CN105505985A - 具有黄瓜CsMADS07基因的表达载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黄瓜MADS-box基因CsMADS07过表达载体及其在花器官改造及增加果荚数量中的应用，属于生物技术领域。该载体为含有双35S启动子和黄瓜CsMADS07基因植物表达载体。在拟南芥中过量表达CsMADS07，获得的CsMADS07转基因植株的萼片膨大卷曲、萼片异生出类似柱头状的器官、顶端果荚数明显增加。利用CsMADS07的基因功能特性可用于农作物和观赏植物的育种应用，具有一定的农业价值和观赏价值。

Description

具有黄瓜CsMADS07基因的表达载体及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种黄瓜MADS-box基因CsMADS07过表达载体及其应用。
背景技术
MADS-box基因是一类序列特异的调节基因家族，其名称来源于４种蛋白质因子MCN(酿酒酵母)、AGAMOUS（拟南芥）、DEFICIENS（金鱼草）和SRF（人类）的首字母缩写。这４种蛋白质的Ｎ端具有一个由56-58个氨基酸组成的高度保守区结构域，可识别特异的DNA序列，称为MADS-box结构域，简称Ｍ结构域。MADS-box转录因子通过通过结合特异的DNA顺式元件来调控基因的时空表达。通过染色质免疫共沉淀、凝胶电泳迁移率变动分析和随机结合位点筛选等实验技术，发现许多MADS-box蛋白的DNA结合片段具有核心序列C(A/T)8G，此核心序列称CArG盒。CArG盒常出现在MADS-box蛋白靶标基因的启动子区域，有时也存在于内含子和3'UTR区域。
MADS-box基因广泛存在于真核生物中，几乎遍布整个植物界。在番茄、油菜、烟草和矮牵牛等双子叶植物以及玉米、小麦、高粱等单子叶植物中已经发现大量的MADS-box基因。MADS-box基因最主要的功能是参与花器官的形态建成。同时还涉及植物发育的整个过程，包括参与营养生长的调节、子房和种皮发育、根形成、胚形态建成、共生诱导等，如在拟南芥根中优势表达的AGL17，在营养组织中表达的AGL12、AGL19等。Ohto等发现AP2的过量表达使种子变大，并发现该基因对种子大小的调控是通过控制胚胎细胞的数目和大小实现的。AGL12不仅影响拟南芥的开花时间，还控制着根尖分生组织细胞的增殖。在番茄中分离出一个与其成熟相关的MADS基因LeMADS-RIN，在香蕉中分离出一个在香蕉后熟过程中起重要作用的MuMADS1基因。马铃薯根组织中表达的IbMADS3和在营养器官中表达的IbMADS4，在玉米根和花粉中表达的ZmMADS2。大豆AP3类基因GmNMH7基因属在根瘤以及不同发育时期的花中表达，并且发现它在根瘤中的表达受到光周期的调节。是拟南芥GmAGL15在胚胎发育过程中优势表达。通过转基因使其在大豆中过量表达可促进体细胞胚的发育。耧斗菜的FRUITFULL-like参与叶的发育，胡椒的CaJOINTLESS基因可以抑制茎的分生组织的生长。
黄瓜属葫芦科植物，广泛分布于中国各地，为主要的温室产品之一。最近黄瓜全基因组测序的完成标志着黄瓜功能基因组的研究进入了一个全新的阶段。尽管目前与黄瓜重要经济性状相关的基因正在逐渐被克隆，但关于黄瓜MADS-box基因的报道还较少。黄瓜虽属双子叶植物，但不同于拟南芥，黄瓜有雄花、雌花及两性花三种类型的花，而拟南芥仅为两性花。对相关黄瓜CsMADS基因进行功能的解析具有一定的理论和实践意义。我们首先克隆出CsMADS07基因，连到含双35S启动子的过表达载体PHB上获得过表达载体PHB-CsMADS07，转化拟南芥后发现过量表达CsMADS07基因会使得植株的果荚数目增加、花器官形状改变，利用这一特性可以有效地利用到其它物种上来增加植物的产量和改造花卉的形态。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄瓜CsMADS07基因花特异表达载体及及其在花器官改造中的应用，该载体含有黄瓜MADS-box基因CsMADS07，基因的上游连有双35S启动子。
本发明的上述植物表达载体为PHB-CsMADS07，由下述方法构建而成：
（1）根据CuGI（http://cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/index.jsp）上公布的黄瓜CsMADS07的序列（Csa004120），设计两端引物：
CsMADS07-F：5’-aaaaGGATCCATGGGAAGAGGGAGAGTTCAGCTGAAG-3’
（含BamHI位点）
CsMADS07-R：5’-aaaaGAGCTCTTACCCAAATGATAAAGAAGGGAT-3’
（含SacI位点）。以黄瓜花蕾的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得CsMADS07全长。
（2）回收CsMADS07的cDNA全长，将其连接到pMD18载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-CsMADS07。
（3）使用BamHI和SacI酶切pMD18-CsMADS07，回收CsMADS07片段，同时用BamHI和SacI酶切PHB，回收后连接，转化感受态细胞，获得植物表达载体PHB-CsMADS07。
本发明的另一目的是公开黄瓜CsMADS07在遗传改良中的基因工程应用，该基因导入拟南芥后，获得的CsMADS07转基因植株的果荚数量增加，萼片膨大卷曲、萼片异生出类似柱头状的器官，可以应用在生产实践中改造花卉的形状和提高作物的产量。
附图说明
图1为本发明中CsMADS07全长扩增后的电泳示意图；
图2为本发明表达载体PHB-CsMADS07的BamHI和SacI双酶切电泳检测图；
图3为转基因植株的PCR鉴定图；
图4为过量表达CsMADS07的转基因拟南芥植株的表达分析，其中A为野生型；B-D为转基因植株株系。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。
实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，TRIzoLReagentRNA提取试剂购自invitrogen公司，高保真酶KOD-Plus购于TOYOBO公司，DNaseⅠ购于天根生化科技（北京）有限公司，DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例１：表达载体PHB-CsMADS07的构建
(1)引物设计：根据CuGI（http://cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/index.jsp）上公布的黄瓜CsMADS07的序列（Csa004120），设计两端引物：
CsMADS07-F：5’-aaaaGGATCCATGGGAAGAGGGAGAGTTCAGCTGAAG-3’（含BamHI位点）。
CsMADS07-R：5’-aaaaGAGCTCTTACCCAAATGATAAAGAAGGGAT-3’（含SacI位点）。
（2）黄瓜花蕾总RNA的提取
所用黄瓜品种为华北型黄瓜。取长度约0.7mm的花蕾1mg，取材后立刻冻到液氨中，采用TRIzol（Invitrogen，USA）试剂法提取总RNA：加1.5mlTrizol后，室温放置5min，使其充分裂解。12,000rpm离心5min，弃沉淀。加200ul氯仿，振荡混匀后室温放置15min。4℃12,000g离心15min。吸取上层水相，至另一离心管中。加0.5ml异丙醇，混匀，室温放置30min。4℃12,000g离心10min，弃上清。用1ml75%乙醇洗涤2次沉淀。4℃8,000g离心5min，弃上清。室温晾干10min。用50uLH2O（Rnasefree）溶解RNA。
（3）黄瓜花蕾总cDNA第一链的合成
黄瓜花蕾RNA用DNaseⅠ处理后用于以Oligo(dT)18为引物的反转录：取RNA15uL，加Oligo(dT)181uL，混匀，70℃保温5min，立即冰水浴，稍离心，依次加入10×M-MLVBuffer2uL、dNTP(10mM)1uL、RNasin(40U/uL)1uL、M-MLV(200U/uL)1uL，总体积20uL，混匀，42℃保温60min，95℃10min灭活M-MLV酶活性，-20℃保存。
（4）CsMADS07基因的扩增
以CsMADS07-F和CsMADS07-R为引物，以第一链产物为模板，用长片段、高保真酶KOD-Plus进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s；56℃30s；68℃1.0min，40个循环；68℃5min。PCR产物用1.5%琼脂糖进行电泳检测，扩增片段与预期大小基本一致（图1）。
（5）CsMADS07片段的胶回收
对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，使用胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书对目的片段进行回收。
（6）CsMADS07片段加尾
取1.5ml灭菌的eppendorf管，依次加入回收的PCR产物14μl、10×TaqDNA聚合酶缓冲液2μl、10mMdNTP2μl、TaqDNA聚合酶2μl；72℃处理45min；先加0.18mL无菌水，再加20μl3M醋酸钠，混匀，最后加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀2hr，12,000rpm，4℃离心10min。弃上清，75%乙醇洗涤沉淀2次。DNA晾干后加入20μL无菌水溶解沉淀，溶解的DNA置于-20℃保存备用。
（7）CsMADS07片段的T/A克隆和测序
将回收片段连接到pMD18载体上，其具体步骤为：向1.5ml离心管中分别加入：CsMADS07片段的cDNA5μl、pMD18载体0.5μl、10×T4DNA连接酶缓冲液1μl,T4DNA连接酶1μl，加无菌水至10μl，用封口膜封好；置于16℃连接4-6h。将100μl感受态肠杆菌E.coliDH5α加入连接体系中混匀；混合液冰浴30min，42℃热刺激90s后，冰浴5min；加入800μlLB液体培养基，37℃、200rpm摇床培养45min使菌体复苏；培养结束后，常规3,000rpm离心2min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1ml时，使用移液枪混匀，接入带有Amp抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37℃过夜培养；挑取菌落接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中培养12h，收集菌体，采用质粒抽提试剂盒提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒pMD18-CsMADS07，具体方法为：向0.5ml的离心管中分别加入：质粒DNA（50ng/μl）2μl、BamHI0.5μl、SacI0.5μl、10×buffer（K）1μl，使用无菌水补足20μl；37℃反应4h；然后将酶切正确的重组质粒pMD18-CsMADS07进行测序验证插入基因的正确性。
（8）表达载体PHB-CsMADS07的构建
使用BamHI和SacI对质粒pMD18-CsMADS07和PHB载体进行双酶切，分别获得5’端带有BamHI和3’端带有SacI的CsMADS07片段和PHB载体，电泳后分别进行胶回收，16℃连接4-6h；将100μl感受态肠杆菌E.coliDH5α加入6μl连接体系中混匀；混合液冰浴30min，42℃热刺激90s后，冰浴5min；加入800μlLB液体培养基，37℃、200rpm摇床培养45min使菌体复苏；培养结束后，常规3,000rpm离心1min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1ml时，使用移液枪混匀，接入带有Kan抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37℃过夜培养；挑取菌落接种于LB液体+Kan的培养基，37℃、180rpm培养12h后，提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒PHB-CsMADS07，具体方法为：向0.5ml的离心管中分别加入：质粒DNA（50ng/μl）2μl、BamHI0.5μl、SacI0.5μl、10×buffer（K）1μl，使用无菌水
补足20μl；37℃反应4h；经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测发现，重组质粒PHB-CsMADS07可酶切出预期大小左右的片段（图2）。将酶切正确的重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序进行序列测定（其核苷酸序列如SEQIDNO1所示），，经测序发现，获得的CsMADS07的序列比预测的序列多出42bp，具体位置为SeqNO1的第436-477bp。
实施例2：PHB-CsMADS07转农杆菌GV3101
（1）农杆菌感受态细胞制备
挑取农杆菌GV3101单菌落接种于5mlYEB培养基中，28℃摇培过夜，按1:100的比例接种于50mlYEB培养基中扩培，28℃继续培养约6-7h至OD600=0.4-0.6。将菌液置于冰上30min；5,000rpm，4℃离心5min，弃上清，将菌体悬于10ml0.15MNaCl中；5,000rpm，4℃离心5min，弃上清，菌体用1ml20mMCaCl2，4℃）轻轻悬浮，每管200μl分装，或加入终浓度为20％的无菌甘油，-70℃保存。
（2）农杆菌的转化及鉴定
将10μl质粒DNA加入200μl农杆菌感受态中，混匀，冰浴30min，液氮冷冻3-5min，37℃水浴5min，加入1mlYEB培养基，28℃摇培3-4h。1,0000rpm，室温离心30s，弃上清，加入200μlYEB培养基重悬菌体，涂于YEB培养基上，28℃培养2天；碱裂解法提取农杆菌质粒DNA，酶切验证。质粒再重新转化大肠杆菌（DH5α），过夜培养后，挑取单菌落液体培养，提取质粒DNA，再用酶切鉴定。
实施例3：含PHB-CsMADS07的农杆菌GV3101转化拟南芥
（1）拟南芥的种植
①）所用的拟南芥为Columbia野生型拟南芥，为江西农业大学作物生理生态与遗传育种重点实验室保存。将当年收获的种子种植后4度春化72h，隔年种子种植后春化24h。然后转入人工培养室中在相对湿度80%，恒温20-24℃，光照强度80-200μmol/M2/S，光照周期为8h黑暗﹑16h光照培养。所用的土为3份蛭石，1份珍珠岩和2份黑土混合而成。
②将营养土用塑料盆装好，在托盘里加入营养液，待营养土吸水潮湿后，开始点种。
③将拟南芥的种子放在平铺的纸上，用牙签将拟南芥的种子点在土上。用保鲜膜盖好，暗培养两天，四天后揭掉保鲜膜正常培养。
④土稍干时可再浇一次营养液，以后浇水即可。若要做转化，待抽薹2到3cm时，剪除顶花序，用营养液再浇灌一次。
⑤种子的收集：拟南芥完全成熟后，停止浇水待植株干燥后将拟南芥剪下放在一张干净的光面纸上收集种子，尽量将杂物去干净，便于筛选。
（2）拟南芥的转化和转化子的筛选
①制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10ml，在转化前一天晚上，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液OD600当在1.2到1.6之间。室温5,000rpm离心10min。弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使OD600在0.8左右。
②先将植株上已长出的果荚及开放的花剪掉，再将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株，主要喷洒在花序上。盖上透明的塑料盖子以保持湿度，移入恒温室避光培养，第二天可开盖，正常光照培养。
③一周后再喷洒一次，收种子，在相应的抗性1/2MS平板上筛选转化子。
④转化子的筛选：种子消毒，先用70%乙醇浸泡10min，在上述处理时要不时地使种子悬浮，并换一次70%乙醇。最后用无菌水洗四次。
⑤处理后的种子用Topagar（0.1%琼脂水溶液）均匀涂布在相应的抗性固体筛选培养基表面，每块150mm直径的平皿最多种1500棵。
⑥4℃春化2到3天，移入22℃恒温室培养。将筛选得到的转化子长到合适的大小后移栽到土壤中。
实施例4：转基因植株的鉴定和分析
(1)拟南芥DNA的提取
将适量的经筛选的拟南芥叶片放入1.5ml的离心管中，加入400μl的SDS抽提缓冲液，用蓝色小棒研磨成浆状，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），猛烈摇匀，12,000rpm，离心10min。取上清至新的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3M醋酸钠(PH5.2)，剧烈混匀使DNA成团，放入-20℃沉淀2hr以上。随后12,000rpm，离心10min。弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤一次后室温晾干，加适量的TE或超纯水溶解。
（2）转基因拟南芥植株的鉴定
以抽提的DNA为模板、使用引物CsMADS07-F和CsMADS07-R行PCR扩增CsMADS07片段，PCR的25μl体系为：PCR缓冲液（10×）2.5μl、Taq0.5μl、cDNA模板2μl、10mMdNTP0.5μl、10μMCsMADS07-F和CsMADS07-R引物各1μl、使用无菌水补足25μl。反应条件为：94℃5min，35个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，72℃反应10min。检测结果如图3所示。
（3）转基因拟南芥植株表型分析
通过PCR和RT-PCR的结果，对获得的阳性植物进行观察，获得的CsMADS07转基因植株的顶端的果荚数量增加到2-3个（图4）。
SEQIDNO：1
〈210〉：1
〈211〉:636
〈212〉：DNA
〈213〉：黄瓜（CucumissativusL.）
〈400〉:1
ATGGGAAGAGGGAGAGTTCAGCTGAAGAGAATAGAGAACAAAATCAGCCGCCAAGTCACT60
TTCTCAAAGCGTAGAGCTGGTTTACTCAAAAAGGCTCATGAGATCTCTGTTCTTTGTGAA120
GCTGATGTTGCTTTGATTGTTTTCTCCACCAAAGGAAAACTCTTTGAGTACTCTTCTGAT180
TCCAGCATGGAGAAGATCTTAGAGAAATATGAGAGATATTCTTATGCAGAGAGACCGTTG240
GCCCCAAATGGAGATTCTGAATTACAGACAAGTTGGTGTCAGGAGTATCCAAAACTTACA300
GCCAGATTGGAAATTGTACAGAAAAACTTAAGGCATTATTTGGGAGAAGATCTTGACCCT360
TTGAATTTGAGAGAACTTCAAAGCTTAGAGCAACAACTTGACACATCACTCAAGCGCATA420
AGATCTAGAAAGAACCAACTAATGCAAGAATCTATTTCAATATTGCACAAAAAGGAAAAG480
GACTTGCAAGAGGAGAATAGGCAGCTAGCGAATAAGGTAAAGGAAAATGAGAAGGCTTTG540
GTTGAACGTGGACAGTGCGATGTTCCAAACTTGGTTCATAATAATCAGCCAATTTTTGGA600
ATGACACCACCAATCCCTTCTTTATCATTTGGGTAA636

Claims (2)

1.具有CsMADS07基因的表达载体，其特征在于：该表达载体含有黄瓜CsMADS07的编码区全长、双35启动子，所述CsMADS07基因的核苷酸序列如SEQIDNO1所示。
2.权利要求1所述具有CsMADS07基因的表达载体的应用，其特征在于，所述表达载体用于拟南芥花器官改变及增加果荚数量。
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