour éviter la dégradation des produits de sécrétion).
Des prélèvements sont réalisés à différents niveaux du tractus digestif : dans l'aliment avant introduction dans le système (tO), dans l'estomac au bout de 90 et 120 min de digestion, dans le duodénum au bout de 90, 160 et 210 min de digestion, dans le jéjunum au bout de 90, 160 et 210 min de digestion et dans l'iléon au bout de 90, 160,
210 et 270 min de digestion.
Des dénombrements sont réalisés dans l'aliment et dans les sorties iléales cumulées sur 0-90, 90-180 et 180-270 min, à 90, 180 et 270 min, par dénombrement sur milieu
Sabouraud contenant de l'ampicilline (100 μg/ml). Un témoin positif en Erlen-Meyer est réalisé en parallèle pour les deux souches.
Traitement des échantillons
Précipitation des protéines Le protocole de précipitation est celui décrit dans l'exemple 9. Les échantillons issus de l'estomac sont préalablement neutralisés avec du bicarbonate de sodium 1M.
Electrophorèse des protéines Le protocole d'électrophorèse est celui décrit dans l'exemple 9. La totalité des protéines contenues dans le surnageant des prélèvements est déposée (correspondant à un volume de 2 ml dans le TIM 1, sauf pour l'estomac et le duodénum où le volume des prélèvements est de 4 ml, et 600 μl dans l'Erlen Meyer).
Western-Blot Le protocole de Western-Blot est celui décrit dans l'exemple 9. L'anticorps anti-GST a été utilisé à la place de l'anticorps anti-V5 afin de réaliser une semi-quantification de la GST-V5H6 sécrétée.
Semi-quantification de la GST-VjH Afin d'apprécier de façon approximative la quantité de GST sécrétée dans l'environnement digestif, nous avons comparé l'intensité des signaux de détection d'une gamme étalon avec celle d'échantillons issus du TIM 1. 20 ng, 10 ng et 1 ng de GST pure à 85 % ont été déposés sur le même gel que les protéines d'échantillons issus de prélèvements dans le TIM 1. Après transfert sur membrane PVDF, la présence de GST a été mise en évidence avec un anticorps primaire anti-GST et le kit de détection WesternBreeze (Invitrogen, WB7103).
Résultats
Les figures 13 et 14 représentent les Western-Blot obtenus lors de la digestion dans le TIM 1 en présence respectivement des souches WppV5H6 et WppGSTV5H6. Le peptide V5H6 a été mis en évidence dans tous les compartiments du TIM 1 dès 90 minutes après le début de la digestion. La quantité de peptides décelée augmente au cours de la digestion et le long du tractus digestif (de l'estomac à l'iléon) pour un temps de digestion donnée. La GST-V5H6 a été décelée dans tous les compartiments sauf l'estomac. La quantité de protéines sécrétées augmente également au cours de la digestion.
La figure 15 représente une semi-quantification de la GST-V5H6 produite lors d'une digestion dans le TIM 1 en présence de la souche WppGSTV5H6. La concentration de la GST-V5H6 dans les échantillons digestifs peut être évaluée à : - < 1 ng/ml pour les échantillons duo, jej et ile 90 min, lo 10 ng/ml pour les échantillons jej et ile au temps 160 et 210 min.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Micro-organismes comportant au moins un fragment d'ADN hétérologue comprenant un gène d'intérêt capable de s'exprimer dans l'environnement digestif, caractérisés en ce que son taux de survie est supérieur à 25%, 50%, 75%, 80 %, de préférence 90%> ou 95 % en sortie de l'iléon après 6 h de digestion et est supérieur à 2 %, 4%, de préférence 8% après 12 h de fermentation dans le côlon.
2. Micro-organismes selon la revendication 1 caractérisés en ce que le fragment d'ADN hétérologue est constitué d'une cassette d'expression comprenant au moins un gène d'intérêt, un promoteur et un terminateur.
3. Micro-organismes selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce qu'il s'agit de levures sélectionnées notamment parmi Saccharomyces cerevisiae, S boulardii, S uvarum, Hansenula anomala, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis et Yarrowia lipolitica.
4. Micro-organismes selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que le gène d'intérêt code pour un produit sélectionné parmi les peptides à intérêt vaccinal, les peptides à intérêt hormonal, les peptides à intérêt thérapeutique, les peptides à effet antibiotique, les peptides capables de piéger ou de complexer des molécules, des enzymes ou tout peptide possédant des activités de bioconversion, notamment des enzymes de détoxication ou sécrétés dans l'environnement digestif.
5. Micro-organismes selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que le gène d'intérêt code pour une enzyme du métabolisme des xénobiotiques sélectionnée parmi les enzymes de phase I (P450 1A1, 1A2, 1B1, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, 3A5 et 73A1), les enzymes d'environnement de phase I (cytochrome P450 réductase et cytochrome b5) et les enzymes de phase II telles que la glutathion S-transférase (GST), la N-acétyl transférase (NAT), la quinone réductase (QR), l'aldéhyde deshydrogénase (ALDH) et l'uridine diphosphoglucuronosyl transférase (UGT).
6. Micro-organismes selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que le gène d'intérêt est placé sous le contrôle d'un promoteur choisi parmi les promoteurs constitutifs ou inductibles, les promoteurs forts, les promoteurs actifs spécifiquement dans un segment du tractus digestif en conditions d'aérobie, de semi anaérobie ou d'anaérobie, et les promoteurs régulables par une molécule introduite dans le milieu intestinal.
7. Micro-organismes selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce qu'ils sont capables d'effectuer une réaction de bioconversion ou de sécréter un peptide ou une protéine d'intérêt dans tous les compartiments digestifs.
8. Procédé d'étude, de contrôle et/ou de sélection de micro-organismes selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'il met en œuvre un système digestif artificiel.
9. Procédé d'étude et/ou de contrôle selon la revendication 8 comprenant les étapes consistant à : a) ajouter un micro-organisme selon l'une des revendications 1 à 7 dans un milieu nutritif liquide, b) introduire ledit milieu à l'entrée d'un système digestif artificiel comprenant au moins un des compartiments, c) incuber et procéder à un dénombrement et ou à un test de l'activité du gène d'intérêt après passage dans les systèmes digestifs ou in situ, le test d'activité pouvant comprendre un test de sécrétion et ou de bioconversion.
10. Procédé de sélection selon la revendication 7 comprenant les étapes consistant à : a) ajouter des micro-organismes selon l'une des revendications 1 à 7 dans un milieu nutritif liquide, b) introduire ledit milieu à l'entrée d'un système digestif artificiel comprenant au moins un des compartiments, c) incuber et récupérer les micro-organismes survivants après passage dans ledit système ; d) répéter éventuellement les étapes a) à c) jusqu'à l'obtention d'une population homogène de micro-organismes adaptés à l'environnement digestif et capables d'exprimer efficacement le gène d'intérêt.
11. Micro-organisme obtenu à partir du procédé selon l'une des revendications 8 à 10.
12. Micro-organisme selon la revendication 11 caractérisé en ce que son taux de survie est supérieur à 25%, 50%, 75% %, 80 %, de préférence 90% ou 95 % en sortie de l'iléum après 6 h de digestion et est supérieur à 2 %, 4%, de préférence 8% après 12 h de fermentation dans le colon.
13. Micro-organisme selon l'une des revendications 11 et 12 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une levure.
14. Produit de combinaison comprenant un micro-organisme selon l'une des revendications I à 7 et ll à l3 et une substance active ou un précurseur d'une substance active pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps.
15. Produit selon la revendication 14 caractérisé en ce que le micro-organisme agit sur la substance active ou inversement.
16. Composition pharmaceutique comprenant des micro-organismes selon l'une des revendications I à 7 et l l à l3 se trouvant sous une forme galénique adaptée à une administration par voie orale ou rectale de sorte à les acheminer intactes au niveau du site cible du tractus digestif et de maintenir leur intégrité à ce niveau pendant un temps donné.
17. Composition pharmaceutique selon la revendication 16 dans lequel les micro- organismes, en particulier les levures, sont protégés par un enrobage et/ou une membrane du type résine et/ou de type polymère formant des sphères, microsphères, granules ou microgranules.
18. Composition pharmaceutique selon la revendication 17 caractérisée en ce qu'elle se trouve sous la forme de gélules, comprimés, dragées ou suspension cellulaire.
19. Utilisation de micro-organismes selon l'une des revendications I à 7 et ll à l3 pour la préparation d'un médicament.
20. Utilisation selon la revendication 19 pour la préparation d'agents de détoxication, d'agents de correction métabolique ou d'agents capables de modifier la flore intestinale.
21. Utilisation selon la revendication 19 pour la préparation d'un médicament destiné à diminuer la toxicité et/ou augmenter la biodisponibilité d'une substance active ou de son précurseur.
22. Utilisation selon la revendication 19 pour la préparation d'un médicament capable de fournir in situ des peptides actifs, des peptides à intérêt vaccinal, des peptides à intérêt hormonal, des peptides à intérêt thérapeutique, des peptides à effet antibiotique ou des peptides capables de piéger ou de complexer des molécules.
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