CN105506135A

CN105506135A - 一种含有pfb-2引物对的猪粪便污染检测试剂盒及其制备与应用

Info

Publication number: CN105506135A
Application number: CN201610037363.1A
Authority: CN
Inventors: 段传人; 崔亚敏; 张坤; 孙达; 张宝云
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2016-01-20
Filing date: 2016-01-20
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2036-01-20
Also published as: CN105506135B

Abstract

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种猪粪便污染检测试剂盒及其制备与应用。本发明所述试剂盒含有前述猪粪便污染检测引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。所述试剂盒对猪粪便污染检测特异性高达100%，最低检测限（LOQs）为6.53拷贝数/反应，阳性率高达86%。采用所述引物对及试剂盒能够快速判定水体是否被污染，并定位污染源。

Description

一种含有PFB-2引物对的猪粪便污染检测试剂盒及其制备与应用

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种猪粪便污染检测试剂盒及其制备与应用。

背景技术

当今社会经济发展快速，水体环境经常被微生物污染，特别是饮用水受病原菌污染后引发传染性疾病日益严重。大部分肠道传染病可通过水环境传染，但是污染源很难确定，污染致病菌难以准确示踪，这些都是当前常规的检测指标和检测方法不能完全解决的问题。因此，找到一个有效、快速、与污染源直接关联的新指示菌指标用来弥补当前检测的不足是当务之急。在中国环保局颁布的地表水环境质量标准中，粪便中的大肠杆菌（Escherichia coli）菌落数是一个重要的指标，这是因为粪便污染是水体污染的一个重要因素之一。粪便中可能含有许多致病细菌，如大肠杆菌0157、H7和沙门氏菌（Salmonella），原生动物隐孢子虫（Cryptosporidium protozoan），肝炎病毒（Hepadnavividae ）。粪大肠杆菌（Fecal coliform ）、大肠杆菌和肠球菌（Enterococcus）能够被全世界很多国家作为水体污染的指示菌，是因为他们的检测相对简单，比较符合粪便污染检测指标中对示踪微生物的要求，水体中这些微生物的含量是反映水质污染程度和水质是否安全的重要指标，也是水体利用和污水治理的主要依据。大肠杆菌是最早作为粪便污染的指示微生物，随后粪大肠菌群、总大肠杆菌（Total/fecal coliforms）、肠球菌属、拟杆菌（Bacteroides）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens ）等肠道微生物相继作为示踪菌，这些指示菌成功示踪了多起粪便污染水质事故，为水污染的粪便来源追踪提供了强有力的证据。

随着养猪产业的快速发展，猪粪尿造成的环境污染也日益严重，猪粪尿中含有大量的氮、磷、钾，直接排放到水中会造成水体富营养化。目前，水质监测的生物指标为大肠杆菌数和细菌总数，然而这些指标只能反映水体状况，无法实时监控水体污染，也无法定位水体污染源。

因此，能够准确检测猪粪便污染是当务之急。

发明内容

针对现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种猪粪便污染检测试剂盒及其制备与应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种猪粪便污染检测引物对，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：CCTTTGTCCTCAGTGAAGA；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：TCGGAATTCCGCTTGCCTCTGATCC。

本发明的第二方面，提供了前述猪粪便污染检测引物对在制备猪粪便检测试剂或检测试剂盒中的用途。

本发明的第三方面，提供一种猪粪便污染检测试剂盒，所述试剂盒含有前述猪粪便污染检测引物对。

优选地，所述试剂盒还含有对照引物对，所述对照引物对含有正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：CTAACTACGTGCCAGCAGCC；所述反向引物的如SEQ ID NO.4所示，具体为：GCCTTCGCCACTGGTGTTCC。

本发明的试剂盒采用高灵敏性的PCR技术来进行猪粪便Faecalibacterium菌的检测，采用所述猪粪便污染检测引物对进行PCR扩增，根据扩增情况可分析来判断猪粪便Faecalibacterium菌感染情况。因此，引物对的设计是本发明试剂盒的关键。

基于本发明所述试剂盒采用的是PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl₂、dNTPs等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

所述PCR扩增反应液中，引物、Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl₂、dNTPs均为常见组分，其含量亦为常规。

PCR扩增反应液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR扩增反应液加入引物对获得。例如，所述试剂盒中还可以含有2×Power Taq PCR Master Mix。加入本发明的猪粪便污染检测引物对即可获得PCR扩增反应液。

所述试剂盒中还可含有阳性对照。阳性对照含有Faecalibacterium菌保守序列，可为含有Faecalibacterium菌保守序列的质粒。所述的阳性对照也可以为灭活的Faecalibacterium菌培养液。还可采用现有Faecalibacterium菌检测试剂盒中的阳性对照，也可单独市购或根据现有技术自行构建。

所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为各种不含有Faecalibacterium菌的溶液，如PCR反应缓冲液、无菌水（DEPC-H₂O）、生理盐水等。

本发明的第四方面，提供一种猪粪便污染检测方法，其采用前述猪粪便污染检测引物对或前述猪粪便污染检测试剂盒，包括如下步骤：

（1）提取样品基因组DNA；

（2）加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR扩增反应液的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管；

（3）PCR扩增：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增；

（4）PCR反应结束后，采用扩增产物分析结果。

步骤（1）中，提取样品基因组DNA为现有技术。优选地，可采用MO-BIO PowerSoil®DNA Isolation kit提取样品基因组DNA。

优选地，步骤（2）中，各反应管中，PCR扩增反应液的体积为15 uL，含样品基因组DNA 1uL，2×Power Taq PCR Master Mix，正向引物（10uM/L）0.5uL，反向引物（10uM/L）0.5uL，2×Power Taq PCR Master Mix 7.5uL，无菌水补足至15 uL。

优选地，步骤（3）中，PCR扩增的程序为：预变性95℃/300s，1次循环；变性94℃/30s，延伸60℃/30s，32次循环。

优选地，步骤（4）中，将扩增产物5uL用1%琼脂糖凝胶电泳进行结果分析。

本发明的第五方面，提供了前述试剂盒在制备猪粪便污染检测产品中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的猪粪便污染检测引物对以及检测试剂盒对猪粪便污染检测特异性高达100%，最低检测限（LOQs）为2.9拷贝数/反应，阳性率高达86%。采用所述引物对及试剂盒能够快速判定水体是否被污染，并定位污染源。

附图说明

图1：六个物种的扩增产物5uL用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析所的结果。

图2：六个物种定量PCR标准曲线结果。

图3：50个阳性样品中有43个样品可以通过引物对PFB-2进行PCR扩增并可看到明显条带，其阳性率为86%。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1 试剂盒的制备

采集126份动物粪便样品（鸡，鸭，人，狗，猪，牛），经454焦磷酸测序得到146038条细菌16SrDNA序列。通过将所得序列进行数据库比对，挑选出所有粪便样品中Faecalibacterium菌16SrDNA基因序列，并做物种间的详细对比，设计出一对可特异鉴定猪粪便的DNA引物PFB-2（扩增长度：172bp）和一对Faecalibacterium菌16SrDNA通用引物FUP（扩增长度：237bp），引物的具体序列如下表1所示：

表1

正向引物（PFB-2F）	CCTTTGTCCTCAGTGAAGA	SEQ ID NO.1
			反向引物（PFB-2R）	TCGGAATTCCGCTTGCCTCTGATCC	SEQ ID NO.2
正向引物（FUP-F）	CTAACTACGTGCCAGCAGCC	SEQ ID NO.3
			反向引物（FUP-R）	GCCTTCGCCACTGGTGTTCC	SEQ ID NO.4

采用现有技术合成上述引物对PFB-2和引物对FUP-F，然后直接将上述引物对PFB-2装配入试剂盒，或者上述引物对PFB-2和引物对FUP-F一起装配入试剂盒。

也就是说，本发明的试剂盒，含有引物对PFB-2。优选地，还可含有引物对FUP-F。进一步，所述试剂盒还可以含有2×Power Taq PCR Master Mix等试剂。

实施例2 试剂盒的使用

采用实施例1的试剂盒，对鸡，鸭，人，狗，猪，牛这六个物种的含Faecalibacterium菌粪便样品进行检测。

具体检测步骤如下：

（1）提取样品基因组DNA：

取鸡，鸭，人，狗，猪，牛这六个物种的的新鲜含Faecalibacterium菌粪便样品，分别编号为1、2、3、4、5、6，每个物种设置3个重复；采用现有DNA提取试剂盒（例如：MO-BIOPowerSoil® DNA Isolation kit）分别提取样品基因组DNA；

（2）PCR扩增反应：

取步骤（1）中的各样品基因组DNA，采用分别以引物对PFB-2、引物对FUP作为引物，进行PCR扩增。

PCR扩增反应液如下表2或表3所示：

表2

正向引物（PFB-2F）（10uM/L）	0.5uL
		反向引物（PFB-2R）（10uM/L）	0.5uL
2×Power Taq PCR Master Mix	7.5uL
		样品基因组DNA	1uL
无菌水补足至	15 uL

表3

正向引物（FUP-F）（10uM/L）	0.5uL
		反向引物（FUP-R）（10uM/L）	0.5uL
2×Power Taq PCR Master Mix	7.5uL
		样品基因组DNA	1uL
无菌水补足至	15 uL

然后进行PCR扩增反应，PCR扩增的程序如下：

PFB-2：预变性95℃/300s，1次循环；变性94℃/30s，延伸60℃/30s，32次循环。

FUP-F：预变性95℃/300s，1次循环；变性94℃/30s，延伸60℃/30s，32次循环。

（3）特异性验证：

取步骤（2）中所得六个物种的扩增产物5uL用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果如图1所示，引物对PFB-2能够扩增猪粪便中Faecalibacterium菌并产生相应条带，但是引物对PFB-2不能够扩增鸡，鸭，人，狗和牛粪便中的Faecalibacterium菌因而不能够产生相应的条带说明，引物对能够特异性扩增PFB-2猪粪便中Faecalibacterium菌，具有100%的特异性。而通用引物对FUP-F对六个物种粪便中Faecalibacterium菌都能扩增并产生相应的条带，因此可采用通用引物对FUP-F作为对照，分别采用引物对PFB-2和通用引物对FUP-F进行PCR扩增，均能产生条带的样品，才判定为猪粪便Faecalibacterium菌阳性，从而提高检测的准备率。

（4）灵敏度验证：

如图2所示的定量PCR标准曲线，经计算，引物对PFB-2的最低检测限（LOQs）为2.9拷贝数/反应，阳，充分表明，引物对PFB-2具有很高的灵敏度。

（5）阳性率验证：

选取50个猪粪便Faecalibacterium菌阳性，按照步骤（1）和（2）中的方法提取样品基因组DNA并进行PCR扩增，扩增产物5uL用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，部分结果如图3所示，50个阳性样品中有43个样品可以通过引物对PFB-2进行PCR扩增并可看到明显条带，其阳性率为86%，说明引物对PFB-2具有较好的稳定性。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

<110> 重庆大学

<120> 一种含PFB-2引物对的猪粪便污染检测试剂盒及其制备与应用

<130> PCNS

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PFB-2正向引物

<400> 1

cctttgtcct cagtgaaga 19

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PFB-2反向引物

<400> 2

tcggaattcc gcttgcctct gatcc 25

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> FUP-F 正向引物

<400> 3

ctaactacgt gccagcagcc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> FUP-R反向引物

<400> 4

gccttcgcca ctggtgttcc 20

Claims

1.一种猪粪便污染检测引物对，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的猪粪便污染检测引物对在制备猪粪便检测试剂或检测试剂盒中的用途。

3.一种猪粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求1所述猪粪便污染检测引物对。

4.根据权利要求3所述的猪粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有对照引物对，所述对照引物对含有正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述反向引物的如SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求3所述的猪粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有2×Power Taq PCR Master Mix。

6.根据权利要求3所述的猪粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有阳性对照，阳性对照含有Faecalibacterium菌保守序列。

7.根据权利要求3所述的猪粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有阴性对照，阴性对照可为各种不含有Faecalibacterium菌的溶液。

8.一种猪粪便污染检测方法，其采用如权利要求1所述猪粪便污染检测引物对或如权利要求3~7任一权利要求所述的猪粪便污染检测试剂盒，包括如下步骤：

提取样品基因组DNA；

加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR扩增反应液的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管；

PCR扩增：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增；

PCR反应结束后，采用扩增产物分析结果。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中，各反应管中，PCR扩增反应液的体积为15 uL，含样品基因组DNA 1uL，2×Power Taq PCR Master Mix，正向引物（10uM/L）0.5uL，反向引物（10uM/L）0.5uL，2×Power Taq PCR Master Mix 7.5uL，无菌水补足至15 uL。

10.如权利要求1~7任一权利要求所述试剂盒在制备猪粪便污染检测产品中的用途。