CN105523960A - 一种新型pH响应双发射波长荧光分子探针的合成方法及其在生物成像中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型pH响应双发射波长荧光分子探针，其结构式如下所示：

Description

一种新型pH响应双发射波长荧光分子探针的合成方法及其在生物成像中的应用

技术领域：

本发明涉及一种响应双发射波长荧光分子探针的合成方法及其在生物成像中的应用。特别是一种新型基于聚集诱导发光原理设计的荧光探针。

背景技术

细胞内pH(pH_i)是监测细胞行为的一个参数，例如细胞分裂、细胞凋亡、离子传输、酶活性以及蛋白质降解等。在典型的哺乳动物细胞中，线粒体内的pH值约为8.0，细胞质和细胞核的pH值为7.2-7.4，溶酶体的pH值沿着细胞内吞途径从6.3变化到4.7。细胞功能紊乱经常与反常的细胞器内pH值相关。反常的pH_i是许多常见疾病发生的指标，例如癌症、中风和阿茨海默病(R.A.Gottlieb,J.Nordberg,E.SkowronskiandB.M.Babior,PNAS,1996,93,654；D.Pérez-Sala,D.Collado-EscobarandF.Mollinedo,J.Biol.Chem.,1995,270,6235)。监测活细胞内的pH值变化对于研究细胞新陈代谢和了解生理学及病变等过程具有重要意义。

检测pH_i的方法有微电极、核磁共振法和光学显微镜法等。相比于其它方法，荧光光谱法由于其具有独特的高选择性、高灵敏、高时间空间分辨率等特点，成为监测细胞内pH值变化的首选方法。因此合成具有pH响应功能的荧光探针分子也因此成为一个热门的研究领域。

目前，pH响应的荧光探针分子的设计大多数都是基于光诱导电子转移(photoinducedelectrontransfer,PET)、激发态分子间质子转移(excitedstateintramolecularprotontransfer,ESIPT)、荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)等原理(M.Yang,Y.Song,M.Zhang,S.Lin,Z.Hao,Y.Liang,D.ZhangandP.R.Chen,Angew.Chem.Int.Ed.,2012,51,7674；S.Modi,M.Swetha,D.Goswami,G.D.Gupta,S.MayorandY.Krishnan,NatureNanotechnology,2009,4,325；R.C.Somers,R.M.Lanning,P.T.Snee,A.B.Greytak,R.K.Jain,M.G.BawendiandD.G.Nocera,ChemicalScience,2012,3,2980；I.L.Medintz,M.H.Stewart,S.A.Trammell,K.Susumu,J.B.Delehanty,B.C.Mei,J.S.Melinger,J.B.Blanco-Canosa,P.E.DawsonandH.Mattoussi,Naturematerials,2010,9,676；K.Zhou,Y.Wang,X.Huang,K.Luby‐Phelps,B.D.SumerandJ.Gao,Angew.Chem.Int.Ed.,2011,50,6109.)。大多数荧光探针分子的荧光强度随pH变化的单一波长的强度发生变化，而且合成方法相对复杂。因此，发展其它途径设计合成方法简便、具有pH响应双发射波长、毒性小、稳定性较好、能应用于生物荧光成像的pH响应荧光探针分子具有重要的意义。

2001年,一种名为Silole的化合物在溶液状态下发光很弱，当向溶液中加入非溶剂后,体系变浑浊,同时荧光强度急剧增大,荧光量子效率显著升高,这种现象与传统的聚集导致荧光猝灭恰好相反,他们将这种现象称为聚集诱导发光现象通过实验和理论计算表明，产生聚集诱导发光现象的主要原因是分子在溶液状态下由于分子内转动导致的非辐射能量衰减在聚集状态下得到了抑制，化合物的激发态主要以辐射发光的方式进行衰减，从而使分子的发光效率大大增强。聚集诱导发光现象的发现改变了人们对荧光探针的认识，为设计荧光探针分子及其在分析检测领域中的应用提供了新的思路(Y.Hong,J.W.LamandB.Z.Tang,Chem.Soc.Rev.,2011,40,5361；Y.Yuan,C.J.ZhangandB.Liu,Angew.Chem.Int.Ed.,2015,54,11419；X.Xue,Y.Zhao,L.Dai,X.Zhang,X.Hao,C.Zhang,S.Huo,J.Liu,C.Liu,A.Kumar,W.Q.Chen,G.ZouandX.J.Liang,Adv.Mater.,2014,26,712.)。

具有聚集诱导发光特性的分子作为荧光探针在分析检测领域有着普通荧光探针不可比拟的优点，首先具有聚集诱导发光性能的探针分子其在聚集状态不会发生荧光猝灭，减小了探针浓度对检测结果的影响；在生化分析检测过程中，聚集诱导发光分子允许结合到生物大分子上的分子数目可以比传统荧光探针多很多,相应的荧光强度的更大,因此可以获得更高的灵敏度；再次，聚集诱导发光荧光探针采用的是一种turn-on的原理，其灵敏度相对较高(Z.Luo,X.Yuan,Y.Yu,Q.Zhang,D.T.Leong,J.Y.LeeandJ.Xie,J.Am.Chem.Soc.,2012,134,16662；X.Jia,J.LiandE.Wang,Small,2013,9,3873；M.Wang,X.Gu,G.Zhang,D.ZhangandD.Zhu,Anal.Chem.,2009,81,4444；X.Li,K.Ma,S.Zhu,S.Yao,Z.Liu,B.Xu,B.YangandW.Tian,Anal.Chem.,2014,86,298；)。由于具有以上特性，成为近十年来荧光分析方法的研究热点。聚集诱导发光现象的发现为设计新型荧光探针分子提供了一种可能的途径。

发明内容

本发明是要解决上述现有的检测pH_i方法存在的问题，从而提供了一种新型pH双响应的荧光分子探针及其合成方法。

本发明所述的pH响应探针分子是具有聚集诱导发光活性的化合物分子。

在酸性条件下，由于具有聚集诱导发光活性的分子内部中含有较多疏水性的结构，自身发生聚集，这种聚集使得分子内转动的非辐射能量衰减得到抑制，产生聚集诱导发光引起的橙色荧光；而在碱性条件下，其结构中的羧基和羟基上的质子发生解离，探针处于离子状态，共轭作用增强，产生绿色的荧光。

本发明所述的一种pH响应双发射波长的荧光分子探针，pH响应双发射波长的荧光分子，其中文名为：4,4'-((1E,1E')-酰肼-1,2-二亚基二(甲基亚基))二(2-羟基苯甲酸)；英文名称为：4,4'-((1E,1'E)-hydrazine-1,2-diylidenebis(methanylylidene))bis(2-hydroxybenzoicacid)，简称为HDBB，其结构式为：

上述pH响应双波长响应的荧光分子探针的合成方法是按以下步骤进行：

1)将4-醛基-3-羟基苯甲酸(0.166g,1.0mmol)溶于5mL甲醇中，加入80％水合肼(24μL,0.5mmol)，搅拌回流12h。

2)离心分离并用甲醇洗三遍，得到淡黄色产物。

由以上可知，合成发明所述的HDBB荧光分子探针只需一步缩合反应，合成方法较简便，易于分离纯化。其产率为73.5％。通过核磁和质谱证明反应所得到的淡黄色产物与HDBB分子的结构相符合。¹HNMR(500MHz,DMSO-d6),δ(TMS,ppm):8.93(s,2H),7.60(d,2H),7.39(d,2H),7.38(s,2H).¹³CNMR(125MHz,DMSO-d6),δ(TMS,ppm):170.2,163.5,158.6,144.0,131.1,121.2,119.7,117.6.质谱:理论计算C₁₆H₁₂N₂O₆[M+H]⁺329.0729,质谱图中329.0767(高分辨).

附图说明

图1HDBB分子在不同比率的二甲亚砜和甲醇混合溶剂中的发射谱图。

图2为本发明实施例3采集到本发明聚集诱导发分子的荧光-pH响应谱图。其中即不同pH值下本发明的发射谱图，c＝2.5×10^-5M(ex＝360nm)。

图3为本发明实施例3采集到I₅₉₀/I₄₉₀-pH曲线图，其中I₅₉₀和I₄₉₀分别指代本发明聚集诱导发光分子溶液在590、490nm处的荧光强度(ex＝360nm)。

图4为本发明实施例1采集到(A).本发明聚集诱导发光分子、溶酶体追踪器分别对溶酶体的染色情况的共聚焦图像，以及将前二者叠加进行比对后获得的图像。

(B).利用本发明聚集诱导发光分子染色后的老鼠共聚焦图像，从左至右依次为染色前、染色后4h、6h、8h、12h。

(C).利用本发明聚集诱导发光分子染色后的肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肾脏的共聚焦图像。由红到蓝发射比例表示其分布情况。

图5为本发明HDBB分子在中性和碱性溶液中的¹HNMR谱图(A)。

图6为本发明HDBB分子在中性和碱性溶液中的¹³CNMR谱图(B)。

图7为本发明HDBB分子的pH响应机理图(C)。

具体实施方式

实施例1

将4-醛基-3-羟基苯甲酸(0.166g,1.0mmol)溶于5mL甲醇中，加入80％水合肼(24μL,0.5mmol)，搅拌回流12h，得到淡黄色的沉淀物。将淡黄色的沉淀物离心分离并用甲醇洗三遍，得到淡黄色固体—HDBB分子，其产率为72.5％。

本发明HDBB分子可以溶解于二甲亚砜中，难溶于甲醇。通过研究HDBB分子在不同比率的二甲亚砜(DMSO)和甲醇混合溶剂中的荧光性质，发现随着甲醇比率的提高，HDBB分子的溶解性逐渐下降，橙色荧光逐渐增强，证明HDBB分子具有聚集诱导发光的活性。

本发明研究HDBB分子在不同pH条件下的荧光性质，发现HDBB分子具有pH响应双发射波长性质：在酸性介质中，其发射出与甲醇中类似的橙色荧光，证明其在酸性条件下的荧光是来源于聚集诱导发光，即自身发生聚集，这种聚集使得分子内转动的非辐射能量衰减得到抑制，产生聚集诱导荧光现象；在碱性介质中，HDBB分子结构中的羧基和羟基上的质子发生解离，探针处于离子状态，共轭作用增强，产生绿色的荧光。其pKa1与pKa2分别为5.61与9.88。在生理pH范围4.5～7.5之间，HDBB分子在590nm荧光发射与490nm荧光发射的比率成良好的线性。上述pH响应机理通过核磁和紫外-可见吸收光谱实验得到了验证。进一步研究证明HDBB分子的pH响应的荧光性质具有良好的可逆性。

本发明的pH响应荧光探针可以用细胞中溶酶体和肿瘤组织成像：首先考察了HDBB分子的细胞毒性，通过MTT细胞毒实验证明，HDBB分子具有良好的生物相容性，基本无细胞毒性；细胞成像实验证明，HDBB分子可以穿过细胞膜进入细胞，以商品化染料LysoTracker作参照，对HDBB分子成像位置进行定位，发现HDBB分子在细胞溶酶体中产生强的橙色荧光，证明HDBB分子可以作为pH探针应用于细胞内酸性细胞器成像；动物实验证明，HDBB分子可以作为荧光探针，应用于肿瘤组织成像。因此，HDBB具有良好的生物相容性，可以应用于细胞内pH传感，可以应用于肿瘤组织的成像识别。

实施例2

将HDBB分子二甲亚砜溶液(0.01mol/L)稀释于不同比率二甲亚砜/甲醇混合溶液，HDBB分子的终浓度为25μmol/L，测试其荧光发射谱图。从荧光发射谱图可以看出，随着混合溶液中甲醇含量的增大，590nm的荧光发射强度逐渐增大。如HDBB分子在甲醇含量为90％的二甲亚砜-甲醇混合溶液中的590nm荧光发射强度为其在纯二甲亚砜溶液中的28倍(附图1)。说明HDBB分子聚集诱导发光的荧光性质。

实施例3

将HDBB分子碱性溶液(0.01mol/L)稀释于不同pH值(2.0～13.0)的磷酸盐缓冲液中，HDBB分子的终浓度为25μmol/L，测试其荧光发射谱图。从荧光发射谱图可以看出(附图2)，在pH2.0～7.0，随着pH值的降低，590nm的荧光发射强度逐渐增大；在pH7.0～13.0，随着pH值的增大，490nm的荧光发射强度逐渐增大。说明HDBB分子具有双波长pH响应荧光性质。

实施例4

将HepG2肿瘤细胞在含有本发明HDBB分子的培养基中培养10min，进行荧光共聚焦扫描。并以同样的方法用溶酶体追踪器处理。说明本发明HDBB分子能够快速穿过细胞膜进入到细胞质中，并且它的标记位点与溶酶体追踪器的荧光标记位点基本吻合，表明它是一种特定的细胞内溶酶体定位剂。肿瘤细胞中溶酶体的pH值比正常组织的低。进一步推断出本发明具有诊断癌症的应用潜力。用本发明处理患有HepG2肿瘤的小鼠，从附图3(B)中可以看出，本发明的荧光在体内的分布情况以及能够在活的实验鼠身上特定的肿瘤中聚集。而且，对肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肾脏等，分别估量荧光信号在它们中分布情况，实验结果表明，只在肿瘤中观察到荧光信号，而其他器官中几乎没有。因此该荧光分子可用于肿瘤组织荧光成像。

实施例5

以HDBB分子作为探针分子检测HepG2肿瘤细胞内溶酶体的pH值，根据以下公式(P.Shen,S.Xiao,X.Zhan,W.Zhang,KChang,C.Yang,J.Phys.Org.Chem.2013,26,858)：

$log\[\frac{I_{F,\max }-I_F}{I_F-I_{F,\min }}\]=pH-pKa$

公式中，I_F,max、IF、I_F,min分别为荧光强度的最大值、待测点的值、最小值。

我们将HepG2肿瘤细胞用pH4.0的培养基溶液处理10分钟后，得到590nm的荧光值(I_F,max)；将HepG2肿瘤细胞内用pH7.4的培养基溶液处理10分钟后，以其细胞质的590nm的荧光强度为最小值(I_F,min)，溶酶体中的590nm荧光强度为待测点的值(I_F)。在不同位置取22个点，得到I_F,max、IF、I_F,min的值，取其平均值。结果如下所示：

可以得到I_F,max、I_F、I_F,min分别为2056.5、1698、496.86。已知HDBB分子的pka1为5.61。将上述数据代入到上面的公式，可以得到pH＝5.09，即HepG2肿瘤细胞内溶酶体的平均pH值为5.09。

Claims (10)

1.一种新型pH响应双发射波长荧光分子探针，其特征在于pH响应双发射波长的荧光分子，其中文名为：4,4'-((1E,1E')-酰肼-1,2-二亚基二(甲基亚基))二(2-羟基苯甲酸)；英文名称为：4,4'-((1E,1'E)-hydrazine-1,2-diylidenebis(methanylylidene))bis(2-hydroxybenzoicacid)，简称为HDBB，具有如下结构式：

2.一种如权利要求1所述的分子荧光探针的合成方法，其特征在于通过一步反应即可得到所述分子荧光探针，所述合成方法包括如下步骤：将4-醛基-3羟基苯甲酸溶于有机溶剂中，加入水合肼，回流12h，冷却，离心分离得到所述分子荧光探针。

3.如权利要求2所述的分子荧光探针的合成方法，其特征在于所述pH响应双波长响应的荧光分子探针的合成方法是按以下步骤进行：

1)将4-醛基-3-羟基苯甲酸(0.166g,1.0mmol)溶于5mL甲醇中，加入80％水合肼(24μL,0.5mmol)，搅拌回流12h。

2)离心分离并用甲醇洗三遍，得到淡黄色产物。

4.如权利要求2所述的分子荧光探针的合成方法，其特征在于采用的有机溶剂为甲醇。

5.如权利要求2所述分子荧光探针，其特征在于其pH应用范围为2.0-13.0；所述分子荧光探针能够进入细胞，无细胞毒性。

6.一种如权利要求1中所述的分子荧光探针在pH响应荧光检测领域的应用。

7.一种如权利要求5所述的分子荧光探针在pH响应荧光检测领域的应用，其进一步包括采用分子荧光分析法，所述荧光分子探针在溶液中对pH值有荧光颜色和强度响应。

8.一种如权利要求5所述分子荧光探针在pH响应荧光检测领域的应用，其特征在于在pH响应荧光检测领域的应用，其特征在于可以将所述分子荧光探针用于细胞内pH值的检测或肿瘤组织成像。

9.一种如权利要求5所述分子荧光探针在pH响应荧光检测领域的应用，其特征在于所述分子荧光探针的检测使用浓度为50μM。

10.一种如权利要求5所述分子荧光探针在pH响应荧光检测领域的应用，其特征在于所述的pH响应荧光的识别通过观察其荧光颜色和强度变化来实现。