CN105548219A - 一种同时检测牛奶样品中的多种磺胺类药物的方法 - Google Patents

一种同时检测牛奶样品中的多种磺胺类药物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测牛奶样品中的多种磺胺类药物的方法，步骤包括：将牛奶样品放入塑料离心管中，离心去除上层脂肪层，待用；将白色药片放入离心管中，加入去离子水，用漩涡混合器混合；将牛奶加入离心管中，混合均匀；向离心管中加入粉红色药片，混合均匀，置于电热恒温器中保温；取出离心管，将其放入离心机中离心，弃去上层液体，将离心管倒置，用棉签擦去脂肪环并吸干液体，向离心管中加入去离子水，用漩涡混合器将沉淀物打碎并混合均匀；向离心管中加入闪烁液，盖上盖子，用漩涡混合器混合均匀，然后采用液体闪烁计数分析仪计数，打印检测结果。本发明可同时检测牛奶样品中8种磺胺类药物，精密度和准确度均能达到要求。

Description

一种同时检测牛奶样品中的多种磺胺类药物的方法
技术领域
本发明涉及一种同时检测牛奶样品中的多种磺胺类药物的方法，属于乳及乳制品质量安全检测技术领域。
背景技术
目前，磺胺类药物(SAS)残留的检测方法很多,理化方法包括薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法、毛细管电泳法和超临界流体色谱法等。近年来，随着免疫分析方法的广泛应用，charmII的放射免疫分析法逐渐发展起来。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测牛奶样品中的多种磺胺类药物的方法。
本发明所采用的技术解决方案是：
一种同时检测牛奶样品中的多种磺胺类药物的方法，步骤包括：
(1)将牛奶样品放入塑料离心管中，离心去除上层脂肪层，待用；
(2)取出Charm试剂盒中的白色药片放入离心管中，加入去离子水，用漩涡混合器混合，将白色药片打碎；将步骤(1)去除脂肪层的牛奶加入离心管中，用漩涡混合器混合均匀；
(3)向步骤(2)离心管中加入粉红色药片，用漩涡混合器混合，将粉红色药片打碎并混合均匀，然后置于电热恒温器中保温；
(4)步骤(3)保温完成后，取出离心管，将其放入离心机中离心，离心完成后取出，弃去上层液体，然后将离心管倒置，用棉签擦去脂肪环并吸干液体，得到位于离心管下层的沉淀物；向离心管中加入去离子水，用漩涡混合器将沉淀物打碎并混合均匀；
(5)步骤(4)完成后，向离心管中加入闪烁液，盖上盖子，用漩涡混合器混合均匀，然后采用液体闪烁计数分析仪计数，打印检测结果。
步骤(1)中：所述离心转速优选为3500-4000r/min，离心时间优选为5-6min。
步骤(2)中：所述白色药片为受体试剂片。白色药片的用量优选为20mg。
步骤(3)中：所述粉红色药片为示踪剂，具体优选为[H]标记的磺胺二甲嘧啶，用量优选为20mg。
步骤(3)中：保温温度优选为85±2℃，保温时间优选为3-5min。
步骤(4)中：离心转速优选为3000-3400r/min，离心时间优选为2-3min。
步骤(5)中：所述闪烁液优选为对联三苯(TP)，闪烁液的加入量为3-5ml。
上述方法还包括磺胺类药物标准曲线的绘制步骤：在空白牛奶中分别加入不同浓度的磺胺类药物，以浓度为横坐标，相应的cpm值为纵坐标，绘制磺胺类药物的标准曲线；通过液体闪烁计数分析仪测得的cpm值，及磺胺类药物的标准曲线，得出牛奶样品中的磺胺类药物的浓度值。
本发明的有益技术效果是：
本发明建立了放射免疫法快速筛选抗生素的方法，可同时检测牛奶样品中的磺胺甲基嘧啶(Sulfamerazine,SM1)，磺胺二甲基嘧啶(Sulfamethazine,SM2)，磺胺甲氧哒嗪(Sulfamethoxypyridazine,SMP)，磺胺嘧啶(Sulfadiazine,SD)，磺胺甲基异噁唑(Sulfamethoxazole,SMZ)，磺胺间甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine,SMM)，磺胺间二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine,SDM)和磺胺喹噁啉(Sulfadimethoxine,SQX)等8种磺胺类药物，样品只需简单离心便可直接检测，20min可以完成单份样品的检测，该方法方便快速,精密度和准确度均能达到要求。
附图说明
图1为磺胺二甲基嘧啶浓度标准曲线。
具体实施方式
本发明建立了放射免疫法快速筛选抗生素的方法，可同时检测牛奶样品中的磺胺甲基嘧啶，磺胺二甲基嘧啶，磺胺甲氧哒嗪，磺胺嘧啶，磺胺甲基异噁唑，磺胺间甲氧嘧啶，磺胺间二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉等8种磺胺类药物。该方法方便快速,精密度和准确度均能达到要求。
一种可同时检测牛奶样品中的8种磺胺类药物的快速筛选方法，包括以下步骤：
(1)将15-20ml牛奶样品放入塑料离心管中，离心去除上层脂肪层，待用；离心转速为3500-4000r/min，离心时间为5-6min。
(2)取出Charm试剂盒中的白色药片，将其放入离心管中，加入去离子水，用漩涡混合器混合，将白色药片打碎；将步骤(1)去除脂肪层的部分牛奶加入离心管中，用漩涡混合器混合均匀。所述白色药片为受体试剂片，用量20mg。
(3)向步骤(2)离心管中加入粉红色药片，用漩涡混合器混合，将粉红色药片打碎并混合均匀，然后置于电热恒温器中保温，保温温度为85±2℃，保温时间为3-5min。所述粉红色药片为放置于Charm试剂盒中的示踪剂，具体为[H]标记的磺胺二甲嘧啶，用量为20mg。
(4)步骤(3)保温完成后，取出离心管，将其放入离心机中离心，离心转速为3000-3400r/min，离心时间为2-3min，离心完成后取出，弃去上层液体，然后将离心管倒置，用棉签擦去脂肪环并吸干液体，得到位于离心管底部的沉淀物。向离心管中加入去离子水，用漩涡混合器将沉淀物打碎并混合均匀。
(5)步骤(4)完成后，向离心管中加入3-5ml对联三苯，盖上盖子，用漩涡混合器混合均匀，然后采用液体闪烁计数分析仪计数，打印检测结果。
上述步骤中还包括磺胺类药物标准曲线的绘制步骤：在空白牛奶中分别加入不同浓度的磺胺类药物，以浓度为横坐标，相应的cpm值为纵坐标，分别绘制8种磺胺类药物的标准曲线。通过液体闪烁计数分析仪测得的cpm值，及8种磺胺类药物的标准曲线，得出牛奶样品中的8种磺胺类药物的浓度值，最后打印出检测结果。
下面通过相关试验等来对本发明作进一步说明。
(1)磺胺类药物加标试验，以磺胺二甲基嘧啶为代表进行说明：取阴性牛奶样本,进行不同浓度的磺胺二甲基嘧啶加标试验。表1示出磺胺二甲基嘧啶添加浓度与cpm值的关系。取各个不同浓度的加标样品平行测试，cpm读数平均值加上3倍标准偏差作为各自相对应筛选水平的控制点。本方法的阳性控制点是通过磺胺二甲基嘧啶加标试验来决定的，浓度为10μg/L。确定控制点：6次阳性对照(含磺胺二甲基嘧啶10μg/L)的平均值×(1+24％)＝1292。图1为磺胺二甲基嘧啶浓度标准曲线。从图1中可判断其大约浓度在2～4μg/L之间。由此可以说明，控制点的浓度与检测限浓度之间有3倍的范围，完全可以保证在控制点附近上下波动的阴性结果不会出现假阳性。表2示出8种磺胺类药物的加标试验。从表2中可以看出，8种不同种类的磺胺药物在10μg/L的添加水平时的cpm值与控制点比较，均显示为阳性，证明8种磺胺类药物可以100％被检出。而当添加水平降低到5μg/L时，磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶不能被检测出，说明这3种磺胺药物的灵敏度低。因此,确定磺胺类药物大类筛选的检测限为10μg/L。
(2)放射免疫法试验的精密度和灵敏度：在阴性空白牛奶中分别加入8种磺胺类药物，配制成浓度为5μg/L和10μg/L的牛奶样品用于检测。同时用空白牛奶作阴性对照，检测其cpm值及精密度,结果如表3所示，表3示出8种磺胺药物混合标准品测定结果(n＝6)。8种磺胺类药物在添加浓度5μg/L时,变异系数在1.69％～11.48％之间；添加浓度为10μg/L时,变异系数在1.79％～5.56％之间。各种磺胺类药物浓度在10μg/L时,6个平行测试可100％被检测出，说明放射免疫法在精密度和准确度上能达到要求。
(3)8种磺胺类药物间的交叉反应：将8种磺胺类药物配成浓度为100μg/L的混合标准品，取不同的量加入到空白牛奶中，配制成浓度为5μg/L和10μg/L的加标牛奶样品，检测cpm值，结果表明当混合标准品的浓度为5μg/L时，6个平行样品可100％被检测出。
(4)磺胺类药物与其它药物的交叉反应：将氨青霉素、阿莫西林、四环素、链霉素、红霉素、庆大霉素标准品分别配制成浓度为100μg/L的牛奶标准溶液,分别用磺胺类charmII药片检测其cpm值。用磺胺增效剂甲氧苄氨嘧啶分别配制成浓度为50、1000和10000μg/L的牛奶样品，作加标试验，检测其cpm值。结果显示,charmII的磺胺类抗生素检测抗体，特异性强，与本族以外的抗生素无交叉反应。
下面结合具体实施例对本发明进行更具体的阐述。实施例中的具体参数仅用于说明本发明而不用于限定范围，本领域内技术人员可以适当修改本发明参数。
表1
表2
表3
实施例1
取20mL牛奶于塑料离心管中，4000r/min离心5min，去除上层脂肪层待用。取出Charm试剂盒中的检测试剂片，将20mg受体试剂片放入离心管中；加入300μL去离子水，用旋涡混合器混合约10s，将药片打碎。在离心管中加入5mL备用牛奶，用漩涡混合器混合均匀(约上下10次)。在离心管中加入20mg[H]标记的磺胺二甲嘧啶,在旋涡混合器上混合约10s。置于电热恒温器中(85±2℃)保温3min；取出离心管，3400r/min离心3min。从离心机中取出离心管,弃去上层液体，倒置，用棉签擦去脂肪环并吸干液体，得到位于离心管底部的沉淀物。向离心管中加入300μL去离子水，混匀，将沉淀物在旋涡混合器上打碎；加入3mL闪烁液,盖上盖子,在旋涡混合器上混匀；液体闪烁计数分析仪计数,打印检测结果。
实施例2
取20mL牛奶于塑料离心管中，3500r/min离心6min，去除上层脂肪层待用。取出Charm试剂盒中的检测试剂片,将20mg受体试剂片放入离心管中；加入300μL去离子水，用旋涡混合器混合约10s,将药片打碎。在离心管中加入5mL备用牛奶,用漩涡混合器混合均匀(约上下10次)。在离心管中加入20mg[H]标记的磺胺二甲嘧啶，在旋涡混合器上混合约10s。置于电热恒温器中(85±2℃)保温5min；取出离心管，3000r/min离心3min。从离心机中取出离心管,弃去上层液体，倒置，用棉签擦去脂肪环并吸干液体，得到位于离心管底部的沉淀物。向离心管中加入300μL去离子水，混匀，将沉淀物在旋涡混合器上打碎；加入4mL闪烁液,盖上盖子,在旋涡混合器上混匀；液体闪烁计数分析仪计数,打印检测结果。
实施例3
取20mL牛奶于塑料离心管中，4000r/min离心5min，去除上层脂肪层待用。取出Charm试剂盒中的检测试剂片，将受体试剂片放入离心管中；加入300μL去离子水,用旋涡混合器混合约10s，将药片打碎。在离心管中加入5mL备用牛奶，用漩涡混合器混合均匀(约上下10次)。在离心管中加入[H]标记的磺胺二甲嘧啶，在旋涡混合器上混合约15s。置于电热恒温器中(85±2℃)保温4min；取出离心管，3400r/min离心2min。从离心机中取出离心管，弃去上层液体，倒置，用棉签擦去脂肪环并吸干液体，得到位于离心管底部的沉淀物。向离心管中加入300μL去离子水，混匀，将沉淀物在旋涡混合器上打碎；加入5mL闪烁液，盖上盖子，在旋涡混合器上混匀；液体闪烁计数分析仪计数，打印检测结果。
上述方式中未述及的有关技术内容采取或借鉴已有技术即可实现。
还需要说明的是，在本说明书的教导下本领域技术人员还可以作出这样或那样的容易的变化方式，诸如等同方式，或明显变形方式；上述变化方式均应在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种同时检测牛奶样品中的多种磺胺类药物的方法，其特征在于，步骤包括：
(1)将牛奶样品放入塑料离心管中，离心去除上层脂肪层，待用；
(2)取出Charm试剂盒中的白色药片放入离心管中，加入去离子水，用漩涡混合器混合，将白色药片打碎；将步骤(1)去除脂肪层的牛奶加入离心管中，用漩涡混合器混合均匀；
(3)向步骤(2)离心管中加入粉红色药片，用漩涡混合器混合，将粉红色药片打碎并混合均匀，然后置于电热恒温器中保温；
(4)步骤(3)保温完成后，取出离心管，将其放入离心机中离心，离心完成后取出，弃去上层液体，然后将离心管倒置，用棉签擦去脂肪环并吸干液体，得到位于离心管下层的沉淀物；向离心管中加入去离子水，用漩涡混合器将沉淀物打碎并混合均匀；
(5)步骤(4)完成后，向离心管中加入闪烁液，盖上盖子，用漩涡混合器混合均匀，然后采用液体闪烁计数分析仪计数，打印检测结果。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测牛奶样品中的多种磺胺类药物的方法，其特征在于，步骤(1)中：所述离心转速为3500-4000r/min，离心时间为5-6min。
3.根据权利要求1所述的一种同时检测牛奶样品中的多种磺胺类药物的方法，其特征在于，步骤(2)中：所述白色药片为受体试剂片。
4.根据权利要求1所述的一种同时检测牛奶样品中的多种磺胺类药物的方法，其特征在于，步骤(2)中：所述白色药片的用量为20mg。
5.根据权利要求1所述的一种同时检测牛奶样品中的多种磺胺类药物的方法，其特征在于，步骤(3)中：所述粉红色药片为示踪剂。
6.根据权利要求5所述的一种同时检测牛奶样品中的多种磺胺类药物的方法，其特征在于：所述示踪剂为[H]标记的磺胺二甲嘧啶，用量为20mg。
7.根据权利要求1所述的一种同时检测牛奶样品中的多种磺胺类药物的方法，其特征在于，步骤(3)中：保温温度为85±2℃，保温时间为3-5min。
8.根据权利要求1所述的一种同时检测牛奶样品中的多种磺胺类药物的方法，其特征在于，步骤(4)中：离心转速为3000-3400r/min，离心时间为2-3min。
9.根据权利要求1所述的一种同时检测牛奶样品中的多种磺胺类药物的方法，其特征在于，步骤(5)中：所述闪烁液为对联三苯，闪烁液的加入量为3-5ml。
10.根据权利要求1所述的一种同时检测牛奶样品中的多种磺胺类药物的方法，其特征在于，还包括磺胺类药物标准曲线的绘制步骤：在空白牛奶中分别加入不同浓度的磺胺类药物，以浓度为横坐标，相应的cpm值为纵坐标，绘制磺胺类药物的标准曲线；通过液体闪烁计数分析仪测得的cpm值，及磺胺类药物的标准曲线，得出牛奶样品中的磺胺类药物的浓度值。
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