CN105541665A

CN105541665A - 一种抗肿瘤药物化合物及制备方法和应用

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Publication number: CN105541665A
Application number: CN201610090075.2A
Authority: CN
Inventors: 陈秋云; 路文龙
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2016-02-18
Filing date: 2016-02-18
Publication date: 2016-05-04

Abstract

一种抗肿瘤药物化合物及制备方法和应用。本发明涉及一种N-2-脱氧葡萄糖基二甲双胍的合成以及在乳酸脱氢酶及肿瘤细胞内ATP抑制及抗肿瘤方面的作用，属于有机药物领域。将2-脱氧葡萄糖与盐酸二甲双胍以摩尔比3:1-1:3比例混合，溶于甲醇中，氮气保护下，油浴温度10-80℃反应1-6h，减压蒸馏蒸掉溶剂，重结晶得化合物N-2-脱氧葡萄糖二甲双胍(简称2-DG-M)。通过将2-脱氧葡萄糖与二甲双胍复合，制备一种新型化合物N-2-脱氧葡萄糖二甲双胍，该化合物具备乳酸脱氢酶的抑制及肿瘤细胞ATP抑制的多效作用，可作为新型抗肿瘤化合物替代目前2-脱氧葡萄糖和二甲双胍的复合制剂。

Description

一种抗肿瘤药物化合物及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种N-2-脱氧葡萄糖基二甲双胍的合成以及在乳酸脱氢酶及肿瘤细胞内ATP抑制及抗肿瘤方面的作用，属于有机药物领域，特指一种可以作为糖酵解抑制剂化合物的制备以及在肿瘤细胞内抑制无氧糖酵解过程能量代谢领域的运用。

背景技术

与正常细胞不同的是，大多数肿瘤细胞显示一种新陈代谢的转换，称为“Warburg效应”，即从氧化磷酸化转变为糖酵解(Warburg,O.Ontheoriginofcancercells.Science1956,123,309–314)。这个转变对处于低氧条件下的肿瘤细胞是非常有利的，在此过程中糖酵解过程为肿瘤细胞的生存提供充足的能量，肿瘤的高侵袭性，易转移性以及对目前的放射疗法和化学疗法的抵抗性一直是困扰着肿瘤学家们的难题(GranchiC,RoyS,GiacomelliC,MacchiaM,etal.DiscoveryofN-hydroxyindole-basedinhibitorsofhumanlactatedehydrogenaseisoformA(LDH-A)asstarvationagentsagainstcancercells[J].Med.Chem.2011,54:1599-1612.)。最新的研究显示乳酸脱氢酶(LDH-A)在肿瘤细胞糖酵解途径中发挥重要作用，以乳酸脱氢酶为靶点的小分子抑制剂不断被报道出来(FauberBP,ChenJH,CorsonLB,HunsakerT,etal.Identificationof2-amino-5-aryl-pyrazinesasinhibitorsofhumanlactatedehydrogenase[J].Bioorg.Med.Chem.2013,23:5533-5539.)。

近年来研究发现，2-脱氧葡萄糖抑制肿瘤活性的作用机制是减少三磷酸腺苷(ATP)的产生(LinX,ZhangF,BradburyCM,KaushalA,LiL,SpitzDR,etal.2-Deoxy-Dglucose-inducedcytotoxicityandradiosensitizationintumorcellsismediatedviadisruptionsinthiolmetabolism[J].CancerRes.2003；63:3413–7.)。2-脱氧葡萄糖对肿瘤细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用，其作为新的抗肿瘤药物已进入Ⅱ期临床研究[J](BenSI,LaurentK,GiulianoS,etal.Targetingcancercellmetabolism:thecombinationofmetforminand2-deoxyglucoseinducesp53-dependentapoptosisinprostatecancercells[J].CancerRes,2010,70(6):2465-2475)。一脱氧葡萄糖即葡萄糖的2-号位碳原子上的羟基被氢替换的化合物,与葡萄糖结构相似,能够和葡萄糖竞争性结合己糖激酶，结合产物却不能被一磷酸葡萄糖异构酶进一步转化为一磷酸果糖而使得糖酵解停止,造成细胞内的ATP被“剥夺”,从而导致细胞能量缺失和死亡。但2-脱氧葡萄糖不能完全阻断肿瘤细胞糖酵解的进行,肿瘤细胞内游离的甘露糖在甘露糖磷酸异构酶存在的情况下可以转化成葡萄糖,进而补充能量,因此，2一脱氧葡萄糖单独使用对肿瘤的抑制是有限的。

N,N-二甲双胍长期作为治疗糖尿病的一线药物，不仅具有降低血糖的作用，研究证实其同样具有抗肿瘤的生物学效应(CurrieCJ,PooleCD,JenkinsS,etal.Mortalityafterincidentcancerinpeoplewithandwithouttype2diabetes:impactofmetforminonsurvival[J].DiabetesCare,2012,35(2):299-304.)。二甲双胍可能通过多种机制包括诱导细胞凋亡，其中二甲双胍可能通过丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)信号传导通路和上调促进细胞凋亡(MemmottRM,MercadoJR,MaierCR,etal.Metforminpreventstobaccocarcinogen-inducedlungtumorigenesis[J].CancerPrevRes(Phila),2010,3(9):1066-1076.；薛朝军,刘克辛，二甲双胍抗肿瘤机制的研究进展[J]，药学学报2015,50(10):1210-1216)。现已证实,2一脱氧葡萄糖在同二甲双胍联合使用时,二甲双胍还可以抑制肿瘤细胞的AMPK通路,在体内外对乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤产生较强的抗肿瘤作用[CheongJH,ParkES,LiangJ,etal.Dualinhibitonoftumorenergypathwayby2-deoxyglucoseandmetforminiseffectiveagainstabroadspectrumofpreclinicalcancermodels.CancerTher.2011,10(12):2350-2362]。但二甲双胍对正常细胞的抑制作用，因此发展肿瘤细胞激活的药物可望降低药物的毒副作用。由于肿瘤细胞呈微酸性的环境，2-脱氧葡萄糖和二甲双胍以N-取代半缩醛偶联的化合物有望成为肿瘤细胞激活的药物，成为新型具有抗肿瘤和抑制肿瘤能量代谢的双重作用，可望发展成为一种新性抗肿瘤化合物。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种可有效抑制肿瘤细胞增殖的药性化合物，本发明的另一个目的是提供了这种化合物的合成制备以及对乳酸脱氢酶(LDH-A)的抑制及对肿瘤细胞内ATP的抑制作用。

本发明公开一种抗肿瘤药物化合物N-2-脱氧葡萄糖基二甲双胍(简称为2-DG-M)，分子式C₁₀H₂₃N₅O₅，元素分析实验值：C,40.83；H,7.85；N,23.75％。理论计算值C,40.95；H,7.90；N,23.88％

其结构式如下：

上述新型抗癌药物的制备方法，按照以下步骤进行，将2-脱氧葡萄糖与盐酸二甲双胍以摩尔比3:1-1:3比例混合，溶于甲醇中，氮气保护下，油浴温度10-80℃反应1-6h，减压蒸馏蒸掉溶剂，重结晶得化合物N-2-脱氧葡萄糖二甲双胍(简称2-DG-M)。

进一步地，2-脱氧葡萄糖与盐酸二甲双胍的摩尔比为1:1。

进一步地，2-脱氧葡萄糖物质的量与甲醇的体积之比为0.48mmol：40ml–1.44mmol：10ml。

进一步地，2-脱氧葡萄糖物质的量与甲醇的体积比为0.48mmol：20ml。

进一步地，油浴温度40℃，反应3h。

进一步地，重结晶是采用乙醇和乙醚按照体积比1:1混合的混合物进行的。

分子式C₁₀H₂₃N₅O₅，元素分析：C,40.83；H,7.85；N,23.75％；紫外UV-vis(CH₃OH/nm)(ε×10^-4,dm³·mol^-1cm^-1):232(3.4)；红外光谱IR(KBr,ν/cm^-1):3371m,3160m,2900-2995m,1628s,1556s,1468s,1078s,1007s,710m,.600cm^-1 _.ESI:m/z＝295.17(100％)

N-2-脱氧葡萄糖二甲双胍(简称2-DG-M)在体外乳酸脱氢酶(LDH-A)方面的运用具体方法为：通过测定NADH在340nm处的吸光度的变化率来计算出酶促反应速率，每30s测一次，共持续4min，于比色皿中加入3mL0.1M，pH＝7.4的磷酸缓冲溶液，加入20μL0.2M丙酮酸溶液，15μL35μMNADH，丙酮酸和NADH的最终浓度分别为130μM和175μM，乳酸脱氢酶0.06unit，以此条件作为对照组，然后依次加入不同浓度的抑制剂，为降低实验误差，每组实验测定3遍。

所述2-DG-M溶液浓度分别为1μM-100μM。

缓冲溶液为PBS。

有益效果

本发明制备的N-2-脱氧葡萄糖二甲双胍(2-DG-M)能够对乳酸脱氢酶(LDH-A)有较好抑制效果(图1)，最佳抑制率是在化合物浓度为100μM时，此时抑制率可达到72％；乳酸脱氢酶是肿瘤糖酵解过程起重要的作用，抑制乳酸脱氢酶活性的化合物可望作用肿瘤能量代谢的抑制剂，进一步细胞实验我们发现N-2-脱氧葡萄糖二甲双胍(2-DG-M)能抑制细胞内ATP的产生(图2)。

该化合物在肿瘤细胞毒性抑制方面的运用：采用MTT法，通过测定化合物对肝癌细胞(HepG-2cells)的抑制率来研究其抗肿瘤活性，实验结果显示该化合物具有抗癌活性，化合物可以作为一种药物抑制肿瘤细胞的增殖(图3)。

2-脱氧葡萄糖作为糖酵解抑制剂，但对肿瘤生长的抑制较弱，我们通过将2-脱氧葡萄糖与二甲双胍复合，制备一种新型化合物N-2-脱氧葡萄糖二甲双胍，该化合物具备乳酸脱氢酶的抑制及肿瘤细胞ATP抑制的多效作用，可作为新型抗肿瘤化合物替代目前2-脱氧葡萄糖和二甲双胍的复合制剂。

附图说明

图1为2-DG-M化合物在不同浓度下对LDH-A的抑制图谱，条件：PBS缓冲溶液为3mL，NADH浓度为175μM，丙酮酸溶液浓度为130μM，测试温度37℃，测试时间4min，间隔30s。

图2为细胞内ATP含量的变化曲线图，条件：以空白为100％,抑制剂浓度分别为1μM,10μM,25μM,50μM,75μM和100μM。

图3为采用MTT法化合物在不同浓度下的抗肿瘤活性图谱，条件：以2×10⁴/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔100μL，培养24h后，分别用浓度为1μM,10μM,15μM,25μM,50μM,75μM和100μM的化合物溶液加入培养基中作用24h；吸取去上清液，每孔加入100μMMTT(1mg/mL),继续培养4h,吸取上清液，用酶标仪在570nm处测定吸光度值。

具体实施方式

试剂与仪器：本发明所用的溶剂皆为分析纯，所用试剂未加特殊说明直接应用而未经任何特殊处理。

PBS(磷酸盐缓冲盐水)，甲醇(分析纯，上海中试化工总公司)，二甲亚砜(DMSO，分析纯，国药集团)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH，Sigma公司)，丙酮酸(分析纯，上海中试化工总公司)，2-脱氧葡萄糖(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，盐酸二甲双胍(分析纯，上海中试化工总公司)。

美国Nicolet20DXBFR-IR型傅立叶红外光谱仪，KBr压片，400～4000cm^-1；日本岛津UV-2450型紫外可见分光光度仪，800-190nm；DHG-9140A型电热恒温鼓风干箱(上海-恒科技有限公司)；DZF-6051型真空干燥箱(上海-恒科技有限公司)，RE-52C型旋转蒸发器(巩义市予华仪器有限公司)。

实施例1(最佳合成例)

2-脱氧葡萄糖(78mg，0.48mmol)：盐酸二甲双胍(80mg，0.48mmol)，溶于20mL甲醇中，通氮气0.5h，40℃反应3h，反应结束后自然冷却至室温，减压蒸馏蒸掉溶剂，乙醇-乙醚(v/v-1:1)重结晶，真空干燥，得产物140mg。

分子式C₁₀H₂₃N₅O₅元素分析：C,40.83；H,7.85；N,23.75％。紫外UV-vis(CH₃OH/nm)(ε×10^-4,dm³·mol^-1cm^-1):232(3.4).红外光谱IR(KBr,ν/cm^-1):3371m,3160m,2900-2995m,1628s,1556s,1468s,1078s,1007s,710m,.600cm^-1.

实施例2

2-脱氧葡萄糖(248mg，1.44mmol)：盐酸二甲双胍(80mg，0.48mmol)，其中2-脱氧葡萄糖与盐酸二甲双胍摩尔比为3：1，溶于10mL甲醇中(2-脱氧葡萄糖物质的量与甲醇的体积比为1.44mmol：10ml)，通氮气0.5h，10℃反应1h，反应结束后放置至室温，减压蒸馏蒸掉溶剂，乙醇-乙醚(v/v-1:1)重结晶，真空干燥，得产物40mg，说明该合成方案产率低于最佳实施案例。

实施例3

2-脱氧葡萄糖(78mg，0.48mmol)：盐酸二甲双胍(254mg，1.44mmol)，其中2-脱氧葡萄糖与盐酸二甲双胍摩尔比为1：3，溶于40mL甲醇中(2-脱氧葡萄糖物质的量与甲醇的体积比为0.48mmol：40ml)，通氮气0.5h，80℃反应6h，反应结束后自然冷却至室温，减压蒸馏蒸掉溶剂，乙醇-乙醚(v/v-1:1)重结晶，真空干燥，得产物70mg，说明该合成方案产率低于最佳实施案例。

实施例4

2-脱氧葡萄糖(156mg，0.96mmol)：盐酸二甲双胍(254mg，1.44mmol)，其中2-脱氧葡萄糖与盐酸二甲双胍摩尔比为(1：1.5)，溶于30mL甲醇中(2-脱氧葡萄糖物质的量与甲醇的体积比为0.96mmol：30ml)，通氮气0.5h，50℃反应4h，反应结束后自然冷却至室温，减压蒸馏蒸掉溶剂，乙醇-乙醚(v/v-1:1)重结晶，真空干燥，得产物90mg，该合成方案制备的产率低于最佳实施案例。

实施例5

以实施例1得到的化合物为受试化合物。

乳酸脱氢酶(LDH-A)的抑制：取3mLPBS缓冲溶液，加入含有35mMNADH(15μL)和0.2M丙酮酸溶液20μL，分别加入15mM的2-DG-M化合物DMSO溶液5μL,10μL,15μL和20μL，每30s计数一次，持续4min，数据见图1，图1显示2-脱氧葡萄糖-二甲双胍复合物对乳酸脱氢酶的抑制呈现浓度依赖性。

实施例6

化合物的抗肿瘤活性：以实施例1得到的化合物为受试化合物。

将HepG-2细胞在含10％热灭活的胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养液中，于CO₂培养箱(37℃，5％CO₂、饱和湿度)内连续培养；取对数生长期细胞，消化、计数，以2×10⁴/ml的密度接种于96孔培养板中，每孔100μl，培养24h后，分别用浓度为1μM,10μM,15μM,25μM,50μM,75μM和100μM的化合物溶液加入培养基中作用24h；吸取去上清液，每孔加入100μMMTT(1mg/ml),继续培养4h,吸取上清液，用酶标仪在570nm处测定吸光度值，采用IC₅₀计算软件求出半数抑制浓度(IC₅₀)，化合物的IC₅₀值为61.6μM，说明我们制备的化合物有良好的提高抗肿瘤活性的特性，可望运用于肿瘤的临床治疗。

实施例7

三磷酸腺苷(ATP)含量变化的测定：以实施例2中的步骤处理细胞，然后加入100μL的荧光素，用细胞培养液稀释至3mL，用荧光分光光度测其荧光强度，其中ex＝340nm，em＝530nm。实验数据显示2-脱氧葡萄糖-二甲双胍复合物能有效抑制细胞内ATP的产生(图2)。

Claims

1.一种抗肿瘤药物化合物，其特征在于：所述抗肿瘤药物化合物为N-2-脱氧葡萄糖基二甲双胍，其结构式如下：

2.如权利要求1所述的一种抗肿瘤药物化合物，其特征在于：所述抗肿瘤药物化合物的分子式C₁₀H₂₃N₅O₅，元素分析实验值：C,40.83；H,7.85；N,23.75％，理论计算值C,40.95；H,7.90；N,23.88％；所述抗肿瘤药物化合物的紫外UV-vis(CH₃OH/nm)(ε×10^-4,dm³·mol^-1cm^-1):232(3.4)；红外光谱IR(KBr,ν/cm^-1):3371m,3160m,2900-2995m,1628s,1556s,1468s,1078s,1007s,710m,.600cm^-1.ESI-MS(CH₃OH):m/z,295.17。

3.如权利要求1所述的一种抗肿瘤药物化合物的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行，将2-脱氧葡萄糖与盐酸二甲双胍以摩尔比3:1-1:3比例混合，溶于甲醇中，氮气保护下，油浴温度10-80℃反应1-6h，减压蒸馏蒸掉溶剂，重结晶得化合物N-2-脱氧葡萄糖二甲双胍。

4.如权利要求3所述的一种抗肿瘤药物化合物的制备方法，其特征在于：所述2-脱氧葡萄糖与盐酸二甲双胍的摩尔比为1:1。

5.如权利要求3所述的一种抗肿瘤药物化合物的制备方法，其特征在于：所述2-脱氧葡萄糖物质的量与甲醇的体积之比为0.48mmol：40ml–1.44mmol：10ml。

6.如权利要求3或5所述的一种抗肿瘤药物化合物的制备方法，其特征在于：所述2-脱氧葡萄糖物质的量与甲醇的体积比为0.48mmol：20ml。

7.如权利要求3所述的一种抗肿瘤药物化合物的制备方法，其特征在于：油浴温度40℃，反应3h。

8.如权利要求3所述的一种抗肿瘤药物化合物的制备方法，其特征在于：重结晶是采用乙醇和乙醚按照体积比1:1混合的混合物进行的。

9.如权利要求1或2所述的一种抗肿瘤药物化合物作为乳酸脱氢酶(LDH-A)的抑制剂的用途。

10.如权利要求1或2所述的一种抗肿瘤药物化合物在肿瘤细胞抑制及作为肿瘤细胞能量代谢剂方面的用途。