CN105543100A - 一种用间歇光两步法培养洛氏角毛藻的方法 - Google Patents

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王培磊
吕慎金
刘笑天
李爱水
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor

Abstract

本发明公开了一种用间歇光两步法培养洛氏角毛藻的方法，属水产养殖领域。与传统技术相比，本发明洛氏角毛藻培养液配方更加科学合理，用容量瓶和万用瓶两步法并采用间歇光培养洛氏角毛藻，藻类生长快，产量高，多不饱和脂肪酸含量高，设备简单，操作灵活，洗刷方便，成本低，生产稳定，不受季节影响且环保、节能，操作方便，不易污染，藻产量提高80％。

Description

一种用间歇光两步法培养洛氏角毛藻的方法
技术领域
本发明属于水产养殖领域，尤其涉及一种用间歇光两步法培养洛氏角毛藻的方法。
背景技术
洛氏角毛藻隶属硅藻门、中心纲、盒形藻目、角毛藻科、角毛藻属，是一种小型海洋浮游硅藻，细胞小，壁薄，单个生活。在10-39℃环境下均能生长繁殖，最适温度25-35℃，是一种沿岸性半咸水种类。与其它藻类相比，它繁殖快且耐高温，多不饱和脂肪酸含量较高，在良好培养条件下，其二十碳五烯酸(EPA)占总脂肪酸含量的10.20％。洛氏角毛藻生长快速，尤其是在春夏季节，常成为浮游植物优势类群。因此，其种类组成和细胞丰度对海洋生态系统中其它生物以及海洋环境有直接或间接影响，具重要研究价值。洛氏角毛藻是对虾、海参、文蛤、牡蛎、魁蚶、海胆等的优质饵料，可用于培养双壳类、海胆、海参、甲壳类等的幼体。
关于角毛藻的培养液配方和培养方法，过去，杨彦豪发明了一种牟氏角毛藻的培养基配方及全人工快速培养方法(申请号CN201310420414.5)。培养基配方包括尿素0.1～0.3g/L，碳酸氢钠0.05～0.1g/L，硅酸钠水结晶0.1～0.5g/L，磷酸二氢钾0.01～0.02g/L，EDTA3～5g/L，VB11～5mg/L，VB121.0～3μg/L，配方溶剂为海水；培养方法为对培养罐、海水消毒后，以海水为溶剂按照以上配方配培养基，将接藻种接入装有培养基的培养罐中，密封后培养，培养时进行三基色灯光光照并充入经过孔径小于0.1μm空气滤芯过滤的空气，培养3～5天后采收。该发明培养基配方营养均衡、成本低，培养方法使角毛藻快速生长，过程操作简单，但基础投资大，易污染，洗刷困难，操作不灵活，占地面积大，生产受季节影响大，不稳定。李色东等发明了一种适用于大规模培养牟氏角毛藻的大量元素营养盐培养基及其制备方法(申请号CN201510686861.4)，该大量元素配方培养基是由母液A和母液B按照体积比1∶1混合制得，其中，母液A由20-25重量份的碳酸氢铵、1-2重量份的磷酸二氢钠、0.39重量份的三氯化铁、1.64重量份的乙二胺四乙酸二钠、水余量组成的1000的母液A；母液B由15～20重量份的硅酸钠、1000重量份的水组成。采用该发明的大量元素营养盐配方养殖的牟氏角毛藻，可以促进牟氏角毛藻的生长，延长培养时间、实现其高密度培养、降低培育成本，但操作麻烦，易污染。为了克服目前技术不足，本发明公开了一种用间歇光两步法培养洛氏角毛藻的方法。与传统技术相比，本发明洛氏角毛藻培养液配方更加科学合理，用容量瓶和万用瓶两步法并采用间歇光培养洛氏角毛藻，藻类生长快，产量高，多不饱和脂肪酸含量高，设备简单，操作灵活，洗刷方便，成本低，生产稳定，不受季节影响且环保、节能，操作方便，不易污染，藻产量提高80％。
发明内容
本发明的目的是提供一种用间歇光两步法培养洛氏角毛藻的方法，本目的是通过如下技术方案实现的：
步骤1洛氏角毛藻培养液的配制洛氏角毛藻培养液由以下重量份数的配料组成：尿素0.01-0.03份，氯化铵0.03-0.05份，碳酸铵0.6-0.8份，工业氨水(含氨25％-28％)1.2-1.5份，过磷酸钙0.1-0.2份，磷酸二氢钾0.05-0.08份，丙酸钙0.2-0.5份，硅酸钾0.03-0.07份，氯化铁0.003-0.006份，草酸钛0.07-0.09份，重铬酸钾0.0004-0.0008份，五氧化二钒0.005-0.009份，维生素B10.00001-0.00002份，维生素B120.005-0.007份，维生素H0.0006-0.0008份，叶酸0.0004-0.0008份，肌醇0.002-0.004份，复合中草药液1.5-2.7份，吲哚乙酸0.0001-0.0004份，磁化海水1000份。其中复合中草药液制备方法：按重量比取当归3-6份，陈皮4-9份，金银花1-3份，杜仲5-7份，丹参7-9份，纯净水1000份，加热，煮沸，然后文火继续煮沸3分钟，停火，冷却到室温，弃药渣，取药液。
培养液中各组分的生理功能如下：尿素，氯化铵，碳酸铵，工业氨水，过磷酸钙，磷酸二氢钾主要提供洛氏角毛藻生长所需要的氮、磷；丙酸钙，硅酸钾，氯化铁，草酸钛，重铬酸钾，五氧化二钒主要提供微量元素钙，硅，铁，钛，铬和钒；维生素B1，维生素B12，维生素H，叶酸，肌醇主要提供各种维生素；复合中草药液主要用于杀灭和抑制藻液中的细菌、病毒和原生动物；吲哚乙酸是一种植物生长刺激素，对洛氏角毛藻生长有良好促进作用。
步骤2洛氏角毛藻的第一步培养方法采用容量瓶培养。取一透明、玻璃质、容积为1000毫升的容量瓶，洗刷干净，用蒸馏水润洗3遍，加入步骤1所述的洛氏角毛藻培养液500毫升，取处于指数生长期、干净、无污染、生长旺盛的洛氏角毛藻藻种接种，接种密度2.5万个细胞/毫升，轻轻摇匀，去掉容量瓶瓶塞，用双层、干净的报纸和橡皮筋封住瓶口。把此容量瓶连同其中的藻液一起放进光照培养箱中培养，共培养8天，前4天，培养箱设置光照强度3500lux，温度24℃，光暗周期设为L15min+D15min，即15分钟光照，15分钟黑暗，然后再15分钟光照，15分钟黑暗，循环往复；后4天，设置光照强度6000lux，温度25℃，光暗周期设为L30min+D30min，即30分钟光照，30分钟黑暗，然后再30分钟光照，30分钟黑暗，循环往复；到第5天，添加步骤1所述的新鲜培养液35毫升，以补充因生长繁殖消耗掉的营养盐，到第7天，添加蒸馏水25毫升，补充挥发掉的水分并稀释藻液。整个培养期间，每天手动摇瓶6次，即每隔4小时摇动一次，每次30秒钟。到第8天末，藻细胞密度可达150±20万个细胞/毫升，停止培养，取下橡皮筋和报纸，将藻液从瓶口倒出，此藻液作为下一级培养的藻种。
步骤3洛氏角毛藻的第二步培养方法采用万用瓶培养。万用瓶的制作方法：取一白色、透明、5000毫升的三角烧瓶，洗刷干净，洗刷干净，再采用消毒剂浸泡消毒20分钟，所述消毒剂为中草药复合消毒剂；所述中草药复合消毒剂组成成分(重量份数比)：红背菜2-4份，鱼腥草6-9份，柴胡5-8份，连钱草7-12份，藿香10-15份，苍术7-12份，地肤子8-15份，紫花地丁5-7份，麦冬3-6份，板蓝根0.5-0.9份，百部10-14份，穿心莲5-8份，蒲公英2-6份，桑黄1-3份；所述中草药复合消毒剂制备方法是按重量比例称取各成分，纯净水1000份，加热，煮沸，然后文火继续煮沸3分钟，停火，冷却到室温，弃药渣，取药液；再取一大小合适的橡胶塞，塞子上打2个直径5毫米的孔，插入2根直径5毫米的“L”形的玻璃管，其中一根垂直部分长60厘米，穿过橡胶塞，底部离瓶底1厘米，水平部分长20厘米，通过料管与空压机相连，用以充气，另一根玻璃管垂直部分长15厘米，底部穿过橡胶塞即可，水平部分长12厘米，用以排气。三角烧瓶通过瓶口装入步骤1所述的培养液2500毫升，用步骤1培养的藻液作为藻种进行接种，接种密度3.5万个细胞/毫升，连接好橡胶塞和玻璃管及空压机，将此培养装置放进微藻培养室中进行培养，培养室空调控温，日光灯管提供照明，以打开灯管的数量多少来调节光照强度。开始充气，进行培养，充气量为2升/分钟，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可，充气量太大会打碎藻细胞；共培养10天，前5天，设置光照强度4000lux，温度24℃，光周期设为L25min+D25min，即25分钟光照，25分钟黑暗，然后再25分钟光照，25分钟黑暗，循环往复；后5天，设置光照强度7000lux，温度26℃，光周期设为L45min+D45min，即45分钟光照，45分钟黑暗，然后再45分钟光照，45分钟黑暗，循环往复；到第7天，添加步骤1所述的洛氏角毛藻培养液250毫升，以补充因细胞生长、繁殖消耗掉的营养盐，到第8天，添加蒸馏水300毫升，以补充挥发掉的水分并稀释藻液。到第10天末，细胞密度达180±20万个细胞/毫升，停止充气和照明，拔掉橡胶塞，将藻液从瓶口倒出，培养结束。
有益结果
与传统技术相比，本发明洛氏角毛藻培养液配方更加科学合理，用容量瓶和万用瓶两步法并采用间歇光培养洛氏角毛藻，藻类生长快，产量高，多不饱和脂肪酸含量高，设备简单，操作灵活，洗刷方便，成本低，生产稳定，不受季节影响且环保、节能，操作方便，不易污染，藻产量提高80％。
附图说明
图1用容量瓶培养洛氏角毛藻的示意图；
即洛氏角毛藻的的第一步培养方法；其中附图标记为：1报纸和橡皮筋封口，2藻液；
图2用万用瓶培养洛氏角毛藻的示意图；
即洛氏角毛藻的的第二步培养方法；其中附图标记为：3空压机，4藻液。其中，箭头所指为充气气体走向。
具体实施方式
下面结合实施例进一步对该技术进行说明。
实施例1洛氏角毛藻培养液由以下重量份数的配料组成：尿素0.01份，氯化铵0.03份，碳酸铵0.6份，工业氨水(含氨25％-28％)1.3份，过磷酸钙0.1份，磷酸二氢钾0.06份，丙酸钙0.2份，硅酸钾0.03份，氯化铁0.003份，草酸钛0.07份，重铬酸钾0.0004份，五氧化二钒0.006份，维生素B10.00001份，维生素B120.005份，维生素H0.0006份，叶酸0.0005份，肌醇0.002份，复合中草药液1.8份，吲哚乙酸0.0002份，磁化海水1000份。实施例2洛氏角毛藻培养液由以下重量份数的配料组成：尿素0.02份，氯化铵0.04份，碳酸铵0.7份，工业氨水(含氨25％-28％)1.3份，过磷酸钙0.1份，磷酸二氢钾0.07份，丙酸钙0.4份，硅酸钾0.06份，氯化铁0.005份，草酸钛0.08份，重铬酸钾0.0006份，五氧化二钒0.008份，维生素B10.00001份，维生素B120.006份，维生素H0.0007份，叶酸0.0006份，肌醇0.003份，复合中草药液2.2份，吲哚乙酸0.0002份，磁化海水1000份。实施例3洛氏角毛藻培养液由以下重量份数的配料组成：尿素0.03份，氯化铵0.05份，碳酸铵0.8份，工业氨水(含氨25％-28％)1.4份，过磷酸钙0.2份，磷酸二氢钾0.08份，丙酸钙0.5份，硅酸钾0.07份，氯化铁0.006份，草酸钛0.09份，重铬酸钾0.0008份，五氧化二钒0.009份，维生素B10.00002份，维生素B120.007份，维生素H0.0008份，叶酸0.0007份，肌醇0.004份，复合中草药液2.6份，吲哚乙酸0.0004份，磁化海水1000份。上述实施例中的任何一种都是通过如下两步方法来实现对洛氏角毛藻的培养：
洛氏角毛藻的第一步培养方法取一透明、玻璃质、容积为1000毫升的容量瓶，洗刷干净，用蒸馏水润洗3遍，加入步骤1所述的洛氏角毛藻培养液500毫升，取处于指数生长期、干净、无污染、生长旺盛的洛氏角毛藻藻种接种，接种密度2.5万个细胞/毫升，轻轻摇匀，去掉容量瓶瓶塞，用双层、干净的报纸和橡皮筋封住瓶口。把此容量瓶连同其中的藻液一起放进光照培养箱中培养，共培养8天，前4天，培养箱设置光照强度3500lux，温度24℃，光暗周期设为L15min+D15min，即15分钟光照，15分钟黑暗，然后再15分钟光照，15分钟黑暗，循环往复；后4天，设置光照强度6000lux，温度25℃，光暗周期设为L30min+D30min，即30分钟光照，30分钟黑暗，然后再30分钟光照，30分钟黑暗，循环往复；到第5天，添加步骤1所述的新鲜培养液35毫升，以补充因生长繁殖消耗掉的营养盐，到第7天，添加蒸馏水25毫升，补充挥发掉的水分并稀释藻液。整个培养期间，每天手动摇瓶6次，即每隔4小时摇动一次，每次30秒钟。到第8天末，藻细胞密度可达150±20万个细胞/毫升，停止培养，取下橡皮筋和报纸，将藻液从瓶口倒出，此藻液作为下一级培养的藻种。
洛氏角毛藻的第二步培养方法采用万用瓶培养。采用万用瓶培养。万用瓶的制作方法：取一白色、透明、5000毫升的三角烧瓶，洗刷干净，再采用消毒剂浸泡消毒20分钟，所述消毒剂为中草药复合消毒剂；所述中草药复合消毒剂组成成分(重量份数比)：红背菜2-4份，鱼腥草6-9份，柴胡5-8份，连钱草7-12份，藿香10-15份，苍术7-12份，地肤子8-15份，紫花地丁5-7份，麦冬3-6份，板蓝根0.5-0.9份，百部10-14份，穿心莲5-8份，蒲公英2-6份，桑黄1-3份；所述中草药复合消毒剂制备方法是按重量比例称取各成分，纯净水1000份，加热，煮沸，然后文火继续煮沸3分钟，停火，冷却到室温，弃药渣，取药液；再取一大小合适的橡胶塞，塞子上打2个直径5毫米的孔，插入2根直径5毫米的“L”形的玻璃管，其中一根垂直部分长60厘米，穿过橡胶塞，底部离瓶底1厘米，水平部分长20厘米，通过料管与空压机相连，用以充气，另一根玻璃管垂直部分长15厘米，底部穿过橡胶塞即可，水平部分长12厘米，用以排气。三角烧瓶通过瓶口装入步骤1所述的培养液2500毫升，用步骤1培养的藻液作为藻种进行接种，接种密度3.5万个细胞/毫升，连接好橡胶塞和玻璃管及空压机，将此培养装置放进微藻培养室中进行培养，培养室空调控温，日光灯管提供照明，以打开灯管的数量多少来调节光照强度。开始充气，进行培养，充气量为2升/分钟，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可，充气量太大会打碎藻细胞；共培养10天，前5天，设置光照强度4000lux，温度24℃，光周期设为L25min+D25min，即25分钟光照，25分钟黑暗，然后再25分钟光照，25分钟黑暗，循环往复；后5天，设置光照强度7000lux，温度26℃，光周期设为L45min+D45min，即45分钟光照，45分钟黑暗，然后再45分钟光照，45分钟黑暗，循环往复；到第7天，添加步骤1所述的洛氏角毛藻培养液250毫升，以补充因细胞生长、繁殖消耗掉的营养盐，到第8天，添加蒸馏水300毫升，以补充挥发掉的水分并稀释藻液。到第10天末，细胞密度达180±20万个细胞/毫升，停止充气和照明，拔掉橡胶塞，将藻液从瓶口倒出，培养结束。
步骤1中所述尿素，氯化铵，碳酸铵，过磷酸钙，磷酸二氢钾，丙酸钙，硅酸钾，氯化铁，草酸钛，重铬酸钾，五氧化二钒，维生素B1，维生素B12，维生素H，叶酸，肌醇，吲哚乙酸化学药品纯度均需化学纯级别，但工业氨水是工业纯级别；
步骤1所述工业氨水是含氨25％-28％的水溶液，氨水中仅有一小部分氨分子与水反应形成铵离子和氢氧根离子，即氢氧化铵，是仅存在于氨水中的弱碱。工业氨水无色透明且具有刺激性气味，有毒，对眼、鼻、皮肤有刺激性和腐蚀性，能使人窒息，故操作过程中需带口罩和胶皮手套；
步骤1所述磁化海水制备方法：取海水，脱脂棉过滤，加热，煮沸3-5分钟，冷却，流经磁化水器后，即为磁化水；磁化水器磁感应强度为0.3T，流量为2-3t/h，流速为0.1-0.2m/s；步骤2所述洛氏角毛藻接种过程需在无菌操作台上进行；
步骤2中接种用的洛氏角毛藻预先进行提纯(本领域常规方法，只要可实现提纯即可，例如郭氏提取法)，以确保接种时藻种为纯种且处于生长旺盛的指数生长期；
步骤2中所述容量瓶不耐高温，洗刷时不可在火炉上加热蒸煮消毒或直接用开水烫，应该用10％稀硫酸或12％稀盐酸洗刷干净，再用蒸馏水润洗3-5遍；
步骤3中所述万用瓶也可以直接从化学玻璃仪器公司购买。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.一种用于间歇光两步法培养洛氏角毛藻的培养液，其特征在于，洛氏角毛藻培养液由以下重量份数的原料组成：尿素0.01-0.03份，氯化铵0.03-0.05份，碳酸铵0.6-0.8份，工业氨水(含氨25％-28％)1.2-1.5份，过磷酸钙0.1-0.2份，磷酸二氢钾0.05-0.08份，丙酸钙0.2-0.5份，硅酸钾0.03-0.07份，氯化铁0.003-0.006份，草酸钛0.07-0.09份，重铬酸钾0.0004-0.0008份，五氧化二钒0.005-0.009份，维生素B10.00001-0.00002份，维生素B120.005-0.007份，维生素H0.0006-0.0008份，叶酸0.0004-0.0008份，肌醇0.002-0.004份，复合中草药液1.5-2.7份，吲哚乙酸0.0001-0.0004份，磁化海水1000份；其中复合中草药液制备方法：按重量比取当归3-6份，陈皮4-9份，金银花1-3份，杜仲5-7份，丹参7-9份，纯净水1000份，加热，煮沸，然后文火继续煮沸3分钟，停火，冷却到室温，弃药渣，取药液。
2.根据权利要求1所述的一种用于间歇光两步法培养洛氏角毛藻的培养液培养洛氏角毛藻的方法，其特征在于，洛氏角毛藻的第一步培养方法，采用容量瓶培养；取一透明、玻璃质、容积为1000毫升的容量瓶，洗刷干净，用蒸馏水润洗3遍，加入权利要求1所述的洛氏角毛藻培养液500毫升，取处于指数生长期、干净、无污染、生长旺盛的洛氏角毛藻藻种接种，接种密度2.5万个细胞/毫升，轻轻摇匀，去掉容量瓶瓶塞，用双层、干净的报纸和橡皮筋封住瓶口；把此容量瓶连同其中的藻液一起放进光照培养箱中培养，共培养8天，前4天，培养箱设置光照强度3500lux，温度24℃，光暗周期设为L15min+D15min，即15分钟光照，15分钟黑暗，然后再15分钟光照，15分钟黑暗，循环往复；后4天，设置光照强度6000lux，温度25℃，光暗周期设为L30min+D30min，即30分钟光照，30分钟黑暗，然后再30分钟光照，30分钟黑暗，循环往复；到第5天，添加步骤1所述的新鲜培养液35毫升，以补充因生长繁殖消耗掉的营养盐，到第7天，添加蒸馏水25毫升，补充挥发掉的水分并稀释藻液；整个培养期间，每天手动摇瓶6次，即每隔4小时摇动一次，每次30秒钟；到第8天末，藻细胞密度可达150±20万个细胞/毫升，停止培养，取下橡皮筋和报纸，将藻液从瓶口倒出，此藻液作为下一级培养的藻种；
洛氏角毛藻的第二步培养方法，采用万用瓶培养；万用瓶的制作方法：取一白色、透明、5000毫升的三角烧瓶，洗刷干净，再采用消毒剂浸泡消毒20分钟，所述消毒剂为中草药复合消毒剂；所述中草药复合消毒剂组成成分(重量份数比)：红背菜2-4份，鱼腥草6-9份，柴胡5-8份，连钱草7-12份，藿香10-15份，苍术7-12份，地肤子8-15份，紫花地丁5-7份，麦冬3-6份，板蓝根0.5-0.9份，百部10-14份，穿心莲5-8份，蒲公英2-6份，桑黄1-3份；所述中草药复合消毒剂制备方法是按重量比例称取各成分，纯净水1000份，加热，煮沸，然后文火继续煮沸3分钟，停火，冷却到室温，弃药渣，取药液；再取一大小合适的橡胶塞，塞子上打2个直径5毫米的孔，插入2根直径5毫米的“L”形的玻璃管，其中一根垂直部分长60厘米，穿过橡胶塞，底部离瓶底1厘米，水平部分长20厘米，通过料管与空压机相连，用以充气，另一根玻璃管垂直部分长15厘米，底部穿过橡胶塞即可，水平部分长12厘米，用以排气；三角烧瓶通过瓶口装入步骤1所述的培养液2500毫升，用步骤1培养的藻液作为藻种进行接种，接种密度3.5万个细胞/毫升，连接好橡胶塞和玻璃管及空压机，将此培养装置放进微藻培养室中进行培养，培养室空调控温，日光灯管提供照明，以打开灯管的数量多少来调节光照强度；开始充气，进行培养，充气量为2升/分钟，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可，充气量太大会打碎藻细胞；共培养10天，前5天，设置光照强度4000lux，温度24℃，光周期设为L25min+D25min，即25分钟光照，25分钟黑暗，然后再25分钟光照，25分钟黑暗，循环往复；后5天，设置光照强度7000lux，温度(26℃)，光周期设为L45min+D45min，即45分钟光照，45分钟黑暗，然后再45分钟光照，45分钟黑暗，循环往复；到第7天，添加步骤1所述的洛氏角毛藻培养液250毫升，以补充因细胞生长、繁殖消耗掉的营养盐，到第8天，添加蒸馏水300毫升，以补充挥发掉的水分并稀释藻液；到第10天末，细胞密度达180±20万个细胞/毫升，停止充气和照明，拔掉橡胶塞，将藻液从瓶口倒出，培养结束。
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