CN105548388A - 一种食品中丙烯酰胺的gc-ms多离子参数检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种食品中丙烯酰胺的GC-MS多离子参数检测方法，所述方法采用内标法，对样品中的丙烯酰胺进行溴化衍生处理以及转化处理，然后采用GC-MS手段进行检测得到离子流图和质谱图，然后依据多离子参数计算公式计算得到含量，该方法在多离子参数计算时选取m/z＝70，106，149，151的4个离子碎片，计算结果精度高、重现性与可靠性好。

Description

一种食品中丙烯酰胺的GC-MS多离子参数检测方法

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，尤其涉及一种食品中丙烯酰胺的GC-MS多离子参数检测方法，利用该方法能够有效检测出食品中丙烯酰胺的含量。

背景技术

2002年4月，瑞典斯德哥尔摩大学的研究人员首次在油炸或焙烤的马铃薯和谷物类食品中发现了具有神经毒性的潜在致癌物丙烯酰胺。丙烯酰胺具有中等神经毒性，可以引起周围神经的损害。动物试验表明，丙烯酰胺与甲状腺癌、肾上腺癌、乳腺癌和生殖系统癌症的发病率存在剂量依赖关系。国际癌症研究机构(IARC)已将丙烯酰胺列为2A类致癌物。卫生部建议采取合理措施降低食品中丙烯酰胺的含量，减少因丙烯酰胺可能导致的健康危害。

对食品中丙烯酰胺研究主要集中在富含淀粉的食品中，并且发现这类食品中丙烯酰胺含量较高。食品中丙烯酰胺的残留量与加工方式、温度、时间、水分等因素有关，不同食品加工方式和条件不同，其丙烯酰胺含量会有很大不同。对高淀粉热加工食品中丙烯酰胺的检测研究，有液相色谱、液相色谱质谱联用等方式，但存在稳定性差，再现性不理想，或对样品前处理要求过高等缺陷。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的缺陷，提供一种食品中丙烯酰胺的GC-MS多离子参数检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

步骤一：制备标准样品溶液

取食品样品，将其粉碎，加水提取其中的丙烯酰胺，得提取液，取n个提取液，并分别向所述提取液中加入不同重量的内标丙烯酰胺，并对加入内标的n个提取液依次进行溴化衍生处理和转化处理，所得转化液即为所述标准样品溶液；

步骤二：制备待测样品溶液

取食品样品，将其粉碎，加水提取其中的丙烯酰胺，得提取液；对所述提取液依次进行溴化衍生处理和转化处理，所得转化液即为所述待测样品溶液；

步骤三：采用GC-MS方法检测所述标准样品溶液和待测样品溶液，获得离子流图和质谱图；

步骤四：依据所述质子流图和质谱图，采用多离子参数计算公式计算待测样品中丙烯酰胺含量。

其中，所述多离子参数计算公式为：

$C_{sample}=\frac{1}{4}\underset{j}{\Σ}(k_j\×\frac{1}{3}\underset{i}{\Σ}{A}_{i,j})-c$

k_j为 $\frac{3\underset{i}{\Σ}i\×c\×A_{i,j}-(\underset{i}{\Σ}i\×c)\×\left(\underset{i}{\Σ}{A}_{i,j}\right)}{3\underset{i}{\Σ}{A}_{i,j}^2-{\left(\underset{i}{\Σ}{A}_{i,j}\right)}^2}$

其中，c为标准品的单位质量浓度，i×c为各标准样品溶液中标准品的最终质量浓度，单位为μg/mL；A_i,j为各碎片的峰面积(其中，i代表样品编号，i＝0，1，2，····，n，i＝0代表待测样品溶液；i＝1,2，…n分别代表第1、第2、…第n个标准品溶液；j代表离子碎片的质核比，j＝1，2，3，4，其中，j＝1对应m/z＝70的离子碎片，j＝2对应m/z＝106的离子碎片，j＝3对应m/z＝149的离子碎片，j＝4对应m/z＝151的离子碎片)。

优选地，所述多离子参数计算公式中，n为2，多离子参数计算公式为： $C_{sample}=\frac{1}{9}\underset{l}{\Σ}{b}_l-c$

其中， $\left(\begin{array}{cccc}{b}_1& b_2& b_3& b_4\end{array}\right)=\left(\begin{array}{cccc}{k}_1& k_2& k_3& k_4\end{array}\right)\left(\begin{array}{ccc}{A}_{0,1}& A_{1,1}& A_{2,1}\\ A_{0,2}& A_{1,2}& A_{2,2}\\ A_{0,3}& A_{1,3}& A_{2,3}\\ A_{0,4}& A_{1,4}& A_{2,4}\end{array}\right).$

所述溴化衍生处理的方法优选为：将提取液或含内标提取液进行离心处理，过滤离心所得的上清液，得滤液，向所述滤液中加入溴化钾，氢溴酸和饱和溴水，避光反应，反应完全后向反应液中加入硫代硫酸钠至反应液褪色，即得衍生液。

进一步优选地，每20mL滤液中加入5-10g溴化钾，0.2-0.6mL氢溴酸，5-10mL饱和溴水；优选地，每20mL滤液中加入7.5g溴化钾，0.4mL氢溴酸，8mL饱和溴水。

本发明最优选的溴化衍生处理的方法为：将提取液或含内标提取液在2-6℃条件下，以10000g的转速进行离心处理，采用玻璃棉过滤离心所得的上清液，得滤液；按照每20mL滤液加入5-10g溴化钾，0.2-0.6mL氢溴酸，5-10mL饱和溴水的量，向滤液中加入溴化钾，氢溴酸和饱和溴水，在2-6℃条件下避光静置0.5-2h，然后加入硫代硫酸钠水溶液直至反应液褪色，即得衍生液。

为了避免溴化衍生处理中杂质的干扰，影响最终鉴定结果的精准度，优选地，在进行转化反应前，还包括将衍生液进行提纯的步骤，所述提纯为：向所述衍生液中加入有机溶剂进行萃取，收集有机相进行后续的转化反应。

优选地，所述有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、乙醇中的一种或几种，进一步优选为氯仿。

溴化衍生处理的目的是将丙烯酰胺转化为2,3-二溴丙烯胺，转化处理的目的是将2，3-二溴丙烯胺转化为2-溴丙烯酰胺，本发明转化处理所使用的有机碱为一乙胺、二乙胺、或三乙胺中的一种或多种，优选为三乙胺，转化处理进一步优选按照1mL有机相中加入40-60μL三乙胺的量进行转化反应。

其中，所述GC-MS中气相色谱条件为以下(1)-(5)中的任意一项或几项：

(1)采用HP-5mass色谱柱；

(2)进样口温度270-290℃；

(3)载气为高纯氦气，载气流速为0.5-1.5mL/min；

(4)程序升温：起始温度45-55℃，保持2-3min，2-3℃/min升至70-85℃，保持1-2min，再以10-15℃/min升至240-250℃保持4-6min；

(5)进样0.05-0.15μL；

气相色谱条件优选以下(1)-(5)中的任意一项或几项：

(1)采用HP-5mass色谱柱；

(2)进样口温度280℃；

(3)载气为高纯氦气，载气流速为1.0mL/min；

(4)程序升温：起始温度50℃，保持3.0min，3℃/min升至80℃，保持1min，再以15℃/min升至250℃保持5min；

(5)进样0.1μL。

所述GC-MS中质谱的条件为以下(1)-(8)中的任意一项或几项：

(1)EI离子源；

(2)电子能量70eV；

(3)四极杆温度140-160℃；

(4)接口温度250-270℃；

(5)离子源温度220-240℃；

(6)自动调谐；

(7)选择监测离子扫描(SIM)模式；

(8)选定的扫描离子质荷比(m/z)分别为：70、106、149、151，各离子的丰度比：(m/z)70:106:149:151＝5.7:2.3:1.9:1.9；

质谱条件优选以下(1)-(8)中的任意一项或几项：

(1)EI离子源；

(2)电子能量70eV；

(3)四极杆温度150℃；

(4)接口温度260℃；

(5)离子源温度230℃；

(6)自动调谐；

(7)选择监测离子扫描(SIM)模式；

(8)选定的扫描离子质荷比(m/z)分别为：70、106、149、151，各离子的丰度比：(m/z)70:106:149:151＝5.7:2.3:1.9:1.9。

采用此方法测定油炸高淀粉热加工食品，例如油炸马铃薯中的丙烯酰胺含量时，为了避免油脂的存在干扰最终测定结果的精准度，优选地，在提取丙烯酰胺之前，包括除去所述高淀粉热加工食品样品中油脂的步骤，具体为，将所述高淀粉热加工食品粉碎，加入有机溶剂萃取，弃去有机相，将水相用于后续的处理。

所述有机溶剂优选为正己烷、乙醚、石油醚、氯仿中的一种或多种，进一步优选为石油醚。

本发明具有的优点和有益效果是：本发明提出了一种适用于高淀粉食品中丙烯酰胺的提取方法，采用该提取方法能够最大程度的提取出样品中的丙烯酰胺，为鉴定的精准度奠定了基础；此外，本发明采用多离子参数计算方法，检测结果精度高、重现性与可靠性好。

附图说明

图1丙烯酰胺衍生转化产物2-溴丙烯酰胺的选择性离子流图；

图2丙烯酰胺衍生转化产物2-溴丙烯酰胺的离子碎片图；

图3实施例1中待测样品溶液(曲线1)、标准样品溶液1(曲线2)、及标准样品溶液2(曲线3)的选择性离子流图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

一种油炸薯片的制备方法：将市售新鲜土豆洗净，用纱布吸干表面水分，去皮，用刀片制备成0.2cm厚薄均匀的薯片，再用刀片切成直径3.0cm大小的圆片，清水洗去表面淀粉，滤纸吸干表面水分。置于180℃大豆油中油炸5min，取出浸入凉油冷却，滤油后装入封口袋。以下实施例中涉及的油炸薯片均为采用上述方法制备得到的。

实施例1

检测油炸薯片中丙烯酰胺含量的方法，包括如下步骤：

步骤一：制备标准样品溶液

(1)制备含内标提取液：准确称取4g研磨粉碎后的油炸马铃薯片样品置于50mL离心管中，加入20mL石油醚，振荡1min，弃去石油醚层，重复上述石油醚脱脂过程1次；向脱脂后的样品中加入40mL4mol/LNaCl溶液，振荡1min，均质1min，超声20min，得提取液；取2个提取液样品，分别向提取液样品中加入浓度为10μg/mL的丙烯酰胺标准液0.5mL和1.0mL，得到2个含内标提取液；

(2)对含内标提取液进行净化处理：取上述2个含内标提取液，分别在4℃下，以10,000g的转速，离心15min，将上清液用玻璃棉过滤，得2个滤液；

(3)溴化衍生处理及转化处理：分别对上述2个滤液进行后续处理，取20mL上清液，加入0.4mL氢溴酸，再依次加入7.5g溴化钾粉末和8mL饱和溴水，涡流混合均匀后在4℃下避光静置1h，取出后逐滴加入0.2mol/L的硫代硫酸钠溶液至溶液完全褪色，终止衍生化反应；向衍生后的样液中加入8mL氯仿进行液-液萃取，重复3次，合并萃取液，氯仿相经无水硫酸钠脱水，取12mL萃取液；萃取液经80℃水浴，蒸发氯仿。萃取液蒸发至5mL时，氮吹干。加1mL氯仿，振荡1min复溶，超声5min；向1mL样液中加入50μL三乙胺，振荡1min，即得2个标准样品溶液，记为标准样品溶液1和标准样品溶液2。

步骤二：制备待测样品溶液

待测样品溶液的制备方法同步骤一，其区别仅在于步骤(1)不加入内标物丙烯酰胺；

步骤三：采用GC-MS方法检测所述标准样品溶液和待测样品溶液，获得离子流图和质谱图；

将2个标准样品溶液和1个待测样品溶液过0.45μm有机系膜后进行气相色谱质谱联用法(GC-MS)进样分析，采用AgilentHP7890气相色谱-HP5973质谱联用仪对进行检测，其中，

色谱条件为：HP-5mass毛细管柱，进样口温度280℃，载气为高纯氦气，载气流速为1.0mL/min，程序升温：起始温度50℃，保持3.0min，3℃/min升至80℃，保持1min，再以15℃/min升至250℃保持5min，进样0.1μL；

质谱条件为EI离子源；电子能量70eV；四极杆温度150℃，接口温度260℃；离子源温度230℃，采用自动调谐，采用选择监测离子扫描(SIM)模式，选定的扫描离子质荷比(m/z)分别为：70、106、149、151，各离子的丰度比：(m/z)70:106:149:151＝5.7:2.3:1.9:1.9；

步骤四：依据所述质子流图和质谱图，采用多离子参数计算公式计算待测样品中丙烯酰胺含量，计算公式为：

$C_{sample}=\frac{1}{9}\underset{l}{\Σ}{b}_l-c$

其中， $\left(\begin{array}{cccc}{b}_1& b_2& b_3& b_4\end{array}\right)=\left(\begin{array}{cccc}{k}_1& k_2& k_3& k_4\end{array}\right)\left(\begin{array}{ccc}{A}_{0,1}& A_{1,1}& A_{2,1}\\ A_{0,2}& A_{1,2}& A_{2,2}\\ A_{0,3}& A_{1,3}& A_{2,3}\\ A_{0,4}& A_{1,4}& A_{2,4}\end{array}\right)$

A_0,1代表待测样品溶液中m/z＝70的离子碎片的峰面积；

A_0,2代表待测样品溶液中m/z＝106的离子碎片的峰面积；

A_0,3代表待测样品溶液中m/z＝149的离子碎片的峰面积；

A_0,4代表待测样品溶液中m/z＝151的离子碎片的峰面积；

A_1,1代表标准样品溶液1中m/z＝70的离子碎片的峰面积；

A_1,2代表标准样品溶液1中m/z＝106的离子碎片的峰面积；

A_1,3代表标准样品溶液1中m/z＝149的离子碎片的峰面积；

A_1,4代表标准样品溶液1中m/z＝151的离子碎片的峰面积；

A_2,1代表标准样品溶液2中m/z＝70的离子碎片的峰面积；

A_2,2代表标准样品溶液2中m/z＝106的离子碎片的峰面积；

A_2,3代表标准样品溶液2中m/z＝149的离子碎片的峰面积；

A_2,4代表标准样品溶液2中m/z＝151的离子碎片的峰面积；

c取1.25μg/mL；k₁k₂k₃k₄分别为：14.650，36.306，43.950，43.954

计算求得样品中丙烯酰胺含量：13.73mg/kg。

方法学考察：

一、精密度实验

取实施例1中的待测样品溶液，按照上述检测方法，连续进样5次，测得的结果如表1所示：

表1平行测定5次的保留时间及峰面积

根据上述表格比较目标峰相对保留时间和峰面积，计算目标峰的相对标准偏差，结果表明，保留时间基本一致，RSD值在1.2％以内，都小于2％；峰面积的RSD值均在±5％以内，相对保留时间和相对峰面积的RSD都符合定量检测要求。

二、稳定性实验

取实施例1中的待测样品溶液，分别在样品放置0，2，4，8，16，24小时进行测定，测定结果如表2所示：

表2样品放置0，2，4，8，16，24h测定得到的保留时间及峰面积

比较目标峰相对保留时间和峰面积，计算每个峰的相对标准偏差。结果表明，目标峰相对保留时间基本一致，RSD在1.10％以内，都小于2％；目标峰面积的相对标准偏差均在±5％以内，相对保留时间和峰面积的RSD都符合定量检测要求。

三、重现性实验

取油炸马铃薯片5份，按照实施例1的方法分别制备5份平行待测样品溶液，按照实施例1的方法对5份平行待测样品溶液进行测定，测定结果如表3所示：

表35份平行待测样品溶液的保留时间和峰面积

计算每个峰的相对保留时间和峰面积的相对标准偏差。结果表明，各峰相对保留时间的RSD<2.00％，其值在2％以内；共有峰相对峰面积的相对标准偏差在±5％以内，符合定量检测要求。

四、加样回收率实验

取油炸马铃薯片2份，按照实施例1的方法分别制备4份平行待测样品溶液，按照实施例1的方法对4份待测样品溶液进行测定，并计算丙烯酰胺含量，测定结果如表4所示：

表44份平行待测样品溶液的加标回收率

计算每份待测样品加标前后丙烯酰胺含量，计算加标回收率。结果表明，加标回收率均大于85％，符合定量检测要求。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种食品中丙烯酰胺的GC-MS多离子参数检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

步骤一：制备标准样品溶液

取食品样品，将其粉碎，加水提取其中的丙烯酰胺，得提取液，取n个提取液，并分别向所述提取液中加入不同重量的内标丙烯酰胺，并对加入内标的n个提取液依次进行溴化衍生处理和转化处理，所得转化液即为所述标准样品溶液；

步骤二：制备待测样品溶液

取食品样品，将其粉碎，加水提取其中的丙烯酰胺，得提取液；对所述提取液依次进行溴化衍生处理和转化处理，所得转化液即为所述待测样品溶液；

步骤三：采用GC-MS方法检测所述标准样品溶液和待测样品溶液，获得离子流图和质谱图；

步骤四：依据所述质子流图和质谱图，采用多离子参数计算公式计算待测样品中丙烯酰胺含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多离子参数计算公式为： $C_{sample}=\frac{1}{4}\underset{j}{\&Sigma;}(k_j\&times;\frac{1}{3}\underset{i}{\&Sigma;}{A}_{i,j})-c$

k_j为

其中，c为内标的单位质量浓度，i×c为各标准样品溶液中标准品的最终质量浓度，单位为μg/mL；A_i,j为各碎片的峰面积(其中，i代表样品编号，i＝0，1，2，····，n，i＝0代表待测样品溶液；i＝1,2，…n分别代表第1、第2、…第n个标准品溶液；j代表离子碎片的质核比，j＝1，2，3，4，其中，j＝1对应m/z＝70的离子碎片，j＝2对应m/z＝106的离子碎片，j＝3对应m/z＝149的离子碎片，j＝4对应m/z＝151的离子碎片)。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：n为2，多

4.根据权利要求1-3任一所述的检测方法，其特征在于：所述溴化衍生处理的方法为：将提取液或含内标提取液进行离心处理，过滤离心所得的上清液，得滤液，向所述滤液中加入溴化钾，氢溴酸和饱和溴水，避光反应，反应完全后向反应液中加入硫代硫酸钠至反应液褪色，即得衍生液；优选地，每20mL滤液中加入5-10g溴化钾，0.2-0.6mL氢溴酸，5-10mL饱和溴水；进一步优选地，每20mL滤液中加入7.5g溴化钾，0.4mL氢溴酸，8mL饱和溴水。

5.根据权利要求1-4任一所述的检测方法，其特征在于：在进行转化处理前，还包括对衍生液进行提纯的步骤，所述提纯为：向所述衍生液中加入有机溶剂进行萃取，收集有机相进行后续的转化反应；优选地，所述有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、水、乙醇中的一种或几种，进一步优选为氯仿。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述有机碱为一乙胺、二乙胺、三乙胺中的一种或多种，优选为三乙胺，进一步优选每1mL有机相中加入40-60μL三乙胺进行转化反应。

7.根据权利要求1-6任一所述的检测方法，其特征在于：所述GC-MS中气相色谱条件为以下(1)-(5)中的任意一项或几项：

(1)采用HP-5mass色谱柱；

(2)进样口温度270-290℃；

(3)载气为高纯氦气，载气流速为0.5-1.5mL/min；

(4)程序升温：起始温度45-55℃，保持2-3min，2-3℃/min升至70-85℃，保持1-2min，再以10-15℃/min升至240-250℃保持4-6min；

(5)进样0.05-0.15μL；

气相色谱条件优选以下(1)-(5)中的任意一项或几项：

(1)采用HP-5mass色谱柱；

(2)进样口温度280℃；

(3)载气为高纯氦气，载气流速为1.0mL/min；

(4)程序升温：起始温度50℃，保持3.0min，3℃/min升至80℃，保持1min，再以15℃/min升至250℃保持5min；

(5)进样0.1μL。

8.根据权利要求1-7任一所述的检测方法，其特征在于：所述GC-MS中质谱的条件为以下(1)-(8)中的任意一项或几项：

(1)EI离子源；

(2)电子能量70eV；

(3)四极杆温度140-160℃；

(4)接口温度250-270℃；

(5)离子源温度220-240℃；

(6)自动调谐；

(7)选择监测离子扫描(SIM)模式；

(8)选定的扫描离子质荷比(m/z)分别为：70、106、149、151，各离子的丰度比：(m/z)70:106:149:151＝5.7:2.3:1.9:1.9；

质谱条件优选以下(1)-(8)中的任意一项或几项：

(1)EI离子源；

(2)电子能量70eV；

(3)四极杆温度150℃；

(4)接口温度260℃；

(5)离子源温度230℃；

(6)自动调谐；

(7)选择监测离子扫描(SIM)模式；

(8)选定的扫描离子质荷比(m/z)分别为：70、106、149、151，各离子的丰度比：(m/z)70:106:149:151＝5.7:2.3:1.9:1.9。

9.根据权利要求1-8任一所述的检测方法，其特征在于：在提取丙烯酰胺之前，还包括除去所述食品样品中油脂的步骤，具体为，将所述高淀粉热加工食品粉碎，加入有机溶剂萃取，弃去有机相，将水相用于后续的处理；所述有机溶剂优选为正己烷、乙醚、石油醚、氯仿中的一种或多种，进一步优选为石油醚。